土木香内生真菌YIGZ-3抗菌活性及菌种鉴定

土木香内生真菌YIGZ-3抗菌活性及菌种鉴定
阿塞木古丽·热音拜克;吾鲁木汗·那孜尔别克;恩特马克·布拉提白
【摘要】采用组织分离法从药用植物土木香根、茎和叶片中分离出32株内生真菌,通过纸片扩散法测定20株土木香内生真菌,筛选出1株具有较强抑菌活性的菌株,命名为YIGZ-3.用薄层层析法(TLC)法和高效液相色谱法(HPLC)法检测其发酵液中的土木香内脂,通过形态学特征观察和rRNA基因内转录间隔区(ITS)序列分析对菌株进行鉴定.结果显示:菌株YIGZ-3对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌均有较强的抑菌活性,其发酵液中检测到与土木香内脂相似的化合物,根据真菌形态特征和ITS序列同源性鉴定表明菌株YIGZ-3为塔宾曲霉菌(Aspergillus tubingensis).
【期刊名称】《吉首大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2017(038)005
【总页数】6页(P71-76)
【关键词】土木香;内生真菌;抑菌活性;土木香内酯;鉴定
【作者】阿塞木古丽·热音拜克;吾鲁木汗·那孜尔别克;恩特马克·布拉提白
【作者单位】吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000;伊犁师范学院生物与地理科学学院,新疆伊宁835000;伊犁师范学院生物与地理科学学院,新疆伊宁835000
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
植物内生真菌(Endophyte fungus)是指在植物宿主中度过部分或全部生活周期而
不使宿主植物表现明显病理症状的一类真菌.[1]根据Strobel提出的“内共生理论”，内生真菌除了可产生与宿主植物次生代谢产物相同或者相似的物质外，还可以产生其他的活性物质，它们对宿主植物生长发育、对外界环境的应激耐受性、有效活性成分的产生与积累等方面有重要影响[2].1993年Stierle等[3]从短叶红豆杉的韧皮部分离得到一株产紫杉醇的内生真菌安德氏紫衫霉(Taxomyces andreanae)后，国内外学者从多种药用植物中陆续分离得到产活性物质的内生真菌[4-5].因此，药用植物内生真菌已成为活性天然产物的重要资源.
土木香(Inula helenium L.)属于菊科旋覆花属的多年生草本植物，主要分布于河南、河北、浙江、四川、山西、陕西、甘肃及新疆等地.土木香具有健脾和胃、调气解郁、止痛安胎的功能，临床常用于治疗脘腹胀痛、呕吐泻痢、胸胁挫伤、岔气作痛、胎动不安等症状.[6]土木香中主要的化学成分是倍半萜内酯类，包括土木香内酯、
异土木香内酯、土木香醇、土木香酸、二氢土木香内酯等，其中含量较高的为土木香内酯和异土木香内酯[7-8].研究结果证实土木香内酯和异土木香内酯具有抑制肿瘤、驱虫、抗菌、抑制平滑肌、降血糖和利胆等作用[9-11]，土木香的乙醇提取物还具有镇痛作用[12].按照“内共生理论”推测土木香内生真菌也可能产生具有类
似活性的次生代谢产物.为此，本课题组深入挖掘了土木香内生真菌资源，发现了
具有较强抑菌活性的菌株YIGZ-3.本试验对菌株YIGZ-3发酵液的抑菌活性进行评价，检测其代谢产物并对菌株进行鉴定，旨在筛选出能产生土木香内酯的内生真菌，为发酵生产土木香内酯及土木香的综合开发奠定基础.
1.1 材料
1.1.1 菌株内生真菌YIGZ-3分离自新疆伊犁尼勒克县唐布拉草原野生土木香根部，15%甘油管置于-80 ℃冰箱保存.大肠杆菌CGMCC1.1103、枯草芽胞杆菌CGMCC1.769、金黄色葡萄球菌CGMCC1.8721和白色念球菌ATCC10123均由
伊犁师范学院微生物资源保护与开发利用重点实验室保存.
1.1.2 试剂与培养基薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)；乙晴(天津市福晨化学试剂厂)；土木香内酯对照品(上海原叶生物科技有限公司)；真菌基因组提取试剂盒、PCR试剂和DNA marker(大连宝生物工程公司).PCR引物由上海生工生物工程股
份有限公司合成；牛肉膏蛋白胨培养基用于指示菌的培养；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基用于真菌的活化和培养.
1.1.3 仪器设备 UltiMate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；IKA-RV10旋转蒸发仪(德国IKA集团/艾卡广州仪器设备有限公司)；KQ5200DE超声
波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AG22351梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；NIKON801荧光正置显微镜(日本三洋科研医疗设备厂)；GelDoc-It TS2凝
胶成像分析系统(北京赛百奥科技有限公司).
1.2 方法
1.2.1 真菌发酵液的制备将菌株YIGZ-3接种于PDA固体液体培养基中28 ℃活化6 d后，转接至50 mL的PDB液体培养基中28 ℃、180 r/min摇床培养7 d.发
酵液经9 000 r/min离心15 min，取上清备用.
1.2.2 指示菌制备将大肠杆菌，枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中37 ℃恒温箱培养24 h，将白色念球菌接种于PDB液体培养基28 ℃培养48 h，经离心收集菌体后，将菌体悬浮于5 mL的生理盐水制备菌悬液.
1.2.3 抑菌活性测定采用纸片扩散法测定土木香内生真菌YIGZ-3发酵液的抑菌活性.用生理盐水分别对各指示菌菌悬液进行梯度稀释，稀释至约1 × 106 CFU/mL.取100 μL指示菌菌液接种涂抹于PDA固体培养基上，用无菌玻璃环充分涂布后，在适当位置贴上已灭菌的滤纸片(φ=5 mm)，然后吸取发酵上清液20 μL点在滤
纸片上，同时以发酵培养基作阴性对照.将带有白色念球菌的平板置28 ℃恒温培养
箱培养24 h，其余带菌平板置37 ℃恒温培养箱培养24 h.平行试验重复3次，十字交叉法测量抑菌圈直径.
1.2.4 标准对照品的制备精密称取1 mg土木香内酯标准品，加甲醇溶剂定容至
10 mL，摇匀，得土木香内酯质量浓度为100 mg/L的标准对照品溶液.
1.2.5 土木香内酯的提取将菌株YIGZ-3接种于PDB液体培养基中，28 ℃，180
r/min摇床培养7 d后过滤.取过滤后的发酵液50 mL用旋转蒸发仪浓缩挥干，加甲醇少量，再移入10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，超声波处理45 min，9 000 r/min离心15 min，收集上清，用0.45 μm的过滤器过滤，作供试品溶液.
同时将菌株YIGZ-3菌丝体在60℃干燥箱中烘干至恒重，研磨成粉末.称取菌丝体
粉末2.0 g，加甲醇溶剂定容至50 mL，超声处理45 min，9 000 r/min离心15 min，收集上清，用0.45 μm过滤器过滤，作供试品溶液.
1.2.6 土木香内酯的TLC检测吸取上述供试品溶液、标准品溶液分别点样于薄层
硅胶板上，石油醚-苯-乙酸乙酯(15∶2∶2)为展开剂展开，置层析缸内，待溶剂前沿到达距薄层板上端1～2 cm时取出，然后迅速晾干，把薄层硅胶板放入5%硫
酸-乙醇显色液中，110℃显色.比较供试品与标准对照品斑点的颜色、位置及其Rf 值，可初步筛选出产土木香内酯的菌株.
1.2.7 土木香内酯的HPLC检测色谱柱Hypersil GoldTMRP18 4.6 nm×150 nm，5 μm保护柱；流动相乙腈和0.1%磷酸水溶液(体积比60∶40)；流动相流速1.0 mL/min；检测波长194 nm；柱温30 ℃；进样体积20 μL.通过高效液相色谱检
测可确定菌株YIGZ-3能否产土木香内酯.
1.2.8 真菌形态学观察采用真菌插片培养法对菌株YIGZ-3的菌落、菌丝体和孢子等特征进行显微镜观察，参照文献[13]和文献[14]进行鉴定.
1.2.9 rRNA基因ITS序列测定及分析用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株YIGZ-3的基因组DNA.用通用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)
和ITS4(5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3′)经PCR从菌株YIGZ-3基因组DNA
中扩增出ITS序列.PCR反应体积50 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min.PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程有限公司完成测序.依据测序结果，在NCBI数据库中用Blast软件进行菌株rRNA基因ITS序列对比.选取相似性较高菌株序列，用ClastalX和MEGA4.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析系统进化树构建，拓扑结构分析采用1 000次重复取样.
2.1 菌株YIGZ-3抑菌活性
抑菌试验结果显示，菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的抑菌圈直径分别为18.3，6.32，7.21，19.4 mm(图1).表明
菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌和白色念球菌有较强的抑菌活性，但对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性较弱.
2.2 菌株YIGZ-3次生代谢产物的TLC检测
TLC检测结果显示，用硫酸-乙醇显色液显色后，在菌株YIGZ-3发酵液、菌丝体
甲醇提取液中出现与土木香内酯标准品颜色和Rf值相同的蓝色斑点(图2)，初步
确定菌株YIGZ-3可能产生土木香内酯，而菌株YIGZ-3菌丝体甲醇提取液中还出现2～3个未知的化合物(斑点).
2.3 菌株YIGZ-3次生代谢产物的HPLC检测
HPLC检测显示，土木香内酯标准品在11.6 min出现峰值.菌株YIGZ-3发酵液和
菌丝体提取液以及土木香根提取液与标准品在相同的时间处出现相同的吸收峰(图3).结合TLC检测结果，可确定菌株YIGZ-3的发酵液和菌丝体提取液中均含有土
木香内酯.
2.4 菌株YIGZ-3的形态学学鉴定
菌落特征：菌株YIGZ-3菌落在28 ℃培养基上7天后，其菌落的直径可达到
40～45 mm，菌落颜色从起初的黄色随着时间渐渐变为黑白圈状(图4)，而菌落
反面呈黄色(图4).显微镜观察结果显示，菌株YIGZ-3的气生菌丝较分散，菌丝分枝，长稍弯曲，有些像树枝，分生孢子呈球状.菌株YIGZ-3菌落、菌丝体和分生
孢子的形态特征相似于曲霉菌属.
2.5 菌株YIGZ-3的分子生物学鉴定
琼脂糖凝胶电泳结果显示，通过PCR从菌株YIGZ-3基因组DNA中扩增出大小约为550 bp的DNA条带(图5)，与预期值相符.DNA测序结果表明，菌株YIGZ-3
的ITS序列大小为577 bp，其GenBank登录号为KY552623.将测定的核苷酸序列与GenBank中的已知序列进行Blast比对分析，结果显示，菌株YIGZ-3与Aspergillus tubingensis strain GX1-5E(登录号GU595290)ITS序列的相似性为99%.由菌株YIGZ-3的ITS序列与其他种属菌种的相应序列构建系统进化树(图6)，结果显示菌株YIGZ-3与Aspergillus是同一个属.结合形态学分类结果，将菌株YIGZ-3鉴定为曲霉菌属有效发表种Aspergillus tubingensis的一个菌株.
土木香是我国传统的中药，其主要成分土木香内酯和异土木香内酯是常用抗菌药物，并具有抑制肿瘤、驱虫、抗菌、抑制平滑肌、降血糖、利胆和镇痛等药理作用，在临床上用量很大.但土木香生长周期长、产量低，因盲目开采，导致大部分野生土
木香处于濒危或渐危状态，人们试图通过其他途径获得土木香的有效成分土木香内酯和异土木香内酯，但目前有关土木香内生真菌的研究国内外尚未见报道.为此，
本课题组采用组织分离法从药用植物土木香根部分离得到32株菌落形态特征有差异的内生真菌，其中菌株YIGZ-3具有较强抑菌活性.
本研究采用纸片扩散法测定菌株YIGZ-3发酵液对4种指示菌的抑菌活性，运用TLC和HPLC检测菌株YIGZ-3次生代谢产物中的土木香内酯，并对其进行形态学和分子生物学鉴定.抑菌试验结果显示，菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌和白色念
球菌有较好的抑菌作用，但对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用较弱，表明菌株YIGZ-3发酵液对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌抑菌活性可能有一定的差异.通过TLC和HPLC从菌株YIGZ-3发酵液和菌丝体提取液中检测到类似于土木香内酯的次生代谢物，表明该菌株可能合成与宿主植物土木香相似的土木香内酯.采用形态学和分子生物学相结合的方法将菌株YIGZ-3鉴定为塔宾曲霉菌(Aspergillus tubingensis).本研究结果为发酵生产土木香内酯及土木香的综合利用提供了科学依据，同时也为药用植物内生菌的研究提供了新资料.此外，本研究是定向筛选能产生土木香内酯的真菌，此过程容易导致其他重要的有效成分，如异土木香内酯、土木香醇和土木香酸等成分不能被发现，因此，还需要研究来探索土木香内生真菌是否还产生其他有益的活性成分.
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