分子标记与辅助选择

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选择扩增：应用含有接头序列和三个选择核甘酸序 列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步 降低扩增片段数量，同时一个引物被同位素或荧光 染料标记（也可用银染），电泳后压片检测。
AFLP技术
遗传连锁图谱的构建 亲缘关系和遗传多样性的研究
AFLP标记 技术的应用
种质资源鉴定
分子标记辅助选择育种
基因表达和基因克隆
3应用
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十 种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘 关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记类型
A、基于分子杂交的分子标记 RFLP(限制性片段长度多态性) B、基于PCR技术的分子标记 （1）随机引物： RAPD(随机扩增多态DNA) DAF VNTR
缺点:
SSR标记的建立首先要对为微卫星侧翼序 列进行克隆、测序 、人工合成设计引物以 及标记的定位、 作图等基础性究，因而其 开发有一定的困难，费用也很高。
SSR微卫星标记技术的应用
构建连锁遗 传图谱加快 遗传多样性 的研究
种质资源 鉴定
分子标记 辅助育种
4、AFLP标记
AFLP (amplified fragment length polymorphism) 即扩增性片段长度多态性
寻找与基 因或QTL 紧密连锁 的标记或 侯选基因
寻找与性 状变异有 关的特定 基因（型） 或功能位 点
检 测 选 择
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影响分子标记辅助选择的因素：
• 数量性状主基因或QTL效应的大小。 • 分子标记与主基因或QTL连锁的紧密程度。 • 主基因或QTL参数（即效应）估计的准确性。 • 数量性状的遗传率。
• 数量性状的遗传机制尚不十分清楚。
2013-8-10
3、辅助选择在动物育种方面用处
1
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3
4
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遗传图
标记辅
杂种优
遗传资
品种分类
谱构建
基因定位
助选择
势分析
源评价
分子标记辅助育种利用动物分子标记技 术结合常规育种对动物的数量性状位点进行选 择、保种、杂种优势分析和利用等，以达到更 有效的育种目的。
★ 标记与基因的关系
分子标记辅助选择主要是根据与目标基因紧密连锁的分子标记 基因型的检测来推测、获得目标基因的基因型。 在分子标记辅助选择中，直接选择的是分子标记的基因型，而 不是目的基因的基因型，因此利用分子标记选择目的基因的基 因型，只是起辅助选择的作用。 分子标记辅助选择的效果取决于连锁的紧密程度。 当分子标记与目的基因紧密连锁时，通过选择分子标记 的基因型，可以有效地选择到目的基因的基因型；距离越远， 通过分子标记的基因型选择目的基因的基因型的效果越差。 若标记与基因共分离，则标记的选择直接就是基因的选 择。
RFLP示意图
限制性片段的制备
电
泳
Southern 印 迹
与放射性探针杂交
放射性自显影
2、RAPD标记
RAPD (random amplified
polymorphic DNA)即随机
扩增多态DNA。该技术是 在1990年由Williams 等人
以PCR聚合酶链式反应为
基础提出来的。
RAPD定义
MAS所需的仪器设备和用具：
仪器设备：
高速离心机、 PCR仪、冰箱、水浴锅、摇床、电
泳仪、电泳槽、电子水平、微波炉、移液器等。
用具：研钵、离心管、三角瓶、点样板、枪头等
高速离心机
摇 床
电泳系统
水浴锅 PCR仪 移液器
MAS基本路线的流程
第1步 第2步 第3步 第4步
寻找主基 因或QTL 确定基 因或QTL 的位置
RAPD标记是以单个随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链 (一般 为8-10bp)为引物(primer) ，非定点扩增基因组DNA，获得长度
不同的多态性DNA片段。 RAPD的基本程序是PCR反应，所用
的反应条件与常规PCR基本一致。 由于引物的非特异性，因此相同引物在不同基因型的模板 DNA上可能有不同的结合位点，因此其扩增片段有可能出现多 态性，这种多态性通常表现为有带和无带的差异，即表现为显性。
• 分子标记的特性（早期标记和晚期标记）和群体大小。 • 应用MAS的代数（反比）。（由于随着代数的增加，重组 概率上升，分子标记与主基因或QTL连锁的紧密程度下 降。）
2013-8-10
制约分子标记辅助选择的因素：
• 检测分子标记基因型的成本较高。
• 遗传图上的标记密度尚较低。 • 标记基因检测的准确性。
特点: 具有共显性的特点； RFLP标记具有种族特异性； RFLP标记遍及整个基因组； 不足：主要表现在所需DNA量 大，步骤复杂，需要的仪器、设 备较多，周期长，成本高，检测 中利用放射性的同位素，易造成 环境污染；
RFLP原理：
RFLP是由于染色体上单核甘酸突变或插入及 缺失突变导致限制性酶切位点的增加或减少，从 而导致DNA酶切片段长度的变化，这种变化的检 测通常是应用同位素或酶联免疫标记探针进行检 测。
AFLP标记的主要缺点:
1）要求DNA 质量高；
2）操作繁琐， 条件优化较 难；
3）容易出现 染色体聚集 现象。
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AFLP技术路线
基因组DNA被酶切成小片段：通常用一个四个碱基识 别位点的限制性内切酶如MseI和一个六个碱基识别位 点的酶如EcoRI，其中MseI确保产生合适大小的DNA片 段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱 基识别位点酶EcoRI能够限制扩增片段数目，确保DNA 多态性的正常检测；
0.09
用于MAS育种的分子标记须具备三个条件： ① 分子标记与目标基因紧密连锁（一般应小于 5cM） ； ② 标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便 地检测大量个体；最好是以PCR为基础的标记。 ③ 不同遗传背景选择有效。
三、 MAS的基本实验技术
1、DNA抽提技术 2、PCR技术
3、电泳技术
1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测 DNA多态性的新方法。
定义： 由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少 限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。 AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。
AFLP的基本原理图
▲ AFLP的步骤：
经聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳染色
比较谱带的 相对迁移 距离，便可 知不同个 体在某个 SSR座位上 的多态性。
SSR微卫星标记的优缺点：
优点
(1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组 中。 (2）微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微 卫星位点检测可以显示纯合子和杂合子。 (3）微卫星检测容易、重复性较好、省时， 适合于进行自动化分析。
SSR原理示意图
GA GA GA GA GA GA GA
A B C
GA GA GA GA GA
GA GA GA GA GA GA GA GA
A
B
C
SSR技术路线：
第一步 第二步 第三步 第四步 第五步
建立 DNA文 库筛选 鉴定微 卫星 DNA克 隆
测定 这些 克隆 侧翼 序列
设计特 异性引 物来扩 增SSR 序列
二、分子标记辅助选择
分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS） 就是利用与基因紧密连锁的分子标记，对目的基因进 行辅助选择，从而实现对基因的有效利用。 利用分子标记进行育种材料选择又称为分子标记辅助育 种。
目前MAS 主要应用在有利基因的转移和基因聚合等方
面。
1、分子标记辅助选择的原理
1990
1995
SSRs AFLPs SRAP TRAP Multi-SSRs SNPs DArt HiSpeed sequ
1990
199 5
2000
2000
理想分子标记应具有的特点
高的多态性
共显性遗传 能明确辨别等位基因 遍布整个基因组，且均匀分布 选择中性（即无基因多效性） 检测手段简单、快速、结果可靠，重复性好，且 开发成本低
PPT 制作
主辩二
主辩一
分子遗传记
1.定义
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础 的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
2.比较
与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标 记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显 性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子 标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的 DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为 中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简 单、迅速。
电泳图
（ＲＡＰＤ）随机圹增多态性ＤＮＡ
RAPD 技术的步骤
RAPD 扩增
DNA 的 制备
特点
检测未知序列的基因组DNA RAPD标记为显性标记，极少数为共显 性标记 引物无种族特异性 RAPD技术简单 RAPD标记的最大缺点是再现性差
数据处理
3、SSR标记
简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）又 称微卫星（microsatellite）或称短串联重复（short tandem repeat，STR）.是一类由几个（一般2-6个） 核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联 重复序列。如(CA)n、(AT)n、(GGC)n等
RAPD原理
基因组中存在或长或短的被间隔开的颠倒重复序列 由单个短的随机序列引物对基因组进行PCR扩增，当 两个反向互补引物结合位点间距离满足PCR扩增条件， 就可以产生扩增片段。RAPD扩增产物的多态性是由于 引物结合位点或结合位点间发生了重排、缺失或突变导
致扩增产物的缺失。
RAPD的原理图
若位点2处碱基发生改变
1
2
接头与酶切片段的连接：接头序列包括：一个核心序 列和酶切位点特异序列，MSE接头和ECORI接头，核心 序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；
3
预扩增：应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富 聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择 核甘酸。只有一端为EcoRI切点，一端为MseI切点的DNA酶切片 段，同时也与选择核甘酸配对的DNA序列才能被扩增。1～3步 的产物可以通过Agarose胶检测。
（2）特异引物： SSR(微卫星)
AFLP(扩增性片段长度多态性) INDEL(插入/缺失多态性)
SCAR
CAP EST
STS RGA
ISSR
C、基于限制性酶切和PCR技术的分子标记 D、以DNA序列分析为核心的分子标记 SNP FM (功能标记)
分子标记的发展
1985
RFLPs
1985
RAPDs
AFLP标记的主要优点
② 多态性极高，
一次可检测到100－
150个扩增产物，非 常适合绘制品种指纹 图谱及进行分类研究。
③DNA 用量 少, 且对模板 浓度变化不 敏感; 3 2 1
④ 可靠性好, 分 辨率和重复性高， 不受环境影响;
五点
4
5
⑤ 引物通用性强， 灵敏度高，快速高 效
① AFLP 标记理论 上可以无限多, 可覆 盖整个基因组, 不需 预知DNA 序列信息, 呈典型孟德尔遗传;
四种主要分子标记的介绍
一.RFLP
二.RAPD
三.SSR
四.AFLP
1.RFLP标记
限制性片段长度 多态性（ＲＦＬ Ｐ）标记
RFLP是利用特定的 限制性内切酶识别并 切割（消化）不同生 物个体的基因组DNA， 由于不同个体等位基 因间碱基的互换、重 排、缺失等变化导致 限制性内切酶识别位 点发生改变，从而造 成基因型间限制性片 段长度的差异
★分子标记辅助选择的原理
抗性供体
m
R
受体
M S
m
M R× S
目的基因(R)与标记(m)连锁 （交换值为r）
亲本中的标记带型
m R
M S
F1中的标记带型 ×
mm Mm MM
F2群体中3种标记带型
RR
RS 2r(1r)
SS r2 0.0025
(1-r)2
0.9025
当r=0.05时，根据标记基因型 mm选择目的基因型RR，选错的 概率约为0.10
基因组DNA的双酶切
限制性片段
人工接头
电泳
无选择性碱 基引物扩增
加选择性碱基并放 射性标记的引物扩 增（SRFA）
AFLP电泳图
select 20 polymorphism markers from 256 primers
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3
AFLP AFLP
荧光标记全自动AFLP
For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP Kits
评价：目前分子标记辅助育种仍在处于发展阶段，尚有 很多问题需要研究，但在动物育种中已有成功的例子 （如猪、鸡）。