大鼠PAX2真核表达质粒构建及瞬时转染肾小管上皮细胞模型建立

大鼠PAX2真核表达质粒构建及瞬时转染肾小管上皮细胞模
型建立
李里;吴玉斌;宫亮
【摘要】目的为进一步研究核转录因子(PAX2)对肾小管上皮细胞的转分化调控机制提供依据.方法真核表达质粒( PGC-FU) -PAX2真核表达质粒的构建:设计PAX2的引物,PCR法从单侧输尿管结扎大鼠肾脏中扩增出目的片段,酶切后定向连入
PGC-FU载体,将该重组质粒转化到Ecoli感受态细胞中,通过氨苄青霉素抗药性筛
选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增；通过PCR及基因测序检测其构建的正确性；PGC-FU-PAX2瞬时转染肾小管上皮细胞模型的建立:脂质体转染法将重组质粒转
入肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),RT-PCR法、Western blot法分别检测
NRK52E细胞PAX2基因、蛋白表达水平,确认PAX2基因的高表达.结果 RT-PCR 法成功克隆大鼠PAX2基因,PCR扩增的片段长度为1 294 bp,含有重组质粒的阳
性克隆菌液PCR扩增片段约为408 bp,其基因测序结果显示与预期片段大小一致,
目的基因与预期基因序列的同源性为100％,说明PGC-FU-PAX2真核表达质粒构
建成功.NRK52E转染的PGC-FU-PAX2质粒能够高表达PAX2,呈现绿色荧光,空载组和对照组NRK52E均未见PAX2高表达.结论成功构建了真核表达载体PGC-
FU-PAX2,建立了PAX2高表达肾小管上皮细胞模型,为PAX2对肾小管上皮细胞的转分化作用机制的研究奠定了实验基础.
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2012(052)035
【总页数】4页(P35-38)
【关键词】核转录因子;真核表达质粒;肾小管上皮细胞
【作者】李里;吴玉斌;宫亮
【作者单位】辽宁医学院附属第一医院,辽宁锦州121000;中国医科大学附属盛京
医院;中国医科大学附属盛京医院;辽宁医学院附属第一医院,辽宁锦州121000
【正文语种】中文
【中图分类】Q782
核转录因子(PAX2)基因编码核转录因子，是肾脏胚胎发育过程中诱导肾小管上皮
细胞转分化的关键性发育基因之一，参与胚胎肾脏各个发育阶段的调控［1，2］，成熟肾单位其表达消失。

研究表明，PAX2对单侧输尿管结扎(UUO)大鼠肾小管上皮细胞EMT有调控作用，参与肾间质纤维化的病理过程，但其调控机制的研究鲜有报道。

我们采用基因重组技术构建大鼠真核表达质粒(PGC-FU)-PAX2真核表达质粒并立转染PGC-FU-PAX2使大鼠正常肾小管上皮NRK52E细胞中PAX2基因高表达，旨在为进一步研究PAX2对肾小管上皮细胞的转分化调控机制提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料 Wistar大鼠10只(体质量120～150 g，鼠龄2～4周，购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心)，PCR引物:参考GenBank的PAX2基因序列设计出1对PAX2基因编码区扩增，引物序列:上游引物:PAX2-Age I-F GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGATATGCACTGCAAAG;下游引物:PAX2-Age I-R:TCACCATGGTGGCGACCGGGTGGCGGTCATAGGCAGC(上海吉凯基因化学技术有限公司合成)。

引物说明:Age I酶切位点(下划线标记的)。

载体克隆鉴定引物PAX2-F:CTGCATCTACCAACCCTG;PAX2-
R:CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，408 bp。

Trizol试剂(Invitrogen试剂公司提供);pGC-FU真核表达载体(上海吉凯基因化学有限公司)。

本研究采用SPSS11.5统计软件行统计学处理，组间数据比较采用t检验。

检验水准α=0.05。

1.2 PGC-FU-PAX2真核表达质粒构建采用左侧输尿管结扎法制备肾间质纤维化模型(梗阻性肾病模型)造模21 d处死大鼠取左肾肾皮质总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增PAX2 cDNA片段，PCR 反应体系:引物0.4 μmol/L，dNTP 1.6 mmol/L，5 × Taq buffer 4 μL，Taq 酶0.2，ddH2O 1
2.4 μL，Template 1 U;PCR反应条件:94℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30 个循环;最后72℃、10 min，扩增PCR产物大小约1294 bp，取2～5 μL进行琼脂糖凝胶电泳分析;采用纯化试剂盒回收纯化PCR产物。

将Age I酶切回收后的PCR产物交换连接入Age I酶切的pGC-FU真核表达载体，转化Ecoli感受态细胞，将150 μL已转化的感受态细胞转移到AMP抗性(100 μg/mL)的LB琼脂培养基上，挑取单克隆进行PCR鉴定，将阳性克隆分装200 μL，并送上海生工试剂公司测序。

用针对PAX2编码区的特异引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析显示总RNA中扩增出1 kb左右的PAX2编码区条带，与预期大小一致。

PGC-FU 载体与PAX2单酶切后，提取质粒，连接，转化，挑取单克隆，过夜培养，以PAX2-F/PAX2-R为引物进行PCR扩增，得到约408 bp左右的扩增产物，测序结果证实与模板序列一致，扩增的目的基因片段与Genebank上公布的大鼠PAX2基因序列的同源性为100%，说明目的基因和表达载体PGC-FU-PAX2真核表达质粒构建成功。

1.3 PGC-FU-PAX2真核表达质粒瞬时转染肾小管上皮细胞模型(以下简称转染模型)建立 NRK52E细胞(肾小管上皮细胞)于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清，95%湿度，5%CO2)中37℃常规培养，每周传代3次。

将处于对数生期(细胞生长汇合至80%左右时)的NRK52E细胞用0.25%Trypsin-EDTA消化后吹打成单细胞
悬液，转染前24 h接种4×105个细胞至6孔板中，使细胞于转染时达到90%～95%。

Lipofectamine-2000(Invitrogen公司)10 μL加入240 μL无血清
RPMI1640中混匀，室温放置5 min。

取PGC-FU-PAX2质粒4 μg加入无血清RPMI1640中混匀(总量250 μL)，将以上2种液体混匀后室温放置20 min。

用无血清RPMI1640洗涤细胞3次后，将质粒—脂质体混合物逐滴滴加至细胞孔中，轻轻混匀，置37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养。

分别于转染后24、48、72、96 h于荧光显微镜下计数同一视野未激发荧光时细胞总数及激发荧光时带有绿色荧光细胞个数，计算转染效率。

转染效率=绿色荧光细胞所占百分比=(绿色荧光细胞数/总细胞数)×100%。

本实验24 h转染效率为(20±5)%;48 h为(30±5)%;72 h转
染效率为(50±5)%;96 h转染效率为(10±5)%;空白对照组(不进行转染)未见绿色荧光蛋白表达。

说明转染成功，以72 h转染效率最高。

1.4 转染模型PAX2基因表达测定
1.4.1 PAX2蛋白表达采用 Western blot法。

分别收集转染后24、48、72、96
h的肾小管上皮细胞，离心沉淀后作超声破碎处理，并使蛋白变性;SDSPAGE凝胶电泳样品;电泳结束后采用转移电泳装置，于4℃，400 mA恒流条件下电转120 min，将蛋白转移到PVDF膜上;用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1 h或4℃过夜。

用封闭液稀释的一抗抗体与封闭好的PVDF膜室温孵育2 h或4℃过夜;TBST洗膜3次，每次10 min;室温下用封闭液稀释的二抗与PVDF膜孵育2 h;TBST洗膜3次，每次10 min;采用Amersham公司
ECL+plusTM，Western blotting system试剂盒进行显色;在暗房中进行获得显
示条带的胶片。

用GAPDH作内参照验证蛋白含量。

1.4.2 PAX2 mRNA表达采用RT-PCR法。

采用Trizol试剂，按说明书进行操作。

用紫外分光光度计测260 nm/280 nm的吸光度比值及样本浓度，检测提取的RNA产量及质量。

RNA反转录反应体系，经37℃ 15 min，85℃ 5 s，反转录合
成cDNA，以此为模板用 PAX2(mRNA:NM-001106361)引物经PCR方法进行扩增。

引物序列(上海生工试剂公司合成)PAX2:5'-CGGTGAGAAGAGGAAACGAG-
3'，5'-GCTTGGAAGACATCGGGATA-3'，246 bp;β-actin:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，498 bp。

扩增条件:94℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1.5 min，40 个循环;最后72℃、10 min。

2%琼脂糖凝胶电泳(75 V，1 h 20 min)，照相并保存。

2 结果
2.1 转染模型PAX2蛋白表达在蛋白电泳量基本相同的条件下，NRK52E细胞转
染PGC-FU-PAX2质粒后可观察到40～50 KDa处有条特征带，其大小与PAX2
蛋白相吻合。

PAX2基因插入片段，理论大小为～46 Kda(PAX2)，符合预期大小。

而未转染的对照组不显示，其中转染72 h蛋白表达最高(图1)。

图1 NRK52E细胞转染后PAX2蛋白表达情况注:与对照组比较，*P ＜0.05
2.2 转染模型PAX2 mRNA表达PCR示未转染的NRK52E细胞极少PAX2表达，而转染后的NRK52E细胞PAX2 mRNA呈高表达，以72 h最显著，与Western blot表达结果一致。

图像分析软件Gene Tools分析表明，24、48、72 h均扩增出目的片段，以72 h最明显(图2)。

图2 NRK52E细胞转染后PAX2 mRNA表达注:M:DNA marker，1-5:β-actin，
6-10:PAX2 基因，6:未转染对照组，7:转染后 24 h，8:转染后48 h，9:转染后72 h，10:转染后96 h;与对照组比较，*P ＜0.05
3 讨论
肾间质纤维化是所有肾脏病变发展到终末期肾功能衰竭的共同病变，是慢性肾功能衰竭发展过程的始动因素［3，4］。

UUO造成的肾梗阻是诱导肾间质纤维化经典的模型［5］，是目前应用最为广泛的研究肾间质纤维化发生机制、肾脏细胞转分化和评价肾纤维化治疗效果的实验动物模型。

EMT是上皮细胞丧失成熟细胞的标
志，是转分化为胚胎间充质细胞表型，是肾间质纤维化的重要发病机制之一;阻止
及逆转EMT将会逆转肾间质纤维化。

有报道，PAX2在病理肾中出现胎儿期的回
归表达，再表达部位主要在肾小管，可能诱导EMT，参与肾脏的损伤过程。

PAX2基因编码核转录因子，是肾脏发育的重要调控因子［6］。

后肾由输尿管芽和后肾间充质组成，在输尿管芽诱导下，PAX2在后肾间充质中表达，调节后出现 EMT ［7，8］、形成极性细胞、分化为肾单位的各个部分，所以PAX2是间质—上皮
转化的关键性因子。

PAX2基因突变时，间充质—上皮分化受阻，表明PAX2在诱导间充质细胞—上皮转分化调控中起着重要作用［9］。

近来发现，PAX2在病理
肾组织中重新表达［10～13］。

Li等［14］研究表明:在UU0模型梗阻肾中，PAX2重新表达的部位是肾小管上皮细胞，在UUO组术后3 d PAX2蛋白和mRNA在肾小管上皮细胞出现重新表达，随着梗阻时间的延长表达更加明显，术
后14 d表达显著，认为PAX2的再表达可能是启动了肾脏纤维化调控机制，激活了肾小管上皮细胞转分化的程序，其具体分子机制及信号通路有待进一步研究。

以往针对PAX2在肾纤维化方面的研究，主要集中在UUO大鼠梗阻性肾病模型，我们拟在体外进行PAX2肾小管上皮细胞转分化的具体分子机制及信号通路进行
研究，因为体内环境复杂，各通路间相互作用，相互影响。

本研究选用EGFP的PGC-FU作为报告基因，其可使目的基因在哺乳动物细胞内
持续、高效表达;可采用G418筛选已成功转染了该载体的靶细胞。

从结构上看，
该质粒具有很强的复制能力，并含有高效、功能强大的启动子Ubiquitin和CMV，可以使目的基因在增生的细胞中稳定表达，具有多克隆位点，便于目的基因的插入。

PGC-FU中的EGFP基因编码GFP，在一定波长的激发光作用下可发出绿色荧光，且无需外源性物质的参与，对细胞无毒性，可观察外源基因在活细胞中的表达，其作为理想的报告分子可借助显微镜进行动态观察。

本研究设计引物(插入Age I酶
切位点)从21 d UUO梗阻性肾病大鼠模型中提取了大鼠PAX2的全mRNA并通
过RTPCR得到全长DNA，通过电泳初步证实了该方法得到了PAX2基因，测序结果进一步证实本实验得到的PAX2基因序列与基因库中的结果相同，交换连接入Age I酶切的PGC-FU真核表达载体，经PCR及测序鉴定正确，即成功构建了PGC-FU-PAX2真核表达质粒。

本研究通过脂质体转染的方法，将重组质粒转入NRK52E细胞，转染过程中使用的脂质体转染细胞效率较高，报告基因表达时间长，实验中在荧光显微镜下观察24 h开始出现绿色荧光，48 h绿色荧光增多，72 h荧光最为明显，96 h后荧光减弱;通过Western blot法，RT-PCR、荧光检测证明转染的NRK52E细胞系在基因和蛋白水平PAX2均高表达，而未转染的NRK52E细胞有极少量的PAX2表达。

证明过表达质粒成功转染了肾小管上皮细胞并建立了PAX2过表达的肾小管上皮细胞瞬时转染模型。

在后续的实验中我们将观察其是否可使肾小管上皮细胞出现转分化;建立稳定的转染细胞系，通过信号通路蛋白的表达探讨其转分化作用机制。

本研究为阐明PAX2的转分化作用及进一步研究对其转分化调控机制奠定了实验基础。

参考文献:
【相关文献】
［1］El-Nahas AM.Plasticity of kidney cells:Role in kidney remodeling and scarring ［J］.Kindey Int，2003，64(5):1553-1563.
［2］Narlis M，Grote D，Gaitan Y，et al.PAX2 and Pax8 regulate branching morphogenesis and nephron differentiation in the developing kidney［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(4):1121-1129.
［3］Youhua L.New Insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis ［J］.J Am Soc Nephrol，2010，(21):212-222.
［4］Rastaldi MP.Epithelial-mesenchymal transition and its implications for the development of renal tubulointerstitial fibrosis［J］.J Nephrol，2006，19(4):407-412. ［5］Picard N，Baum O，Vogetseder A，et al.Origin of renal myofibro-blasts in the
model of unilateral ureter obstruction in the rat［J］.Histochem Cell Biol，2008，
130(1):141-155.
［6］Narlis M，Grote D，Gaitan Y，et al.PAX2 and Pax8 Regulate branching morphogenesis and nephron differentiation in the developing kidney［J］.Am Soc Nephrol，2007，18(4):1121-1129.
［7］Grote D，Souabni A，Busslinger M，et al.PAX2/8-regulated Gata 3 expression is necessary for morphogenesis and guidance of the nephric duct in the developing kidney ［J］.Development，2006，133(1):153-161.
［8］Bouchard M，Souabni A，Mandler M，et al.Nephfric lineage specification by PAX2 and Pax8［J］.Genes ＆ development，2002，16(22):2958-2970.
［9］Liu Y.Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis:pathologic Significance，molecular mechanism，and theraintervention［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15(1):1-10.
［10］Fukuzawa R，Eccles M，Ikeda M，et al.Embryonal hyperplasia of Bowman`s capsular epithelium in patients with WTl mutations［J］.Pediatr Nephrol，2003，18(1):9-13.
［11］Picard N，Baum O，Vogetseder A，et al.Origin of renal myofibroblasts in the model of unilateral ureter obstruction in the rat［J］.Histochem Cell Biol，2008，
130(1):141-155.
［12］Letavernier E，Bruneval P，Mandet C，et al.High sirolimns levels may induce focal segmental glomerulosclerosis de novo［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2007，2(2):326-333. ［13］皮蕾，姜傥，欧阳涓，等.PAX2基因在肾小管上皮细胞转分化中的作用［J］.中华中医学杂志，2007，31(1):7-10.
［14］Li L，Wu YB，Zhang WG.PAX2 re-expression in renal tubular epithelial cells and correlation with renal interstitial fibrosis of rats with obstructive nephropathy［J］.Ren Fail，2010，32(5):603-611.。