橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析

橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析作者：纪向云印汉任小青李德军夏志辉
来源：《热带作物学报》2021年第12期
摘要：小熱激蛋白（small heat shock protein， sHSP）是一类胁迫诱导蛋白，不仅参与植物发育还响应生物与非生物胁迫。

本研究通过分析转录组数据获得橡胶树12个sHSP基因家族成员。

生物信息学分析和表达谱分析结果表明：蛋白保守结构预测显示12个sHSP均具有α-晶体蛋白保守结构域;二级结构预测结果显示，12个sHSP均由α-螺旋、β-转角、延伸链和大量的随机卷曲组成。

通过RT-PCR技术分析，结果发现这12个sHSP家族基因在橡胶树不同组织和叶片不同发育时期中表达有明显差异，HbsHSP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP17.3、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.5、HbsHSP22.6和HbsHSP23.9在胶乳中高表达，HbsHSP17.4在树皮中高表达，HbsHSP17.5a在树茎中高表达，HbsHSP25.8则在树叶中表达量最高。

乙烯利处理后，12个sHSP家族基因的表达总体呈下降趋势。

在不同死皮等级橡胶树中12个sHSP家族基因的表达也具有明显差异，与健康树相比，HbsHSP15.8、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.6、HbsHSP23.9和HbsHSP25.8在死皮树中的表达量呈下降趋势;HbsHSP16.2、HbsHSP17.3和HbsHSP22.5的表达量呈上升趋势。

因此推测橡胶树sHSP家族基因可能参与橡胶树生物与非生物逆境胁迫响应，以及可能在乙烯作用途径中发挥作用。

关键词：橡胶树;小热激蛋白;表达谱分析;胁迫响应
中图分类号：Q813.3 文献标识码：A
Abstract： Small heat shock protein （sHSP） is a type of stress-inducing protein that not only participates in plant development but also responds to biotic and abiotic stresses. In this study， 12 sHSP gene family members of Hevea brasiliensis were obtained by analyzing transcriptome data. The results of bioinformatics analysis and expression profile analysis showed that all 12 sHSPs had α-crystallin conserved domains. The secondary structure prediction results showed that the 12 sHSPs were all composed of α-helix，β-turn， extended strand and a great quantity of random coils. RT-PCR analysis showed the expression of the 12 sHSP family genes in different tissues and developmental stages were significantly different， HbsHSP15.8， HbsHSP16.2， HbsHSP17.3，HbsHSP17.4， HbsHSP17.5b， HbsHSP18.2， HbsHSP18.3， HbsHSP22.5， HbsHSP22.6 and HbsHSP23.9 were highly expressed in latex， HbsHSP17.4 was highly expressed in bark，HbsHSP17.5a was highly expressed in tree stems， and HbsHSP25.8 was highly expressed in leaves. After ethephon treatment， the expression of the 12 sHSPs family genes showed an overall downward trend. The expression of the 12 sHSPs family genes in H. brasiliensis of different tapping panel dryness grades was also significantly different. The expression levels of HbsHSP15.8，
HbsHSP17.4， HbsHSP17.5a， HbsHSP17.5b， HbsHSP18.2， HbsHSP18.3， HbsHSP22.6，HbsHSP23.9 and HbsHSP25.8 in diseased trees were significantly lower than that in healthy trees. The expression levels of HbsHSP16.2， HbsHSP17.3 and HbsHSP22.5 were significantly higher than that of healthy trees. It indicates that the sHSP family genes of H. brasiliensis may be involved in the response of rubber tree to biotic and abiotic stresses， and they may play an important role in ethylene pathway.
Keywords： Hevea brasiliensis; small heat shock protein; expression profiles analysis; stress response
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.007
热激蛋白（heat shock protein， HSP）又称热休克蛋白，是指生物体遭受物理、化学和生物等胁迫刺激后，大量表达或者新合成的一类高度保守的蛋白质。

HSP广泛存在于各种生物体内，在结构上高度保守，根据分子量大小将HSP分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、sHSP家族[1]。

小热激蛋白（small heat shock protein， sHSP）是植物中含量最丰富的热激蛋白，分子量约为12～ 42 kDa，多数为15～27 kDa。

植物sHSP由核内多基因家族编码，并且其sHSP的数量因植物种类而异。

如拟南芥有19个sHSP[2]，水稻有23个sHSP[3]，杨树有36个sHSP[4]，辣椒有35个sHSP[5]，番茄有42个sHSP[6]。

在正常生长情况下，植物组织中sHSP基因家族表达量非常低，而一旦热激或其它逆境胁迫诱导刺激，sHSP基因家族的表达量迅速增加，同时生物体对逆境胁迫的耐受能力也会提
高。

水稻多重应激反应基因3（multiple stress-responsive gene 3， OsMSR3）是一个sHSP基因，其表达在提高拟南芥对金属离子镉胁迫的耐受性的同时也增加了抗氧化相关基因的表达[7];在拟南芥中过表达茶树CsHSP17.2，可显著提高转基因拟南芥在热激胁迫下的存活率[8];甘蔗sHSP通过硅胁迫可诱导甘蔗抗旱性提高[9]。

sHSP家族能够行使各种不同的功能，核心在于其具有分子伴侣活性。

豌豆中线粒体sHSP22表现为一种保持酶，可与其他蛋白质共沉淀，以帮助缓解在热胁迫适应过程中其他分子伴侣的分解和重折叠[10]。

此外，sHSP具有调节植物发育的功能，如VvHSP20s参与了葡萄浆果的发育[11];而SlHSP17.7和糖可相互作用以调节番茄果实的发育，并影响番茄的品质[12]。

因此，植物sHSP是一类具有多样化功能的小分子蛋白。

巴西橡胶树又名三叶橡胶，多年生常绿落叶大乔木，原产于拉丁美洲的亚马逊流域。

由于病害、台风、干旱和低温等逆境胁迫，使得橡胶树干胶产量严重下降。

因此，研究橡胶树抗逆机制具有十分重要的意义。

鉴于sHSP基因家族在植物抵抗逆境胁迫响应中的重要作用，及其在进化和功能上的高度保守，推测sHSP基因家族可能在橡胶树抗逆境胁迫中发挥重要作用。

以往有关植物sHSP家族基因的研究主要集中在拟南芥、水稻、番茄和杨树等植物中，关于多年生热带植物中的sHSP研究鲜有报道。

目前，在橡胶树中，sHSP基因家族成员是否响应生物或非生物胁迫还未见系统报道。

本研究系统研究橡胶树sHSP家族中12个sHSP基因家族成员的生物信息学和表达模式，为深入研究sHSP家族基因在橡胶树抗逆镜胁迫中的功能奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）‘热研7-33-97’品系幼树购自于中国热带农业科学院橡胶研究所，乙烯利处理参照Hao等[13]的方法，处理浓度为1%，以不做任何处理的幼树为对照，采集处理后0、4、8、24、48、72 h树皮;本研究中橡胶树不同组织材料均取自‘热研7-33-97’健康树，以上样品分别设置至少3个生物学重复。

以‘热研8-79’健康树、2～3级和4～5级死皮树为材料提取树皮的RNA，由中国热带农业科学院橡胶研究所李德军研究员赠予。

RNA 提取试剂盒购自百泰克;反转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购自天根公司;所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其余试剂药品购于索莱宝公司;荧光定量PCR仪器为瑞士Roche公司的LightCycler® 96。

1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成按照通用植物总RNA提取试剂盒（RP3001）提取橡胶树不同组织总RNA，对总RNA进行定量和电泳检测，样品cDNA第一链合成按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）说明书进行。

1.2.2 橡胶树sHSP基因家族成员的命名与生物信息学分析课题组前期获得橡胶树转录组数据[14]，通过分析获得12个橡胶树sHSP家族基因;通过ExPASy网站中的在线程序ProtParam分析蛋白质的基本性质;利用NCBI中Conserved Domain Database预测蛋白保守结构域;通过SOPMA在线工具预测蛋白的二级结构。

1.2.3 橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析采用罗氏LightCycler® 96的RT-PCR系统对12个橡胶树sHSP基因家族的表达模式进行分析。

以分别稀释10倍的各样品cDNA为模板，
Hbβ-actin为内参，使用各sHSP基因特异性引物进行RT-PCR分析。

反应总体系为20 μL，其中包括4.0 μL mix，上下游熒光定量特异性引物（10 μmol/L）各0.6 μL，cDNA模板1.0 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性15 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。

每个样品重复3次，采用2–ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

使用SPSS 26.0软件对数据进行差异显著性分析，用Excel 2019软件制图。

本研究所用的引物序列见表1。

2 结果与分析
2.1 sHSP基因家族的命名与生物信息学分析
Keywords： Hevea brasiliensis; small heat shock protein; expression profiles analysis; stress response
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.007
热激蛋白（heat shock protein， HSP）又称热休克蛋白，是指生物体遭受物理、化学和生物等胁迫刺激后，大量表达或者新合成的一类高度保守的蛋白质。

HSP广泛存在于各种生物体内，在结构上高度保守，根据分子量大小将HSP分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、sHSP家族[1]。

小热激蛋白（small heat shock protein， sHSP）是植物中含量最丰富的热激蛋白，分子量约为12～ 42 kDa，多数为15～27 kDa。

植物sHSP由核内多基因家族编码，并且其sHSP的数量因植物种类而异。

如拟南芥有19个sHSP[2]，水稻有23个sHSP[3]，杨树有36个sHSP[4]，辣椒有35个sHSP[5]，番茄有42个sHSP[6]。

在正常生长情况下，植物组织中sHSP基因家族表达量非常低，而一旦热激或其它逆境胁迫诱导刺激，sHSP基因家族的表达量迅速增加，同时生物体对逆境胁迫的耐受能力也会提高。

水稻多重應激反应基因3（multiple stress-responsive gene 3， OsMSR3）是一个sHSP基因，其表达在提高拟南芥对金属离子镉胁迫的耐受性的同时也增加了抗氧化相关基因的表达[7];在拟南芥中过表达茶树CsHSP17.2，可显著提高转基因拟南芥在热激胁迫下的存活率[8];甘蔗sHSP通过硅胁迫可诱导甘蔗抗旱性提高[9]。

sHSP家族能够行使各种不同的功能，核心在于其具有分子伴侣活性。

豌豆中线粒体sHSP22表现为一种保持酶，可与其他蛋白质共沉淀，以帮助缓解在热胁迫适应过程中其他分子伴侣的分解和重折叠[10]。

此外，sHSP具有调节植物发育的功能，如VvHSP20s参与了葡萄浆果的发育[11];而SlHSP17.7和糖可相互作用以调节番
茄果实的发育，并影响番茄的品质[12]。

因此，植物sHSP是一类具有多样化功能的小分子蛋白。

巴西橡胶树又名三叶橡胶，多年生常绿落叶大乔木，原产于拉丁美洲的亚马逊流域。

由于病害、台风、干旱和低温等逆境胁迫，使得橡胶树干胶产量严重下降。

因此，研究橡胶树抗逆机制具有十分重要的意义。

鉴于sHSP基因家族在植物抵抗逆境胁迫响应中的重要作用，及其在进化和功能上的高度保守，推测sHSP基因家族可能在橡胶树抗逆境胁迫中发挥重要作用。

以往有关植物sHSP家族基因的研究主要集中在拟南芥、水稻、番茄和杨树等植物中，关于多年生热带植物中的sHSP研究鲜有报道。

目前，在橡胶树中，sHSP基因家族成员是否响应生物或非生物胁迫还未见系统报道。

本研究系统研究橡胶树sHSP家族中12个sHSP基因家族成员的生物信息学和表达模式，为深入研究sHSP家族基因在橡胶树抗逆镜胁迫中的功能奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）‘热研7-33-97’品系幼树购自于中国热带农业科学院橡胶研究所，乙烯利处理参照Hao等[13]的方法，处理浓度为1%，以不做任何处理的幼树为对照，采集处理后0、4、8、24、48、72 h树皮;本研究中橡胶树不同组织材料均取自‘热研7-33-97’健康树，以上样品分别设置至少3个生物学重复。

以‘热研8-79’健康树、2～3级和4～5级死皮树为材料提取树皮的RNA，由中国热带农业科学院橡胶研究所李德军研究员赠予。

RNA 提取试剂盒购自百泰克;反转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购自天根公司;所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其余试剂药品购于索莱宝公司;荧光定量PCR仪器为瑞士Roche公司的LightCycler® 96。

1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成按照通用植物总RNA提取试剂盒（RP3001）提取橡胶树不同组织总RNA，对总RNA进行定量和电泳检测，样品cDNA第一链合成按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）说明书进行。

1.2.2 橡胶树sHSP基因家族成员的命名与生物信息学分析课题组前期获得橡胶树转录组数据[14]，通过分析获得12个橡胶树sHSP家族基因;通过ExPASy网站中的在线程序ProtParam分析蛋白质的基本性质;利用NCBI中Conserved Domain Database预测蛋白保守结构域;通过SOPMA在线工具预测蛋白的二级结构。

1.2.3 橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析采用罗氏LightCycler® 96的RT-PCR系统对12个橡胶树sHSP基因家族的表达模式进行分析。

以分别稀释10倍的各样品cDNA为模板，
Hbβ-actin为内参，使用各sHSP基因特异性引物进行RT-PCR分析。

反应总体系为20 μL，其中包括4.0 μL mix，上下游荧光定量特异性引物（10 μmol/L）各0.6 μL，cDNA模板1.0 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性15 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。

每个样品重复3次，采用2–ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

使用SPSS 26.0软件对数据进行差异显著性分析，用Excel 2019软件制图。

本研究所用的引物序列见表1。

2 结果与分析
2.1 sHSP基因家族的命名与生物信息学分析
Keywords： Hevea brasiliensis; small heat shock protein; expression profiles analysis; stress response
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.007
热激蛋白（heat shock protein， HSP）又称热休克蛋白，是指生物体遭受物理、化学和生物等胁迫刺激后，大量表达或者新合成的一类高度保守的蛋白质。

HSP广泛存在于各种生物体内，在结构上高度保守，根据分子量大小将HSP分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、sHSP家族[1]。

小热激蛋白（small heat shock protein， sHSP）是植物中含量最丰富的热激蛋白，分子量约为12～ 42 kDa，多数为15～27 kDa。

植物sHSP由核内多基因家族编码，并且其sHSP的数量因植物种类而异。

如拟南芥有19个sHSP[2]，水稻有23个sHSP[3]，杨树有36个sHSP[4]，辣椒有35个sHSP[5]，番茄有42个sHSP[6]。

在正常生长情况下，植物组织中sHSP基因家族表达量非常低，而一旦热激或其它逆境胁迫诱导刺激，sHSP基因家族的表达量迅速增加，同时生物体对逆境胁迫的耐受能力也会提高。

水稻多重应激反应基因3（multiple stress-responsive gene 3， OsMSR3）是一个sHSP基因，其表达在提高拟南芥对金属离子镉胁迫的耐受性的同时也增加了抗氧化相关基因的表达[7];在拟南芥中过表达茶树CsHSP17.2，可显著提高转基因拟南芥在热激胁迫下的存活率[8];甘蔗sHSP通过硅胁迫可诱导甘蔗抗旱性提高[9]。

sHSP家族能够行使各种不同的功能，核心在于其具有分子伴侣活性。

豌豆中线粒体sHSP22表现为一种保持酶，可与其他蛋白质共沉淀，以帮助缓解在热胁迫适应过程中其他分子伴侣的分解和重折叠[10]。

此外，sHSP具有调节植物发育的功能，如VvHSP20s参与了葡萄浆果的发育[11];而SlHSP17.7和糖可相互作用以调节番茄果实的发育，并影响番茄的品质[12]。

因此，植物sHSP是一类具有多样化功能的小分子蛋白。

巴西橡胶树又名三叶橡胶，多年生常绿落叶大乔木，原产于拉丁美洲的亚马逊流域。

由于病害、台风、干旱和低温等逆境胁迫，使得橡胶树干胶产量严重下降。

因此，研究橡胶树抗逆机制具有十分重要的意义。

鉴于sHSP基因家族在植物抵抗逆境胁迫响应中的重要作用，及其在进化和功能上的高度保守，推测sHSP基因家族可能在橡胶树抗逆境胁迫中发挥重要作用。

以往有关植物sHSP家族基因的研究主要集中在拟南芥、水稻、番茄和杨树等植物中，关于多年生热带植物中的sHSP研究鲜有报道。

目前，在橡胶树中，sHSP基因家族成员是否响应生物或非生物胁迫还未见系统报道。

本研究系统研究橡胶树sHSP家族中12个sHSP基因家族成员的生物信息学和表达模式，为深入研究sHSP家族基因在橡胶树抗逆镜胁迫中的功能奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）‘热研7-33-97’品系幼树购自于中国热带农业科学院橡胶研究所，乙烯利处理参照Hao等[13]的方法，处理浓度为1%，以不做任何处理的幼树为对照，采集处理后0、4、8、24、48、72 h树皮;本研究中橡胶树不同组织材料均取自‘热研7-33-97’健康树，以上样品分别设置至少3个生物学重复。

以‘热研8-79’健康树、2～3级和4～5级死皮树为材料提取树皮的RNA，由中国热带农业科学院橡胶研究所李德军研究员赠予。

RNA 提取试剂盒购自百泰克;反转录试剂盒和荧光定量试剂盒均購自天根公司;所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其余试剂药品购于索莱宝公司;荧光定量PCR仪器为瑞士Roche公司的LightCycler® 96。

1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成按照通用植物总RNA提取试剂盒（RP3001）提取橡胶树不同组织总RNA，对总RNA进行定量和电泳检测，样品cDNA第一链合成按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）说明书进行。

1.2.2 橡胶树sHSP基因家族成员的命名与生物信息学分析课题组前期获得橡胶树转录组数据[14]，通过分析获得12个橡胶树sHSP家族基因;通过ExPASy网站中的在线程序ProtParam分析蛋白质的基本性质;利用NCBI中Conserved Domain Database预测蛋白保守结构域;通过SOPMA在线工具预测蛋白的二级结构。

1.2.3 橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析采用罗氏LightCycler® 96的RT-PCR系统对12个橡胶树sHSP基因家族的表达模式进行分析。

以分别稀释10倍的各样品cDNA为模板，
Hbβ-actin为内参，使用各sHSP基因特异性引物进行RT-PCR分析。

反应总体系为20 μL，其中包括4.0 μL mix，上下游荧光定量特异性引物（10 μm ol/L）各0.6 μL，cDNA模板1.0 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性15 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。

每个样品重复3次，采用2–ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

使用SPSS 26.0软件对数据进行差异显著性分析，用Excel 2019软件制图。

本研究所用的引物序列见表1。

2 结果与分析
2.1 sHSP基因家族的命名与生物信息学分析
Keywords： Hevea brasiliensis; small heat shock protein; expression profiles analysis; stress response
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.007
热激蛋白（heat shock protein， HSP）又称热休克蛋白，是指生物体遭受物理、化学和生物等胁迫刺激后，大量表达或者新合成的一类高度保守的蛋白质。

HSP广泛存在于各种生物体内，在结构上高度保守，根据分子量大小将HSP分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、sHSP家族[1]。

小热激蛋白（small heat shock protein， sHSP）是植物中含量最丰富的热激蛋白，分子量约为12～ 42 kDa，多数为15～27 kDa。

植物sHSP由核内多基因家族编码，并且其sHSP的数量因植物种类而异。

如拟南芥有19个sHSP[2]，水稻有23个sHSP[3]，杨树有36个sHSP[4]，辣椒有35个sHSP[5]，番茄有42个sHSP[6]。

在正常生长情况下，植物组织中sHSP基因家族表达量非常低，而一旦热激或其它逆境胁迫诱导刺激，sHSP基因家族的表达量迅速增加，同时生物体对逆境胁迫的耐受能力也会提高。

水稻多重应激反应基因3（multiple stress-responsive gene 3， OsMSR3）是一个sHSP基因，其表达在提高拟南芥对金属离子镉胁迫的耐受性的同时也增加了抗氧化相关基因的表达[7];在拟南芥中过表达茶树CsHSP17.2，可显著提高转基因拟南芥在热激胁迫下的存活率[8];甘蔗sHSP通过硅胁迫可诱导甘蔗抗旱性提高[9]。

sHSP家族能够行使各种不同的功能，核心在于其具有分子伴侣活性。

豌豆中线粒体sHSP22表现为一种保持酶，可与其他蛋白质共沉淀，以帮助缓解在热胁迫适应过程中其他分子伴侣的分解和重折叠[10]。

此外，sHSP具有调节植物发育的功能，如VvHSP20s参与了葡萄浆果的发育[11];而SlHSP17.7和糖可相互作用以调节番茄果实的发育，并影响番茄的品质[12]。

因此，植物sHSP是一类具有多样化功能的小分子蛋白。

巴西橡胶树又名三叶橡胶，多年生常绿落叶大乔木，原产于拉丁美洲的亚马逊流域。

由于病害、台风、干旱和低温等逆境胁迫，使得橡胶树干胶产量严重下降。

因此，研究橡胶树抗逆机制具有十分重要的意义。

鉴于sHSP基因家族在植物抵抗逆境胁迫响应中的重要作用，及其在进化和功能上的高度保守，推测sHSP基因家族可能在橡胶树抗逆境胁迫中发挥重要作用。

以往有关植物sHSP家族基因的研究主要集中在拟南芥、水稻、番茄和杨树等植物中，关于多年生热带植物中的sHSP研究鲜有报道。

目前，在橡胶树中，sHSP基因家族成员是否响应生物或非生物胁迫还未见系统报道。

本研究系统研究橡胶树sHSP家族中12个sHSP基因家族成员的生物信息学和表达模式，为深入研究sHSP家族基因在橡胶树抗逆镜胁迫中的功能奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）‘热研7-33-97’品系幼树购自于中国热带农业科学院橡胶研究所，乙烯利处理参照Hao等[13]的方法，处理浓度为1%，以不做任何处理的幼树为对照，采集处理后0、4、8、24、48、72 h树皮;本研究中橡胶树不同组织材料均取自‘热研7-33-97’健康树，以上样品分别设置至少3个生物学重复。

以‘热研8-79’健康树、2～3级和4～5级死皮树为材料提取树皮的RNA，由中国热带农业科学院橡胶研究所李德军研究员赠予。

RNA 提取试剂盒购自百泰克;反转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购自天根公司;所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其余试剂药品购于索莱宝公司;荧光定量PCR仪器为瑞士Roche公司的LightCycler® 96。

1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成按照通用植物总RNA提取试剂盒（RP3001）提取橡胶树不同组织总RNA，对总RNA进行定量和电泳检测，样品cDNA第一链合成按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）说明书进行。

1.2.2 橡胶树sHSP基因家族成员的命名与生物信息学分析课题组前期获得橡胶树转录组数据[14]，通过分析获得12个橡胶树sHSP家族基因;通过ExPASy网站中的在线程序ProtParam分析蛋白质的基本性质;利用NCBI中Conserved Domain Database预测蛋白保守结构域;通过SOPMA在线工具预测蛋白的二级结构。

1.2.3 橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析采用罗氏LightCycler® 96的RT-PCR系统对12个橡胶树sHSP基因家族的表达模式进行分析。

以分别稀释10倍的各样品cDNA为模板，
Hbβ-actin为内参，使用各sHSP基因特异性引物进行RT-PCR分析。

反应总体系为20 μL，其中包括4.0 μL mix，上下游熒光定量特异性引物（10 μmol/L）各0.6 μL，cDNA模板1.0 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性15 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。

每个样品重复3次，采用2–ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

使用SPSS 26.0软件对数据进行差异显著性分析，用Excel 2019软件制图。

本研究所用的引物序列见表1。

2 结果与分析
2.1 sHSP基因家族的命名与生物信息学分析。