2病毒(微生物).
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培养皿内倒入10ml琼脂培养基
凝固成平板后，恒温箱中烘干水份 取2～3滴宿主菌与0.1ml噬菌体混匀 铺满整个琼脂平板 凝固后于恒温箱倒置培养 一定时间后，取出计数
40
3.5 病毒的抵抗力
3.5.1 病毒对物理因素的抵抗力
温度： 不耐热 — 大多数在55～65℃范围内，不到1h被灭 活。 耐冰冻 — 实验室用干冰(－ 70℃)或冰箱(－20℃， +4℃)或液氮(－196 ℃)保存病毒。 注：低温不会 灭活病毒 高温使病毒的核酸和蛋白质均受损伤，但灭活蛋 白质更快；蛋白质变性阻碍了病毒吸附在宿主细胞 上，削弱其感染力。 41
32
3.4 病毒的培养
3.4.1 病毒的培养特征 液体培养基 琼脂固体培养基
接种敏感细菌
培养基浑浊
接种噬菌体
菌悬液变透明
接种敏感细菌 形成多个菌落 接种噬菌体 菌落成为空斑(噬空 斑)
33
3.4.2 病毒的培养基
病毒专性寄生在活的敏感细胞内才能繁殖。
对敏感细胞的要求：
必须是活的敏感动物或其组织细胞
特点
形体小，大小在0. 2μm以下 无核糖体和酶系统 不具有独立的代谢能力 专性寄生在活的敏感宿主体内 在体外可以无生命状态 繁殖方式：复制＋装配
3
3.1 病毒的一般特征及其分类
3.1.2 病毒的分类
根据病毒不同的专性宿主，可把病毒分为： 动物病毒、 植物病毒、细菌病毒（噬菌体）、放线菌病毒（噬放 线菌体）、藻类病毒（噬犬 病 毒 子 弹 形 病 毒
9
T4 噬 菌 体 蝌 蚪 形 病 毒
10
流 行 性 感 冒 病 毒 丝 状 有 被 膜 的 病 毒
11
病 毒
SARS
12
“非典型肺炎”元凶冠状病毒 SARS
13
“非典型肺炎”元凶冠状病毒 SARS
14
3.2 病毒的形态和结构
3.2.1 病毒的形态和大小 最大：痘病毒 动物病毒 100nm×200nm×300nm 最小：口蹄疫病毒 d＝22nm 大小 最大：马铃薯Y病毒 植物病毒 750nm×12nm 最小：南瓜花叶病毒 22nm 大肠杆菌噬菌体 f2 d=25nm
DNA病毒
根据核酸分类 RNA病毒
4
3.2 病毒的形态和结构
3.2.1 病毒的形态和大小 动物病毒：球形、卵圆形、砖形 形态 植物病毒：杆状、丝状、球状 噬菌体：蝌蚪状、丝状
5
脊 髓 灰 质 炎 病 毒 球 形 病 毒
6
烟 草 花 叶 病 毒 线 形 病 毒
7
痘 病 毒 砖 形 病 毒
能提供病毒附着的受体 其内部无破坏特异性病毒的限制性核酸内切酶
34
3.4.2 病毒的培养基
1.脊椎动物病毒的培养基 a 人胚组织细胞（肌肉等的细胞） b 人组织细胞（扁桃体等） c 人肿瘤细胞（上皮癌细胞） d 动物组织细胞及胚细胞（猴肾细胞等） e 敏感动物（兔） 2. 植物病毒的培养基 与之相适应的敏感植株和植物组织 3. 噬菌体的培养基 与之相应的敏感细菌
蛋白质衣壳
核酸
被膜
20
立体对称型，疱疹病毒
病毒的构型 螺旋对称型，狂犬病毒 复合对称型，大肠杆菌T系噬菌体
21
大肠杆菌噬菌体结构
22
3.3 病毒的繁殖
3.3.1 病毒的繁殖过程
吸附 侵入 复制 装配 释放 吸附：噬菌体以尾部末端吸附到敏感细 胞表面的某一特定化学成分—受体 侵入
动物病毒：借助细胞吞噬和胞饮作用 植物病毒：通过植物伤口或昆虫口器 噬菌体：侵入方式最为复杂
15
16
3.2.2 病毒的化学组成和结构
3.2.2.1 病毒的化学组成
病毒粒子是指结构和功能完整的病毒颗粒，
主要由蛋白质和核酸组成。
有些病毒具有被膜（囊膜），其中还含 有类脂质（磷脂、胆固醇等）
17
蛋白质：不同的病毒其氨基酸的含量和组成不同 保护病毒不受外界条件的影响(保护作用) 蛋白质功能 决定病毒感染的特异性
具有致病性、毒力和抗原性
18
3.2.2.1 病毒的化学组成
核酸：决定病毒遗传、变异和对敏感宿主细胞的
感染力
动物病毒：含DNA或RNA 植物病毒：大多数含RNA，少数含DNA 噬菌体：大多数含DNA，少数含RNA
一个病毒粒子不同时含有DNA和RNA
19
3.2.2.2 病毒的结构
核衣壳 病毒粒子
吸附
侵入
病毒大分 子合成
装配
释放
28
3.3.2.1 噬菌体分类 1. 毒（烈）性噬菌体：侵入细胞后，随即引 起宿主细胞的裂解。
2. 温和噬菌体：侵入后，其核酸附着并整合 在染色体上，和宿主的核酸同步复制，宿主 细胞不裂解而继续生长。
30
3.3.2 病毒的溶原性（lysogeny）
3.3.2.2 溶原性 溶原细胞：含有温和噬菌体核酸的宿主细胞。
洗去胰酶，吹散细胞并计数
加生长液，分装
保持37℃，培养2～3d即可
37
病毒样品的采集与制备
固体病毒样品：用液体培养基制成悬液，离心， 去杂质，取其上清液备用。 液体病毒样品：直接离心，去杂质，取上清液。 空气病毒样品：真空泵抽取至长有宿主菌的平 板上，或将长有宿主菌的平板暴露于空气。
38
动物病毒的接种与观察
第三章 非细胞结构的超微生物—病毒
1
由于病毒特殊的结构和形态及其生活习 性，按照六界学说，把病毒列为单独的 一个界，即病毒界。病毒个体极小 （<0.2µ），只有在电子显微镜下才能 看见病毒的庐山真面目，而且病毒不具 有细胞结构。
2
3.1 病毒的一般特征及其分类
3.1.1 病毒的特点
病毒（Virus）是没有细胞结构，专性寄生在活的敏感 宿主体内，可通过细菌过滤器，大小在0.2μm以下的超微 小生物。
35
3.4.3 病毒的培养
1.动物病毒的空斑试验
用平衡盐洗涤经培养24～48h的单层细胞 接种病毒样品，37℃恒温箱中吸附1h 加营养琼脂培养基覆盖，置37℃恒温箱中培养24h 加0.2％中性红继续培养，出现空斑
取出计数
36
单层细胞的制备和培养
0.5～1mm3动物组织小块 平衡盐洗涤数次
加5％胰酶消化10～15min
光及辐射 紫外辐射( 灭活部位是病毒的核酸，使核酸中的嘧 啶环受到影响。)
X射线等离子辐射均有灭活病毒的作用。
干燥（RNA） 相对湿度高存活好，相对湿度低灭活好（无被膜） ，有 被膜则相反
42
3.5.2 病毒对化学因素的抵抗力
pH 6.0~8.0 ：稳定， pH 5以下或pH 9以上：迅速失活；
原（前）噬菌体：指溶原细胞内的温和噬菌 体核酸。 溶原性：是遗传特性，原噬菌体随宿主细胞 分裂传给子代细胞，故子代细胞也是具有溶 原性的，是溶原细胞。
31
3.3.2 病毒的溶原性（lysogeny）
3.3.2.3 溶原性噬菌体的命名
Escherichia
属名(大肠杆菌)
coli
K12(λ) 种名 株名 溶原性噬菌体
1.破坏病毒蛋白质的化学物质
酚、低渗缓冲溶液环境
2.破坏核酸的化学物质 甲醛，亚硝酸，氨
3.影响病毒脂类被膜的化学物质 醚，十二烷基硫酸钠，氯仿等
43
病毒的存活和在污水处理中的去除效果 环境中存在的各种因子会影响到病毒的生存，所以 病毒在各种不同环境中的存活时间是不一样的。 污水处理的不同程度，对病毒的去除效果也是不同 的。 一级处理：很低，最多30% 二级处理：90-99% 三级处理：滴度常用对数值下降4～6
23
胞饮作用
吞噬作用
24
噬菌体的侵入
噬菌体T4吸附在大肠杆菌细胞 (a) 未吸附 ，(b)(c) 尾部附着 ，(d) 尾鞘收缩，DNA注入
25
复制与装配
噬菌体借助宿主细胞的 合成机构，按其携带的遗 传信息复制核酸，进而合 成噬菌体的蛋白质，核酸 和蛋白质聚集合成新的噬 菌体。
26
释放
27
放置病毒悬液→病毒吸附→注入软琼脂→空斑
空斑 — 是原代或传代单层细胞被病毒感染后，一个个 细胞被病毒蚀空形成的空斑(蚀斑)。 — 病毒空斑单位(plague formation unit)
病毒数的计算
PFU
n瓶内空斑平均数 病毒稀释度 每瓶的病毒接种量
39
2. 噬菌体的分离培养 — 双层琼脂法
44
凝固成平板后，恒温箱中烘干水份 取2～3滴宿主菌与0.1ml噬菌体混匀 铺满整个琼脂平板 凝固后于恒温箱倒置培养 一定时间后，取出计数
40
3.5 病毒的抵抗力
3.5.1 病毒对物理因素的抵抗力
温度： 不耐热 — 大多数在55～65℃范围内，不到1h被灭 活。 耐冰冻 — 实验室用干冰(－ 70℃)或冰箱(－20℃， +4℃)或液氮(－196 ℃)保存病毒。 注：低温不会 灭活病毒 高温使病毒的核酸和蛋白质均受损伤，但灭活蛋 白质更快；蛋白质变性阻碍了病毒吸附在宿主细胞 上，削弱其感染力。 41
32
3.4 病毒的培养
3.4.1 病毒的培养特征 液体培养基 琼脂固体培养基
接种敏感细菌
培养基浑浊
接种噬菌体
菌悬液变透明
接种敏感细菌 形成多个菌落 接种噬菌体 菌落成为空斑(噬空 斑)
33
3.4.2 病毒的培养基
病毒专性寄生在活的敏感细胞内才能繁殖。
对敏感细胞的要求：
必须是活的敏感动物或其组织细胞
特点
形体小，大小在0. 2μm以下 无核糖体和酶系统 不具有独立的代谢能力 专性寄生在活的敏感宿主体内 在体外可以无生命状态 繁殖方式：复制＋装配
3
3.1 病毒的一般特征及其分类
3.1.2 病毒的分类
根据病毒不同的专性宿主，可把病毒分为： 动物病毒、 植物病毒、细菌病毒（噬菌体）、放线菌病毒（噬放 线菌体）、藻类病毒（噬犬 病 毒 子 弹 形 病 毒
9
T4 噬 菌 体 蝌 蚪 形 病 毒
10
流 行 性 感 冒 病 毒 丝 状 有 被 膜 的 病 毒
11
病 毒
SARS
12
“非典型肺炎”元凶冠状病毒 SARS
13
“非典型肺炎”元凶冠状病毒 SARS
14
3.2 病毒的形态和结构
3.2.1 病毒的形态和大小 最大：痘病毒 动物病毒 100nm×200nm×300nm 最小：口蹄疫病毒 d＝22nm 大小 最大：马铃薯Y病毒 植物病毒 750nm×12nm 最小：南瓜花叶病毒 22nm 大肠杆菌噬菌体 f2 d=25nm
DNA病毒
根据核酸分类 RNA病毒
4
3.2 病毒的形态和结构
3.2.1 病毒的形态和大小 动物病毒：球形、卵圆形、砖形 形态 植物病毒：杆状、丝状、球状 噬菌体：蝌蚪状、丝状
5
脊 髓 灰 质 炎 病 毒 球 形 病 毒
6
烟 草 花 叶 病 毒 线 形 病 毒
7
痘 病 毒 砖 形 病 毒
能提供病毒附着的受体 其内部无破坏特异性病毒的限制性核酸内切酶
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3.4.2 病毒的培养基
1.脊椎动物病毒的培养基 a 人胚组织细胞（肌肉等的细胞） b 人组织细胞（扁桃体等） c 人肿瘤细胞（上皮癌细胞） d 动物组织细胞及胚细胞（猴肾细胞等） e 敏感动物（兔） 2. 植物病毒的培养基 与之相适应的敏感植株和植物组织 3. 噬菌体的培养基 与之相应的敏感细菌
蛋白质衣壳
核酸
被膜
20
立体对称型，疱疹病毒
病毒的构型 螺旋对称型，狂犬病毒 复合对称型，大肠杆菌T系噬菌体
21
大肠杆菌噬菌体结构
22
3.3 病毒的繁殖
3.3.1 病毒的繁殖过程
吸附 侵入 复制 装配 释放 吸附：噬菌体以尾部末端吸附到敏感细 胞表面的某一特定化学成分—受体 侵入
动物病毒：借助细胞吞噬和胞饮作用 植物病毒：通过植物伤口或昆虫口器 噬菌体：侵入方式最为复杂
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3.2.2 病毒的化学组成和结构
3.2.2.1 病毒的化学组成
病毒粒子是指结构和功能完整的病毒颗粒，
主要由蛋白质和核酸组成。
有些病毒具有被膜（囊膜），其中还含 有类脂质（磷脂、胆固醇等）
17
蛋白质：不同的病毒其氨基酸的含量和组成不同 保护病毒不受外界条件的影响(保护作用) 蛋白质功能 决定病毒感染的特异性
具有致病性、毒力和抗原性
18
3.2.2.1 病毒的化学组成
核酸：决定病毒遗传、变异和对敏感宿主细胞的
感染力
动物病毒：含DNA或RNA 植物病毒：大多数含RNA，少数含DNA 噬菌体：大多数含DNA，少数含RNA
一个病毒粒子不同时含有DNA和RNA
19
3.2.2.2 病毒的结构
核衣壳 病毒粒子
吸附
侵入
病毒大分 子合成
装配
释放
28
3.3.2.1 噬菌体分类 1. 毒（烈）性噬菌体：侵入细胞后，随即引 起宿主细胞的裂解。
2. 温和噬菌体：侵入后，其核酸附着并整合 在染色体上，和宿主的核酸同步复制，宿主 细胞不裂解而继续生长。
30
3.3.2 病毒的溶原性（lysogeny）
3.3.2.2 溶原性 溶原细胞：含有温和噬菌体核酸的宿主细胞。
洗去胰酶，吹散细胞并计数
加生长液，分装
保持37℃，培养2～3d即可
37
病毒样品的采集与制备
固体病毒样品：用液体培养基制成悬液，离心， 去杂质，取其上清液备用。 液体病毒样品：直接离心，去杂质，取上清液。 空气病毒样品：真空泵抽取至长有宿主菌的平 板上，或将长有宿主菌的平板暴露于空气。
38
动物病毒的接种与观察
第三章 非细胞结构的超微生物—病毒
1
由于病毒特殊的结构和形态及其生活习 性，按照六界学说，把病毒列为单独的 一个界，即病毒界。病毒个体极小 （<0.2µ），只有在电子显微镜下才能 看见病毒的庐山真面目，而且病毒不具 有细胞结构。
2
3.1 病毒的一般特征及其分类
3.1.1 病毒的特点
病毒（Virus）是没有细胞结构，专性寄生在活的敏感 宿主体内，可通过细菌过滤器，大小在0.2μm以下的超微 小生物。
35
3.4.3 病毒的培养
1.动物病毒的空斑试验
用平衡盐洗涤经培养24～48h的单层细胞 接种病毒样品，37℃恒温箱中吸附1h 加营养琼脂培养基覆盖，置37℃恒温箱中培养24h 加0.2％中性红继续培养，出现空斑
取出计数
36
单层细胞的制备和培养
0.5～1mm3动物组织小块 平衡盐洗涤数次
加5％胰酶消化10～15min
光及辐射 紫外辐射( 灭活部位是病毒的核酸，使核酸中的嘧 啶环受到影响。)
X射线等离子辐射均有灭活病毒的作用。
干燥（RNA） 相对湿度高存活好，相对湿度低灭活好（无被膜） ，有 被膜则相反
42
3.5.2 病毒对化学因素的抵抗力
pH 6.0~8.0 ：稳定， pH 5以下或pH 9以上：迅速失活；
原（前）噬菌体：指溶原细胞内的温和噬菌 体核酸。 溶原性：是遗传特性，原噬菌体随宿主细胞 分裂传给子代细胞，故子代细胞也是具有溶 原性的，是溶原细胞。
31
3.3.2 病毒的溶原性（lysogeny）
3.3.2.3 溶原性噬菌体的命名
Escherichia
属名(大肠杆菌)
coli
K12(λ) 种名 株名 溶原性噬菌体
1.破坏病毒蛋白质的化学物质
酚、低渗缓冲溶液环境
2.破坏核酸的化学物质 甲醛，亚硝酸，氨
3.影响病毒脂类被膜的化学物质 醚，十二烷基硫酸钠，氯仿等
43
病毒的存活和在污水处理中的去除效果 环境中存在的各种因子会影响到病毒的生存，所以 病毒在各种不同环境中的存活时间是不一样的。 污水处理的不同程度，对病毒的去除效果也是不同 的。 一级处理：很低，最多30% 二级处理：90-99% 三级处理：滴度常用对数值下降4～6
23
胞饮作用
吞噬作用
24
噬菌体的侵入
噬菌体T4吸附在大肠杆菌细胞 (a) 未吸附 ，(b)(c) 尾部附着 ，(d) 尾鞘收缩，DNA注入
25
复制与装配
噬菌体借助宿主细胞的 合成机构，按其携带的遗 传信息复制核酸，进而合 成噬菌体的蛋白质，核酸 和蛋白质聚集合成新的噬 菌体。
26
释放
27
放置病毒悬液→病毒吸附→注入软琼脂→空斑
空斑 — 是原代或传代单层细胞被病毒感染后，一个个 细胞被病毒蚀空形成的空斑(蚀斑)。 — 病毒空斑单位(plague formation unit)
病毒数的计算
PFU
n瓶内空斑平均数 病毒稀释度 每瓶的病毒接种量
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2. 噬菌体的分离培养 — 双层琼脂法
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