构建靶向基因重组载体干预金_属硫蛋白表达及其对鼻咽癌细胞毒性转归的影响

中…大学硕二卜学位皓文构建靶向基因重组载体干预金属硫蛋白表达及其对鼻¨因癌细胞毒性转归的影响
ｈＭＴ－ＩＢ（ＦｒｏｍＧｅｎｅｂａｎｋ：丛丛一塑５塑Ｚ）（４０４ｂｐ）
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图１－２人ＭＴ－１Ｂ基因ｍＲＮＡ序列及核酶设计和ＲＴ－ＰＣＲ引物位置图示
ｈＭＴ－２Ａ（ＦｒｏｍＧｅｎｅｂａｎｋ：丛丛一ＱＱ５１５３＆旦￡ＱＱ２塑±）（４５１ｂｐ）
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图１－３人ＭＴ－２Ａ基因ｍＲＮＡ序列及核酶设计和ＲＴ－ＰＣＲ引物位置图示
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图１－４靶向ＭＴ核酶序列二级结构Ｍｆｏｌｄ分析示意图
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图Ｉ．５ＭＴｌＢ．Ｒｚ序列及二级结构示例
中山大学硕一Ｉ一学位沦文构熊靶向基因重组载体干预金属硫蛋日表选强其对鼻ＩｌＷｊ出荆胞霉性转归纳影响
图１—６ＭＴ－Ｒｚ双链片段ＰＣＲ产物凝胶电泳图
泳道１、２、４、７、９、２５ｂｐｌａｄｄｅｒ；
ＭＴ－ＩＢ—Ｒｚ．ＧｏｌｄｅｎＴａｑ；
ＭＴ－２Ａ－Ｒｚ，ＯｏｌｄｅｎＴａｑ；ＭＴ＿ｌＢ—ｍＲｚ，ＧｏｌｄｅｎＴａｑ；ＭＴ－２Ａ·ｍＲｚ，ＧｏｌｄｅｎＴａｑｌ
６、５０ｂｐｌａｄｄｅｒ；３、ＭＴ－１Ｂ—Ｒｚ，ＲＥＤＴａｑ；５、ＭＴ－２Ａ－Ｒｚ．，ＲＥＤＴａｑ；
８、ＭＴ－ＩＢ—ｍＲｚ，ＲＥＤＴａｑ；
１０、ＭＴ－２Ａ—ｍＲｚ，ＲＥＤ‘ｌ＇ａｑ图Ｉ．７ＭＴ－ＲｚＸ＇ｈｏｌ酶切片段¨连接产物凝胶电冰斟
泳道ｉ、２００ｂｐｓｉｚｅｍａｒｋｅｒ２、２５ｂｐｌａｄｄｅｒ；３、ＭＴｌＢＲｚ：
７、ＭＴｌＢｍＲｚ；
１０、１００ｂｖｌａｄｄｅｒ：４、ＭＴ２ＡＲｚ；８、ＭＴ２ＡｍＲｚ；ＩＩ、２００ｂｐｓｉｚｅｍａｒｋｅｒ６、５０ｂｐｌａｄｄｅｒ；
５、ＭＴｌＢ２ＡＲｚ；９、ＭＴｌＢ２ＡｍＲｚ；
图１．８ＭＴ－］Ｂ和．２Ａ串联核酶ＰｃＲＪ卜物凝胶电泳图
ＭＩ、Ｍ３：２００ｂｐｓｉｚｅｍａｒｋｅｒ：№：５０ｂｐ
ｌａｄｄｅｒ
中ｔｈ大学碗一ｋ学位论』［构建靶向耩因亚组载体干预盘属硫蛋自表达厦就对鼻咽癌细胞毒性转归的蟛响
图２—２ｐＧＥＭＴｅａｓｙ—ＭＴ－Ｒｚ转化ＸＬ］一Ｂｌｕｅ超感受态细胞克隆形成示意图
图２－３ｐＴ－ＭＴ－Ｒｚ克隆Ｔ７／ＳＰ６ＰＣＲｊ＋，：物凝胶电泳结果
图２－４靶向核酶Ｔ载体的质粒纯化电泳结果
ｍ§ｉｐＴ－ＭＴＩＢ—Ｒｚ；２．ｐＴ－ＭＴｌＢ－ｍＲｚ：３ｐ＇ｆ－ＭＴ２Ａ－Ｒｚ；４，ｐＴ－ＭＴ２ＡｏｍＲｚ
±坐查堂堡兰堂堡堡兰塑堡型塑壁里垩塑垡苎：！塑垒璺堕堑堕查姿丝苎堕墨！！生塑丝童堡堕塑堕丝业
２．２．１．５ｐＧＥＭ－＇ｌｅａｓｙ．ＭＢＲｚ质粒ＤＮＡ酶切分析结果
所获得的质粒ＤＮＡ分别经艮。

刷酶切、电泳成像分析，结果可见：含目的插入片段的阳性质粒，在ｐＴ－ＭＴＩＢ－Ｒｚ或ｍＲｚ：ｐ可获得８９ｂｐ和２９９７ｂｐ的酶切片段；存ｐＴ－ＭＴ２Ａ—Ｒｚ或一ｍＲｌ＝｜＝Ｉ叫获得９０ｂｐ和２９９７ｂｐ的酶切片段。

阳性质税ＤＮＡ分蜘经设计的特异性酶切位点酶切，如图２—５所示，在ｐ１二ＭＴｌＢ—Ｒｚ或．ｍＲｚＩｐ盯获得６５ｂｐ和３０２１ｂｐＯｑ酶切片段：在ｐＴ＿ＭＴ２Ａ－ＲｚＥＪ：一ｍＲｚ中可获得６６ｂｐ和３０２１ｂｐ的酶切片段；在ｐＴ－ＭＴｌＢ２Ａ—Ｒ２或一ｍＲｚ中可获得１２７ｂｐ和３０２１ｂｐ的酶切片段，表明１５的片段成功克隆入Ｔ载体－：｜＝ｌｏ
Ｉ２３４５６７８９１０ｌｌｌ：１３１４１５
图２５口Ｔ－ＭＴ－Ｒｚ质粒职酶切产物电泳结果ＬＩ．１ｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ５００，１０００，１５００．２０００．３０００；
Ｌ２．ＤＴ－Ｍ１Ｂ—Ｒｚ：１，３用ＮｈｅＶＸｈｏｌ成功酶切的ｐＴ－ＭＩＢ·Ｒｚ质粒样本；
１１４．ｐＴ－Ｍ２Ａ．Ｒｚ，Ｌ５．用ＸｈｏＩ／ＭｌｕＩ成功酶切的ｐＴ－Ｍ２Ａ·Ｒｚ质粒样本；
Ｌ６．ｐＴ－Ｍ１Ｂ２Ａ—Ｒ２：Ｌ７用ＮｈｅＵＭｌｕｌ成功酶切的ｐＴ－ＭＩＢ２Ａ—Ｒｚ质牲样本：
Ｉ，９ｐＴ－ＭＩＢ—ｍＲｚ：Ｌ１０用ＮｈｅＩ／Ｘｈｏｌ成功酶切的ｆｆｒ－Ｍ１Ｂ－ｍＲｚ质粒样本，
Ｌ１１．ｉＰＭ２Ａ－ｔ·ｔ＆－．ｚ；Ｌ１２．用枷Ｕ＾孤ｌ成功酶切的ｐＴ－Ｍ２Ａｕ６｝ｚ质粒样本；
Ｌ１３ＤＴ－Ｍ１８２Ａ．ｍＲｚ；Ｌ１４．用ＮｈｅＵ～ｌｌｕｌ成功酶切的ｐＴ－Ｍ１８２Ａ－ｍＲｚ质粒样率
Ｌ１５Ｊ００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＬ８２５ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ；
中山犬半硕士学位皓文袖建靶向磐田重组载体干预盎届硫蛋白表达及其列鼻咽摘自Ｈ胞毒住转归的蜉响
２．２．１．６ｐＧＥＭ．Ｔｅａｓｙ．ＭＴ＿毗质粒ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增鉴定结果
如图２．６所示，第３、５、７、１０、１２、１４泳道以合成各核酶的特异性引物对进｛ＴＰＣＲ扩增，各自得到相应的Ｆ１的祭带，与预计相符，证丈重组质粒中含有相应的目的核酶序殉；第２、４、６、９、ＩＩ、Ｉ３泳道以ｐＧＥＭ—Ｔ载体Ｌ的ＴＴ／ＳＰ６通Ｊ＝｝＿ｉ引物进行ＰＣＲ扩增，各自得到相应的目的条带，与预计相符，证实重组质粒中所含的曰的核酶序列插入在Ｔ７／ＳＰ６之间的多克隆位点（Ｍｃｓ）内；而第ｌ５泳道ＮＪｐＧＥＭ．Ｔ空载体用Ｔ７／ＳＰ６扩增，得到１７５ｂｐ大小的条带，也与预计相符。

图２－６ｐＴ－ＭＴ－Ｒｚ质粒ＤＮＡｐｅｒ鉴定电泳结果
Ｌ１ｌＯＯｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ（５１ａＦｌａｎｅ）；Ｌ８．２５ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ；１６１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ
Ｌ２．ＤＴ－ＭＴＩＢ—ＲｚＴ７／ＳＰ６ＰＣＲ；Ｌ３．ｐＴ－ＭＴｌＢ—ＲｚＣＦＩ／（２ＲＩＰＣＲ，
Ｌ４．ｐＴ－ＭＴ２Ａ－ＲｚＴ７／ＳＰ６ＰＣＲ；Ｌ５．ｐＴ－ＭＴ２Ａ—ＲｚＣＦ２，ＣＲ２ＰＣＲ．
Ｌ６．ｐＴ－ＭＴｌＢ２Ａ—ＲｚＴ７／ＳＰ６ＰＣＲ：Ｌ７．ｐＴ－ＭＴＩＢ２Ａ—ＲｚＣＦｌ忙Ｒ２ＰＣＲ；
Ｌ９．ｐＴ＿ＭＴｌＢ—ｍＲｚＴ７，ｓＰ６ＰＣＲ；Ｌ１０．ｐＴ－ＭＴＩＢ—ｍＲｚＣＦｌ，ｃＲｌＰＣＲ；
Ｌ１ｌｐＴ－ＭＴ２Ａ—ｍＲｚＴ７／ＳＰ６ＰＣＲ；Ｌ１２ｐＴ－ＭＴ２Ａ—ｍＲｚＣＦ２／ＣＲ２ＰＣＲ；
Ｌ１’ＤＴ＿ＭＴＩＢ２Ａ－ｍＲｚＴ７／ＳＰ６ＰＣＲ；ｌ１４ｐＴ－ＭＴｌＢ２Ａ－ｍＲｚＣＦｌ／１２Ｒ２ＰＣＲ；
Ｌ１５ＤＴｅａｓｙＬｉｇａｔｅＴ７／ＳＰ６ＰＣＲ；
２．２．１．８ｐＧＥＭ．Ｔｅａｓ）＇．ＭＴ－Ｒｚ质粒ＤＮＡ的Ｔ７和ＳＰ６测序结果
用Ｔ载体上的Ｔ７和ＳＰ６对ｐＧＥＭ．Ｔｅａｓｙ．ＭＴ－Ｒｚ或．ｍＲｚ进行双向测序，结果可见质粒ＤＮＡ均可被Ｔ７和ｓＰ６引物扩增和清晰测序，图２—７、图２８、图２－９分别为ｐＴ－ＭＴ２ＡＲｚ、ｐＴ－ＭＴｌＢ—ＲｚｊｆｌｐＴ－ＭＴｌＢ２Ａ—Ｒｚ质粒ＤＮＡＴ７或ＳＰ６测序结果图，其他质粒ＤＮＡｉ则序结果图从略。

从图巾分别可见，合成的ＭＴ２Ａ．Ｒｚ、Ｍｒ【ｌＢ．Ｒ２和ＭＴｌＢ２Ａ－Ｒｚ目的片段均被正确地正向或逆向克隆入Ｔ载体叫Ｊ，序列碱基分析显示与设计的靶向核酶序列完全一致。

汪实核酶序列的Ｔ载体克隆成功。