无菌检查法试验具体操作方法PPT课件

四、具体检测方法
❖ 薄膜过滤法:
❖ 采用全封闭式薄膜过滤器，薄膜孔径不大于0.45um， 膜直径约47mm.
❖ 取规定抽验供试品数，（如供试品少于10ml，则先加 入100ml0.9%,无菌氯化钠溶液或适宜的无菌溶剂）， 立即在无菌条件下导入无菌薄膜过滤器内，加压或减 压过滤。
❖ 含汞类等防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9% 无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次， 每次100ml，过滤后，两个滤器中加硫乙醇盐流体培 养基各100ml，另一个滤器加改良马丁培养基100ml。
支
移种前剩余培养基及移种后的培养基 分别培养21天，（36℃±1）。每隔3天观察一次
四、具体检测方法
❖ 一旦支原体污染：
㈠一律废弃重新培养。 ㈡对于具有重要价值的细胞株，
有必要清除支原体的，常用方法有： ①抗生素处理 ②抗血清处理： ③抗生素加抗血清和补体联合处理
四、具体检测方法
❖ 支原体最突出的结构特征是没有细胞壁， ①对作用于细胞壁生物合成的抗生素：如 -内酰胺类、
三、无菌操作要求及注意事项
4.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留 在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有 害物带入培养基中。 开启、关闭供试品时，火焰灭菌时间要短，防止因 温度过高灭活供试品。 另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有 毒气体，危害供试品。
5.进行试验时，吸管抽取供试品后，要与培养基试管 平行且垂直，动作要准确敏捷，但又不必太快，以 防空气流动，增加污染机会。
二、试验物品准备：
❖ 2、灭菌物品的确认： 高压根据试验要求，准备所需器材和物品。需在灭菌 物品盒标注名称，并填写灭菌日期，清点无误后将 其送至灭菌前间。 灭菌是无菌物品生产的重要环节，根据物品的性能选 择合适的灭菌方式，是确保试验质量的关键。 我们通常把玻璃器皿包括吸管瓶子选择180℃2小时干 热灭菌，胶栓121℃60分钟灭菌，取回灭菌物品时， 一定要在有效期内使用，试验前确认指示剂是否合 格及包装的完整性，干燥性，合格后方可使用。
四、具体检测方法
❖ 无菌试验样品取样标准： ❖ 2.成品：
每亚批均应进行无菌检查，供试品应随时抽取，包括 分装过程中的前、中、后抽样。 ①分装量在100支（瓶）或100支（瓶）以下者抽验量不 少于5支。 ②101-500支（瓶）者抽验量不少于10支（瓶）。 ③500支（瓶）以上者抽验量不少于20支（瓶）。
三、无菌操作要求及注意事项
在操作中为最大可能的保证无菌。 每一项工作都必须做到有条不紊。
三、无菌操作要求及注意事项
❖操作
1.在开试验前要制定好实验计划和操作程序。 有关数据的计算要事先做好。 准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放 置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消 毒。 这可以避免开始实验后，因物品不全，往返拿 取而增加污染机会。
万古霉素等完全不敏感； ②对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。 ③对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗
的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺 酮； ④其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有 较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的 化学治疗剂。
四、具体检测方法
增菌法、直接法 薄膜过滤法
30-35℃
20-25℃
30-35℃
20-25℃
硫乙醇酸盐
培养基
1
营养琼脂
培养基
1
改良马丁
培养基
0
1
1
1
1
-------- --------
2
O
2
无菌试验的培养基加入样品后，全部采取静止培养，整 个培养过程不许摇晃。同时以0.9%的无菌氯化钠溶液代 替供式品,同法操作做阴性对照.培养时间不得少于14天。
二、试验物品准备：
❖ 物品摆放整齐的准备间：
二、试验物品准备：
❖ 工作人员在控制高压温度：
三、无菌操作要求及注意事项
环境
三大要素
操作
人员
三、无菌操作要求及注意事项
❖环境：
1.无菌操作应在环境洁净度 10000级和局部洁净度100级 的单向流空气区域内或隔离 系统中进行，其全过程必须 严格遵守无菌操作，防止微 生物污染。
❖ 合格的培养基应保存在2-25℃并防止被污染, ❖ 使用期限不得超过3周.
无菌试验对培养基的质量要求高，应选用完全透明无 沉淀的培养基，确认检查合格后放入试管架中，置操 作间，方可使用。
二、试验物品准备
❖在选取培养基时，放于眼 前细致观察（包括PH值，装 量是否一致、试管有无裂痕） ❖因培养基在搬运过程中， 容易造成个别试管胶栓松动， 从而影响PH值的细微变化。 ❖如不细致察看，在试验中 会存有很大的隐患，影响结 果的判定。
三、无菌操作要求及注意事项
6.吸取营养液、 氯化钠等及各种用液时，均应分别使 用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致交叉污染。 手或拿取物品时不能经过打开的瓶口上方，加液时 如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管废弃。
7.不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧 灼消毒或取备品更换。工作由始至终要保持一定顺 序性。供试品在未使用之前，用煤气灯先把试管架 上的培养基胶栓及试管口处烧灼一下，勿过早暴露 在空气中。同样，培养基在未用前，不要过早开栓 用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口，直立 可增加落菌机会。
四、具体检测方法
❖直接法:
不含防腐剂供试品，不需增菌培养. ❖ 按成品抽样量及抽验瓶数的要求将每批（或亚批）
抽检的供试品逐瓶（支）取样混合: 装量在5.0ml或5.0ml以下者每10瓶（安装）混合，装 量在5.0ml以上者，每7瓶（安装）混合， ❖ 应接种培养基管数依供试品混合总量而定。 ❖ 混合后的供试品接种量按不超过培养基体积10% （ml/ml）直接接种于硫乙醇盐酸流体培养基，营养 琼脂斜面及改良马丁培养基，三种培养基接种支数 之比为1：1：1。
❖ 支原体半流体培养基与支原体肉汤培养基加入灭 能小牛血清（培养基：血清为8：2）
四、具体检测方法
支原体半流体培养基（4支）
第7天，取2支
一支
一支
支原体肉汤培养基（4支）
第7天，取2支
一支
一支
2 2 2 2
2 2 2 2
半 流肉 体汤 支支
半 流肉 体汤 支支
半 流 体
肉 汤
半 流 体
肉 汤
支
支
支
四、具体检测方法
95％以上 是以下四种支原体
口腔支原体
精氨酸支原体
猪鼻支原体
莱氏无胆甾原体
为牛源性
四、具体检测方法
❖ 支原体检测：
❖ 支原体因病毒类疫苗类中所用的牛血清可能 被感染支原体，所以生产所收获病毒收获液 都要做支原体检测。
❖ 使用培养基为流体和半流体培养基。
四、具体检测方法
被污染细胞造成 的交叉污染
四、具体检测方法
检测方法
无
支
菌 试 验
原 体 检 测
四、具体检测方法
硫乙醇酸盐流体培养基 用于培养需氧菌/厌氧菌 改良马丁培养基 用于培养真菌
无 菌 试 验 培
营养琼脂培养基 用于培养需氧菌
养 基
四、具体检测方法
❖ 无菌试验样品取样标准： ❖ 1.原液及半成品：
抽检量应至少为0.1%，但不得少于10ml，如原液及半 成品除菌过滤后，分别于多个容器内，则每个容器抽 检量不得少于10ml，原液及半成品每开瓶一次，应如 上法抽检。
❖ 无菌检查在生产检定中是很重要的一个检项，如果 出现差错会有很大的隐患，近年注册申报资料中无 菌检查法验证的内容确实在日渐完整和规范。
❖ 2005年版《中国药典》无菌检查法增加了方法验证 的内容，增加了试验的可操作性，方法更具有科学 性，提高检出率。保证检验结果的准确性。
二、试验物品准备
❖ 1、培养基数量及选用： 首先要确认本次试验供试品所需培养基的数量。 在此基础，要多加一套相同的培养基做阴性对照。
❖ 对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 ❖ 通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。
四、具体检测方法
❖ 细胞培养（染发生率达到63%，国 内外研究表明，大约有二十多种支原体能污染 细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支 原体。
三、无菌操作要求及注意事项
❖人员：
无菌试验操作进入万级 操作间时，操作人员 必须着装整齐，穿好 已灭菌的三更服装。 需带两层口罩，一层是 白纱布，最后一层随 三更服已灭菌的口罩。 方可进入无菌室进行操 作。
三、无菌操作要求及注意事项 ❖操作
即便使用设备完善的实验室。 技术操作不规范,也会导致污染.
2.工作台面及操作室环境应 定期按《医药工业洁净室 （区）悬浮粒子、浮游菌和 沉降菌的测试方法》的进行 洁净度验证。
三、无菌操作要求及注意事项
3.无菌操作室每天都要用0.1%的新洁尔灭或来苏水清 洁剂，清洁―次(抹布要专用).紫外线照射消毒3050min； 超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后 紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将供试品 和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用 品不要过多或重叠放置，否则会遮挡紫外线，降低 消毒效果。
四、具体检测方法
供试品复检 ❖ 无菌试验如经确认无效，应重试。
重试时，重新取同量供试品，依法重试， 如无菌生长，判供试品符合规定 ， 如有菌生长，判供试品不符合规定。
四、具体检测方法
❖ 支原体：
❖ 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径 0．2um)并独立生活的微生物 .
❖ 多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6-8．0)， 对酸耐受性差。
无菌试验具体
操作方法
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实际应用及注意事项
分类
概述 试验物品准备 无菌操作的要求及注意事项 具体检测方法
讨论
一、概述
❖ 无菌检查法系用于确定要求无菌的生物制品、原料、 辅料及要求无菌的其他品种是否无菌的一种办法。
❖ 若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明供试品在 该检验条件下未发现微生物污染。
工作环境的污染
实验器材的污 染
培养基的污染
支原体 污染源
操作者本身的污染 某些支原体在人体 是正常菌群
制备细胞的原始组织 或器官的污染
四、具体检测方法
❖ 图为GHK细胞
当支原体污染后，因为它们不 会使细胞死亡可以与细胞长期 共存，培养基一般不发生浑浊， 细胞无明显变化，外观上给人 以正常感觉。
实则细胞受到多方面潜在影响， 如引起细胞变形，抑制细胞生 长等。
四、具体检测方法
当满足下列至少一个条件时，判实验结果无效： ❖ 对无菌检查相关设施的微生物监控数据表明其不符合
其规定； ❖ 对无菌检查过程的回顾，揭示了本操作程序是错误的； ❖ 阴性对照管有菌生长； ❖ 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长
是因无菌检查中使用的物品和无菌操作技术不当引起 的；
四、具体检测方法
无菌试验结果判定： 对每一试管逐一进行验证，PH是否有变化有无菌落生 长，应完全透明无沉淀。
❖ 1.硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基均为澄 清，营养琼脂斜面未见菌生长，判供式品符合规定。
❖ 2.如硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营 养琼脂斜面中任何一管有菌生长，并证明生长的微 生物为供试品含有，判定供式品不符合规定。
四、具体检测方法
无菌试验检测方法
1
2
3
增菌法
直接法 薄膜过滤法
四、具体检测方法
❖增菌法：
含防腐剂的供试品，应先增菌培养. ❖ 按种量与培养基的比例：
用苯酚或三氯甲烷作防腐剂者至少为1:20， 用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛，抗生素者至少为 1:50. ❖ 将混合供试品先按此比例接种于硫乙醇酸盐流体培 养基（不得少于200ml）内增菌，于20-25℃培养3天 后移种至硫乙醇酸盐流体培养基，营养琼脂斜面， 改良马丁培养基各2管，每管10ml，培养基接种0.5ml。
三、无菌操作要求及注意事项
2.在无菌环境进行试验时，操作人员要确定好自己所 工作的位置，操作前戴手套，酒精棉进行消毒。
3.点燃煤气灯后。用火焰先把试管架上的培养基胶栓 与试管口处烧灼一下，以后一切操作，如打开或封 闭瓶口时，都需在火焰近处并经过烧灼进行。
但要注意：金属器械不能在火焰中烧的时间过长， 烧过的金属镊要待冷却后方可使用。
最为致命的是，即使存在很严
重的支原体污染，细胞外观可 无明显变化。如果继续使用这 种已被支原体污染，而貌似正 常的细胞做实验，将会严重影 响实验结果。
四、具体检测方法
❖ 支原体检测步骤：
❖ 供试品如在分装后，24小时以内进行支原体检查 可储存于2-8℃，超过24小时应置-20℃以下储存。
❖ 支原体半流体培养基使用前煮沸10-15分钟，冷却 至56℃左右备用。