羧基微珠表面化学与生物活化方法及表征 布洛芬标记

图 3 F ig. 3
( a) 茚三酮显色法工作曲线 ; ( b) 电导返滴定法表征微珠表面含羧基量曲线 ( a) Standard curve o f n inhydrin reaction; ( b) Curve o f carboxy l quantity on the surface of m icrobeads using conduc tom etr ic titration
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文章编号 : 0438 0479( 2008) S2 0201 03 牌 ) 及荧光倒置显微镜 ( N ikon) 等. 1 . 2 方 法
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CD I法活化羧基微珠 , 实验原理参照文献
. 称取
5 m g 羧基微珠于 EP 管中, 加入 400 L 去离 子水和 100 L 无水乙醇洗涤 , 离心后用移液枪吸弃上清液, 重复上述步骤 3 遍. 用相同的方法加入 400 L 无水丙 酮洗涤 4 遍 , 使微珠处在无水的环境下. 在此微珠中加 入 1 mL 无水丙酮和 15 mg 偶联剂羰基二咪唑 ( CDI), 放在漩涡混合器上反应 1 h , 使得微珠载体修饰上咪唑 基团.
*
Abstract : A n approach of bio m o lecu lar m i m obilization on the surface of the carboxy l m icrobeads, the sen sing un its of the m icrobead ar
rays , is presen ted. In th is m ethod , carboxy l m icrobeads w ere activated u sing N, N C arbony ldim i idazo le ( CD I), and the activated g roups and the activation efficiency w ere quan titatively m easu red and calculated. A s a result of the m i m obilization of the an tibod ie s on the activated m icrobeads and the fluorescence m icroscopic m i ag ing analy sis, the fluorescence signal of the activated beads is 60 fold h igher than th at of the unactivated bead s , w hich show s high activation effic iency . i m obilization; fluorescence ; biochip K ey w ord s : carboxy l m icrobead; m
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收稿日期 : 2008 10 18 基金项目 : 国家自然科学基金 ( 20775065、 20835005) , 教育部高 校博士点基
金 ( 20070384023) , 化学生物传感与计量 学国家重 点实验 室 (湖 南大学 )开 放 课 题 ( 2006021 ), 国 家 基 础 科 学人 才 培 养 基 金 ( J0630429) 资助
增刊 2
陈
雪等 : 羧基微珠表面化学与生物活化方法及表征
203
图 4 微珠的显微成像 F ig. 4 F luo rescence i m ages o f carboxyl m icrobeads
3 结
论
参考文献:
[ 1] 罗渊 , 刘伯华 , 祝庆余 . 悬浮芯片在 核酸和蛋白质检测中的 应用 . 微生物学杂志 [ J]. 2007, 27( 2): 78- 81. [ 2] 蒋中华 , 章 津辉 . 生 物分 子固 定化 技术 及应 用 [M ]. 北 京 : 化学化工出版社 , 1998 : 165- 178. [ 3] 杨旭 , 李欣 , 潘复生 , 等 . 表面含羧基 的磁性高分 子微球的 制备和表征 [ J]. 化学世界 , 2006, 5: 276- 280. [ 4] 崔黎黎 , 范慧俐 , 孟璐 , 等 . 上转换发光材料表面修饰羧基 的制备与表征 [ J]. 功能材料 , 2007, 1( 38): 4- 10. [ 5] Zhou L J , W ang K M, T anW H, e t a . l Quantitative intrace l lu lar mo lecu lar profiling using a one d i m ensiona l flow system [ J]. A na l Che m, 2006 , 78 : 6246- 6251. [ 6] 康凯 , 阚成 友 , 杜奕 , 等 . 生 物医 用高 分子 微球 研究 进展 [ J]. 化学研究与应用 , 2004, 16( 2): 137- 142.
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测定结果 0 . 128 ) 0 . 434 1 . 443 30 . 10%
100 % ). 时用未活化的羧基微珠进行相同的实验 . 实验结果如 图 4 所示. 用 I m age pro p lu s( IPP ) 成像 分析软件计算 微珠平均光密度 . 从拍摄的荧光显微图片中, 取 5 个微 珠 , 分析其表面的平均光密度. 运用 IPP软件处理图中微珠的平均光密度, 比较 CD I法活化微珠与未活化微珠的荧光强度 ( 用 BSA 封 闭的微珠荧光强度作为背景光 ), 活化 微珠的平均光 密度效果明显高于未活化微珠, 运用活化方法可以很 大程度地提高微珠表面基团与抗体的偶连 . 数据表明, CD I法活化的微珠比未活化的微珠荧光度提高 60 倍, 从而大大提高了检测灵敏度.
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表 1 微珠表面咪 唑基团的含量和有效活化率 T ab. 1 Contents and activa tion e fficiency on the surface o f the m i crobeads by using CD I 测定内容 CD I法活化微珠的吸光度 微珠表面有效咪唑基团的含量 ( mm o l g 微珠表面羧基的含量 ( mm o l g- 1 ) 微珠表面咪唑基团的有效活化率
关键词 : 羧基微珠; 固定化; 荧光; 生物芯片 中图分类号 : O 65 文献标识码 : A 微珠阵列是利用微珠作为载体, 对核酸、 蛋白质等 生物分子进行分析和测定的一种生物芯片技术 . 作 为微珠阵列芯片平台的核心敏感元件 , 功能化微珠承 担着分子识别和信号表达的任务. 因此, 研究和发展微 珠载体表面的化学与生物修饰方法、 制备性能优异的 功能化微珠 , 是构建高灵敏度和高选择性微珠阵列芯 片分析平台的重要内容. 本文研究羧基聚苯乙烯微珠的化学与生物活化方 法 . 羧基聚苯乙烯微珠是一种性能优良的微珠载体 , 其 表面上的羧基官能团适于在微珠表面上进行多种化学 与生物修饰 . 实验中我们对羧基聚苯乙烯微珠开展了 微珠表面羰基二咪唑 ( CDI) 活化方法的研究, 考察了 微珠表面羧基的含量及表面羧基转化为活性咪唑基团 的有效活化率、 以及活化微珠偶联抗体分子的效果 .
图 1 CD I法活化羧基微珠 F ig . 1 A c tivation of Carboxy lm icrobeads using CD I
2 结果与讨论
2 . 1 羧基微珠的有效活化率 用茚三酮显色法检测羧基微珠表面活化基团的数 量 , 方法如图 2所示. 为此, 将活化的羧基微珠通过咪 唑基团连接上伯胺基团. 取 5 m g 活化的咪唑基团微珠 于 EP管中, 加入 20 L 0 . 6m ol /L 乙二胺溶液, 反应 3 h , 即得到氨基修饰的微珠 . 配制不同浓度的乙二胺标 准系列溶液 , 并与一定浓度 的茚三酮反应显色 ( 沸水 浴 15 m in ) , 用紫外可见分光光度计在 572 nm 处测定 标准系列溶液的吸光度 . 氨基修饰微珠在同条件下与 茚三酮反应显 色后, 测定吸光度 . 通过标准工 作曲线 ( 图 3 a), 计算微珠表面连接上的有效咪唑基团的量. 用电导返滴定法表征微珠表面含羧基量
( D epart m en t of Che m istry , K ey L aboratory of An aly tical Sciences ofM in istry of Education, C olleg e of C he m istry and Che m ical Eng ineering , X iam en U niversity , X ia m en 361005, Ch ina)
采用生物活性物质的共价偶联法 , 由于活性物质 与高分子微球是通过共价键牢固地结合在一起的, 它 的结合稳定性和使用寿命可以明显改善 , 并且可设计 定向偶联. 需要指出的是, 参与共价结合的氨基酸残基 应当不是生物分子活性所必需的, 否则会导致生物分 子活力损失 . 本文研究了羧基微珠的化学与生物活 化方法 , 检测了羧基微珠的有效活化率和抗体结合效 率 , 获得了一种用于构造微珠阵列芯片传感单元的生 物功能化微珠的制备方法 , 具有较高的灵敏度、 特异性 和重现性.
摘要: 研究 了微珠阵列芯片传感单元的生物分子固定 化方法. 运用 羰基二 咪唑 ( CD I) 法 进行羧 基微珠表 面化学 活化研
究及表征 . 结果表明微珠表面咪唑基团的有效活 化率为 30. 1% . 活化微 珠表面 固定化 抗体后 , 采用 荧光显 微成像 分析 , CD I法活化的微珠比未活化的微珠荧光强度提高 60 倍 , 活化效果显著 .
第 47 卷
增刊 2
厦门大学学报 ( 自然科学版 )
Journal o f X iam en Un iversity ( N atura l S cience)
V o.l 47 Sup. 2 D ec . 2008
2008 年 12 月
羧基微珠表面化学与生物活化方法及表征
陈 雪, 周雷激
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( 厦门大学 化学化工学院化学系 , 现代分析科学教育部重点实验室 , 福建 厦门 361005)
* 通讯作者 : ljzhou@ xmu. edu. cn
. 称取
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厦门大学学报 ( 自然科学版 )
2008 年
图 2 茚三酮显色反应 F ig. 2 N inhydr in reaction
10. 5 m g 羧基微珠 , 用 400 L 去离子水和 200 L 无水 乙醇洗涤 3 遍. 将微珠加入盛有 50 mL 0 . 01 m ol /L 左 右的 NaOH 溶液 的烧杯中 . 在磁 力搅 拌下用 0 . 010 1 m o l/L 的 HC l溶液进行滴定 , 滴定速度以 0. 5 mL /m in 为宜. 记录电导值, 直到样品的 pH 值为 3 左右 , 做电 导 滴定体积图 (图 3 b) , 计算羧基的分布 . 当消耗的 盐酸体积在 8 . 70~ 10 . 20 mL 时, 电导率几乎稳定在 1 110 S / c m, 由此求算微珠表面的羧基量 V0. 茚三酮显 色法可求算活化微珠表面的有效咪唑基团的含量 V, 即能得出羧基微珠的有效活化率 ( a = V /V0 结果如表 1 所示 . 2 . 2 活化微珠的抗体固定化及显微荧光成 像分析 活化微珠的抗体固定化 . 将 CD I法活化的微珠 与兔抗人 IgG 反应过夜 ( 4! , 260 r /m in); 用洗涤缓冲 液洗涤微珠 , 加入 1 % 牛血清蛋白 ( BSA ) 封闭微珠载 体上其他的活性位点 , 反应过夜 ; 另取部分活化微珠作 为空白实验 , 不偶联兔抗人 IgG, 直接用 1 % 牛血清蛋 白 ( BSA ) 封闭过夜 . 洗涤微珠后, 将两种微珠与异硫氰 酸 ( FI TC ) 标记 的羊抗兔 二抗, 反应 1 h ( 4! , 260 r / m in); 在荧光倒置显微镜下拍摄微珠的荧光图像. 同
致谢 : 实 验工作 得到了 厦门大 学化学系 周勇亮 老师、 郭祥 群老师的仪器支持 , 特此致谢 !
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Chemo /Bio Activation and Characterization on Surface of CarboxylM icrobeads
CHEN X ue , ZHOUHale Waihona Puke L ei ji1 材料与方法
1 . 1 材料和仪器 羧基功能 单分散聚苯乙烯微球 ( 直径 9 . 0~ 9 . 9 m ) 购自天津贝思乐生物技术公司 . N, N ' 羰基二咪 唑 ( CDI) 购自上海延长生化公司, 无水乙二胺购自厦 门绿茵试剂公司 . 兔杭人 IgG 和 F I TC 羊抗兔购自厦门 闽博生物技术公司, 牛血清蛋白 ( BSA ) 购自上海华舜 生物工程公司. 所用仪器为控温摇床, 电导滴定仪, 紫 外可见分光光 度计, 漩涡混 合器, 高速离 心机 ( 飞鸽