烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定

38 中国烟草科学 2007，28（2）：38-40
烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定
彭细桥1，3，刘红艳2，罗宽3，邓正平1
(1.湖南省烟草公司郴州市公司烟科所，湖南郴州 423000；2.湖南省茶叶研究所，长沙 410125；
3.湖南农业大学，长沙 410128)
摘要：为了获得防治烟草青枯病新途径，从湖南桂阳烟草青枯病重病区采集的健株上，共分离到内生菌株160个。

经对峙培养法测定，32个菌株对烟草青枯菌有拮抗作用，其中H-1、H-9和H-11有强拮抗作用，抑菌圈分别为3.0、3.0、4.5 mm。

根据其形态特征和生理生化性状，初步鉴定内生菌H-1为枯草芽孢杆菌，H-9和H-11为短芽孢杆菌。

关键词：烟草青枯病；拮抗细菌；定殖；鉴定
中图分类号：S435.72 文献标识码：A 文章编号：1007-5119（2007）02-0038-03
Selection and Preliminary Identification of Tobacco Antagonistic Endophytic
Bacteria against Ralstonia Solanacearum
PENG Xiqiao1,3, LIU Hongyan 2, LUO Kuan3, Deng Zhengping1
(1. Tobacco Science Institute, Chengzhou Branch, Hunan Tobacco Company, Chengzhou, Hunan 423000, China; 2. Hunan Tea
Research Institute, Changsha 410125, China; 3. Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Abstract: One hundred and sixty endophytic bacteria strains were isolated from health tobacco plants in Guiyang county of Hunan province in disease severely infested plots. Thirty two, in particular three endophytic bacteria strains showed relatively strong antagonistic actions against Ralstonia solanacearum. Culturing these three bacteria and Ralstonia solanacearum together, the results showed that three endophytic bacteria H-1, H-9, and H-11 had the best antagonistic effects, and bacteriostasis diameters were 3.0, 3.0, and 4.5 mm, respectively. With regard to morphologic, physiological, and biochemical characterics, strain H-1, H-9, and H-11 were identified. The results showed that H-1 was Bacillus subtilis. H-9 and H-11 were Bacillus brevis. We also identified that they were all endophytic bacteria in tobacco.
Keywords:ralstonia solanacearum; endophytic bacteria; colonization; identification
烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种以土壤传播为主的毁灭性细菌性病害。

目前对该病的防治尚无理想的药剂和抗病品种，防治手段以化学农药为主。

但长期大量施用化学农药既易使病菌产生抗药性，又易导致严重的环境污染。

内生细菌是在植物长期进化过程中产生的一种共生菌，具有能广泛分布于植株体内、定殖能力强、防效好、增殖和扩散快等优点[1-4]，因此，利用植物内生菌防治该病具有广泛的发展前景。

为此，本试验对烟草的内生拮抗细菌进行了分离鉴定，筛选出对烟草青枯病菌有拮抗作用的内生细菌，以期获得防治烟草青枯病的新途径。

1 材料与方法
1.1 试验材料
烟草感病品种：云烟9803，由湖南省烟草公司郴州市公司烟科所提供；烟草健株：在烟株旺长期，从湖南省桂阳县多年烟草青枯病重病田采集获得；烟草青枯菌菌株2316：由湖南农业大学植物病理教研室提供；牛肉汁培养基（BPA）、TZC（三苯基四氮唑）培养基，参照文献[5]配制。

1.2 内生菌的分离、纯化与保存
基金项目：湖南省烟草专卖局基金资助项目(HN-02-006)
作者简介：彭细桥(1978-)，男，农艺师，硕士，主要从事烟草调制与生物防治技术研究。

E-mail:**************收稿日期：2006-08-27
第2期彭细桥等：烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定39
从青枯病重病田采取健康烟株样品后，内生拮抗菌按以下步骤分离、纯化、保存：（1）用无菌水将样品冲洗干净，然后用无菌纸吸干水分；（2）用75%的酒精清洗样品，把样品放在酒精灯上表面灭菌；（3）用无菌刀把植株茎的表皮切去，切取小量木质部放入盛有10 mL无菌水的试管中，静置30 min后，梯度稀释101～104倍，每个梯度取l mL菌液涂抹于BPA平扳上，每浓度涂平皿1个，重复3次，置于28~30℃恒温箱中培养；（4）培养3 d，挑取不同形态的菌落重新于平板上划线纯化，挑取划线培养的单个菌落移入试管斜面保存备用。

1.3 内生菌种类鉴定
观察内生细菌的形态，革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色参照文献[5]；生理生化性状测定参照文献[6-7]；细菌菌株分类按文献[8]进行。

1.4 内生菌对烟草青枯病菌的拮抗作用
采用对峙培养法[5]测定，先做BPA平板，将青枯病菌移至培养皿中央，28℃培养24 h后，再将待测菌株移到青枯病菌菌块四周，28℃培养4 d后，观察抑制作用，测量拮抗菌的抑菌圈大小。

1.5 内生细菌定殖力测定
在牛肉汁培养液中培养3 d的内生细菌，稀释10倍；在移栽前，将4~5叶期的云烟9803，浸根30 min后接种移栽，每个菌株3次重复。

接种15 d 后，采集距地面的茎段，按1.2和1.3方法进行分离和鉴定。

2 结果与分析
2.1 内生菌菌株分离和筛选
从表1可以看出，以青枯病菌株2316作为标准菌，用分离到的160个内生菌株进行拮抗作用测定，结果有32个菌株对烟草青枯菌有拮抗作用，占总菌株数的20%。

其中以H-1、H-9、H-11的抑菌圈半径最大，分别达到3.0、3.0、4.5 mm。

表1 内生细菌对烟草青枯病菌的拮抗作用
菌株抑制圈/mm 菌株抑制圈/mm 菌株抑制圈/mm 菌株抑制圈/mm
H-1 3.0
H-53 0.5
H-92 0.5
H-134 0.5 H-6 0.5
H-60 1.0
H-96 1.0
H-135 1.0 H-9 3.0
H-62 1.0
H-110 1.5
H-139 1.5 H-11 4.5
H-71 1.5
H-113 0.5
H-140 2.0 H-18 0.5
H-73 0.5
H-118 0.5
H-144 0.5 H-25 1.0
H-80 1.5
H-119 1.0
H-149 1.0 H-33 0.5
H-81 1.0
H-126 1.0
H-150 1.0 H-42 0.5
H-82 0.5
H-128 1.0
H-151 0.5
表2 3株内生菌的形态学观察
菌株菌落形态芽孢鞭毛革兰氏染色
H-1 不规则形，可以起皱，在液体培养基上色暗、皱褶有完整的膜有芽孢，椭圆形，中生侧生 G+，杆状
H-9 不规则形，菌落污白色，边缘不整齐有芽孢，椭圆形，中生周生 G+，杆状
H-11 圆形或不规则形，边缘呈波状有芽孢，柱形，中生或次端生周生 G+，杆状
表3 3株内生菌株的生理生化性状测定
生理生化反应H-1 H-9 H-11 生理生化反应H-1 H-9 H-11
葡萄糖产酸＋＋＋分解酪氨酸－＋＋
葡萄糖产气－－－分解酪素＋＋＋
淀粉水解＋－－接触酶＋＋＋
NO3 →NO2＋＋＋吲哚产生－－－
厌氧洋菜中生长－－－苯丙氨酸脱氢－－－
从阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸＋－－V.P.肉汤咸性反应＋＋＋
注：－代表无反应、＋代表有反应
2.2 内生细菌种类鉴定
将表2、3结果与文献[8]所列的有关芽孢杆菌属形态学与生理生化形态的描述进行比对，可初步认定内生细菌菌株H-1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），H-9和H-11为短芽孢杆菌（Bacillus brevis）。

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2.3 拮抗菌内生性与定殖力测定
对筛选到的3株内生菌做内生性、定殖力测定，初步鉴定出这3株内生菌H-1、H-9、H-11均能从接种的烟株中分离得到，且在显微镜下菌体形态与接种前菌体形态一致，说明这3株内生菌均有较好的内生性、定殖力。

3 结论与讨论
芽孢杆菌是土壤和植物微生态中的优势微生物种群，具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用，许多性状优良的天然分离株己成功地应用于植物病害生物防治[9]，加之芽孢杆菌对营养、温度要求不严格，易于保存，在室温下保存1年都不影响其生活力。

因此，近年来利用芽孢杆菌对植物病害进行生物防治成为了一门热门课题。

本研究从烟草茎杆中分离到的160个拮抗菌株中，有32个具有潜在的生防效果，其中H-1、H-9、H-11对烟草青枯病菌的抑菌效果最好，且都为芽孢杆菌。

这就为下一步田间防效试验奠定了基础。

由于内生菌与病原菌都可侵入烟草，二者可能进行营养及侵染位点的竞争，产生的抗菌素抑制致病菌的增殖，在寄主植物体内的定殖还可能诱导寄主产生对致病菌的抗性，从而进一步控制病原菌在寄主体内的增殖和扩展[10-12]。

本研究所测试的3株内生细菌的防病作用究竟是哪种机制在发挥作用，有待今后进一步的研究。

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（责任编辑 迟立鹏）。