RNA提取及PCR操作流程

RNA的提取
准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。

TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

TRIzol加量不足可能导致提取
的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核
酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-
8℃10000×g离心10分钟，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15
秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。

样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。

用异丙醇沉淀水相中的RNA。

每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放
置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

移去上清。

9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。

每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。

2-8℃不超过7500×g离心5分
钟，弃上清。

10.室温放置干燥(降解？)或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。

加入25-200μl无RNase 的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。

RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保
存。

注意事项：
1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。

例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free 糖原。

糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少
一个月。

RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g
离心30-60分钟。

预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细
胞5-7μg 。

常见问题分析：
得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。

低离子浓度和低pH值条件下
A280值偏高
B．样品匀浆时加的试剂量太少
C．匀浆样品时未在室温放置5分钟
D．吸取水相时混入了有机相
E．RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在
了-5至-20℃
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或
碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。

这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。

从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离
心，并加上以上操作步骤。

阿辉，以下附我以前做PCR的操作流程：
主要试剂：Trizol、First Strand Synthesis for qRT-PC第一链合成试剂盒购自美国Invitrogen公司，SYBR? Premix Ex Taq? II (Perfect Real Time) 购自TaKaRa公司；DEPC为BIO BASIC公司产品。

PCR引物由Primer primier 5 软件设计，Invitrogen公司合成。

2.2.2主要试剂及器材准备
(1)RNase-free水：使用RNase-free玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度为0.1%，搅拌过夜、使DEPC完全溶解后，高温高压灭菌；
(2)耗材准备：将EP管、移液器吸头、玻璃瓶等器材用0.1%DEPC水浸泡过夜去除RNase，高温高压灭菌后，烤干备用
2.2.3 Real Time PCR 检测基因表达
2.2.
3.1 细胞总 RNA 的提取
(1)细胞预处理结束后，吸出培养液，用1×PBS清洗一次，每孔中加入
1ml Trizol试剂，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落，冰上裂解5min。

(2)将裂解物移至DEPC处理过的1.5ml 离心管中，静置5min后加入1/5 TRIzol体积的氯仿，上下颠倒离心管充分混合，冰上放置5min，4℃、12,000×g 离心15min，将上清转移至一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min，4℃、12,000×g离心10min；
(3)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml（DEPC处理水配置）。

轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，4℃，12,000×g 离心5min后小心弃去乙醇。

(4)室温干燥沉淀2～5 分钟，加入10μl DEPC处理水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存；
(5)使用紫外分光光度仪检测抽提总 RNA 的纯度及其浓度，取0.5~1μL 提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳确定RNA质量。

2.2.
3.2？初步提取的总RNA去除基因组 DNA 提取的总RNA用 DNaseI去除痕量基因组DNA，体系如下：
37℃水浴1h后用Trizol试剂再次抽提RNA，并以β-actin引物进行PCR扩增证实无基因组DNA残存。

再次鉴定RNA的纯度和浓度。

2.2.
3.4 逆转录反应
按照 First Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR逆转录试剂盒说明书进行操作。

冰上配制反应液，如下表所示：
1 ug RNA +随机引物 5ul 或 Oligo（dT）1 ul + dNTPs 1 ul + DEPC水使最终体积达到10 ul后于水浴锅上65℃水浴5min后于冰上至少1min，加入以下组分：
当所有试剂加入后充分混匀，25℃反应10min、37℃反应50min、70℃反应15min后，迅速放入冰中冷却，然后加入1μl(2U)的 E.coli RNase H，37℃反应20min，然后置于-20℃保存备用。

2.2.
3.5 实时荧光定量PCR
2.2.
3.5.1 实时荧光定量PCR引物合成
2.2.
3.5.2 实时荧光定量PCR反应
(1)EGFR、PI3K、Akt和p-Akt使用的是TaKaRa公司的SYBR? Premix Ex Taq? II (Perfect Real Time)试剂盒，按以下组分配制PCR反应液，反应液配制在冰上进行。

(2)加入后充分混匀，将反应管置ABI 7500 反应仪(ABI公司)中，反应条件
如下表所示。

扩增完毕后进行熔解曲线分析：95℃ 15s，60℃ 1 min，95℃ 30s，60℃ 15s。

反应结束后对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析反应的特异性。

各基因反应条件如下表：
(3)定量的方法参照文献，以2－△△Ct（Ct代表循环阈值)表示与对照组细胞相比，各目的基因治疗后上调或下调的比率，计算公式为：治疗组目的基因
ΔCt =治疗组目的基因的Ct值-治疗组内参Ct值；对照组目的基因ΔCt =对照组目的基因的Ct值-对照组内参Ct值；ΔΔCt=治疗组目的基因的ΔCt–对照组目的基因的ΔCt，目的基因的表达比率=2－△△Ct。

以上实验重复3次。

（4）结果说明：①Ct 值的定义：在荧光定量 PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct 值。

C 代表 Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

②Ct 值与起始模板的关系：每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，Ct 值越小表示基因起始拷贝数越多，基因表达量越高；Ct 值就越大表示起始拷贝数越少，基因表达量越低。