X射线激活氧化应激诱导DNA损伤及HaCaT发生细胞早衰研究

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Study on OS-induced DNA damage from X-ray activation and cellular premature aging of HaCaT cells/Chen Jie, Cai Tianjing, Zhao Hua, Gao Ling, Liu Qingjie
Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency, China CDC, National Institute for Radiological Protection, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100088, China Corresponding author: [Abstract] Objective: T o explore the changes of oxidative stress (OS), DNA damage and the occurrence of cellular premature aging of human immortalized keratinocytes (HaCaT) after that was radiated by X-ray with different doses. Methods: HaCaT cells were radiated by X-ray, and they were divided into 0 Gy group, 5 Gy group and 10 Gy group according to the irradiation dose. The levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected by 2,7-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) fluorescent probe, and the intracellular content of malondialdehyde (MDA) of lipid peroxidation products and the activity of superoxide dismutase (SOD) were measured by colorimetry. Immunofluorescence staining was used to detect the phosphorylated histone 2A variant (γ-H2AX) in HaCaT cells that were radiated by X-ray with different doses. Cell count kit-8 (CCK-8) was used to detect the effect of X-ray with different doses on the proliferation of HaCaT cells after X-ray with different doses radiated them. β-Galactosidase staining was used to detect the proportion of premature aging cells. The changes of p21 and p53 protein expressions after X-ray irradiation were detected by W estern blot. Results: After HaCaT cells were radiated by X-ray for 24h, the fluorescence intensity of 2',7'-Dichlorofluorescein (DCF) in 5 Gy and 10 Gy groups were significantly higher than that in the 0 Gy group, and the MDA contents of them were significantly higher than that in the control group, and the SOD activities of them were significantly lower than that in the control group (F =38.35, 92.22, 5.22, P <0.05), respectively. The change of γ-H2AX focus showed a dose-dependent significant increase at 1 h after irradiation, and the difference between them and control group was statistically significant (F =129.3, P <0.05). At 6h, 24h and 48h after X-ray radiated HaCaT cells, the cell proliferation abilities of 5 Gy group and 10 Gy group were significantly decreased than that of 0 Gy group (F =116.41, 62.20, 34.29, P <0.01), and the β-Galactosidase activity of the two groups were significantly increased than that of 0 Gy group, and the difference was significant (F =1629.22, P <0.01). At 72h after X-ray with different doses radiated HaCaT cells, the expression levels of p21 and p53 proteins of 5 Gy group and 10 Gy group increased, and the differences of them among three groups were significant (F =104.4, 66.69, P <0.01), respectively. Conclusion: Ionizing radiation can induce the occurrences of oxidative stress and DNA damage in HaCaT cells, and cause the occurrence of cellular premature aging.
[Key words] Ionizing radiation; Oxidative stress; DNA damage; Cellular premature aging Fund program: National Natural Science Foundation of China (31570852)
[摘要] 目的：探索不同剂量X射线照射人永生化角质形成细胞(HaCaT)后导致细胞氧化应激水平变化、DNA损伤及细胞早衰的发生。

方法：对HaCaT进行X射线照射，根据照射剂量将其分为0 Gy组、5 Gy组和10 Gy组，使用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平，并用比色法测定细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。

利用免疫荧光染色检测不同剂量X射线照射后HaCaT中的磷酸化组蛋白2A变异体(γ-H2AX)焦点变化。

使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试剂盒检测不同剂量X射线照射HaCaT后对细胞增殖的影响，采用β-半乳糖苷酶染色检测早衰细胞比例。

利用蛋白免疫印迹法检测X射线照射后p21、p53蛋白表达变化。

结果：X射线照射HaCaT后24 h，5 Gy组、10 Gy组均较0 Gy组2',7'-二氯荧光素(DCF)荧光强度显著增加，MDA含量较0 Gy组显著升高，而SOD活性较0 Gy组显著下降，3组比较差异均有统计学意义(F =38.35、92.22、5.22，P ＜0.05)。

照射后1 h，γ-H2AX焦点变化呈剂量依赖性显著增加，与0 Gy组相比差异均有统计学意义(F =129.3，P ＜0.05)。

X射线照射HaCaT后6、24和48 h，5 Gy 组、10 Gy组均较与0 Gy组相比细胞增殖能力降低，3组比较差异均有统计学意义(F =116.41、62.20、34.29，P ＜0.01)，β-半乳糖苷酶活性增高，其差异均有统计学意义(F =1629.22，P ＜0.01)。

不同剂量X射线照射HaCaT后72 h，5 Gy组和10 Gy组p21、p53蛋白表达量升高，3组比较差异均有统计学意义(F =104.4、66.69，P ＜0.01)。

结论：电离辐射可诱导HaCaT细胞发生氧化应激和DNA损伤同时引起细胞早衰的发生。

[关键词] 电离辐射；氧化应激；DNA损伤；细胞早衰基金项目：国家自然科学基金面上项目(31570852)
引用本文：陈婕,蔡恬静,赵骅,等.X射线激活氧化应激诱导DNA损伤及HaCaT发生细胞早衰研究[J].中国医学装备,2024,21(2):174-178.DOI:10.3969/j.issn.1672-8270.2024.02.033
陈 婕 蔡恬静 赵 骅 高 玲 刘青杰
中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所 辐射防护与核应急中国疾病预防控制中心重点实验室 北京 100088通信作者：高玲，DOI: 10.3969/j.issn.1672-8270.2024.02.033中图分类号：R818.74 文献标识码：A
X射线激活氧化应激诱导DNA损伤及HaCaT发生细胞早衰研究
皮肤作为人体的最大器官，发挥着隔绝外在物理、化学、生物因素侵袭的作用，是电离辐射作用于
人体的必经之路[1]。

皮肤对电离辐射相对敏感，受照后皮肤发生放射性损伤[2]。

核电站、核医学科、介入
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工作人员等职业受照人群放射性皮肤损伤的发生较为常见，同时，放疗后的放射性皮肤损伤作为放疗并发症，约95%肿瘤患者接受放疗后发生不同程度的皮肤损伤[3]而急需重视和关注。

临床对于放射性皮肤损伤尚无标准治疗方案，药物治疗仍是首选。

局部用药是防治放射性皮肤损伤的主要方法，多以放射性皮肤损伤的发生机制及创面修复机制为依据[4]。

细胞衰老指持久的细胞周期阻滞并伴随持续性促炎状态出现为主要特征的一种细胞表型，分为内源性复制衰老和外源性刺激引起的细胞早衰[5-7]。

细胞早衰是指细胞在生长和发育过程中，在非端粒信号刺激下，增殖能力和生理功能下降，提前出现退行性改变[8]。

通常细胞早衰发生时伴随以下特征：细胞形态改变，细胞增殖能力减弱，糖酵解相关标志物β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性增加，胞内溶酶体数量增多，迁移能力降低以及早衰相关蛋白p21、p53、p16等表达增加[9-11]。

电离辐射照射可诱导HaCaT细胞发生早衰[12]。

现有的研究[13]中更多关注中波紫外线B波段(ultraviolet B，UVB)诱导的皮肤细胞早衰，对电离辐射诱发的早衰及早衰信号通路尚未进一步阐明。

为此，本研究以人永生化角质形成细胞(human immortalized epidermal cells，HaCaT)为模型，分析研究确定电离辐射可诱发细胞早衰并探索相关机制。

1 材料与方法1.1 仪器设备与试剂
采用XCELL 225型X射线辐照仪(美国KUBTEC 公司)；ChemiDoc型多功能成像系统(美国Bio-Rad公司)；Varioskan LUX型多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；7500 Fast型实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(美国Thermo Fisher公司)；Zeiss LSM700型激光共聚焦显微镜(德国Carl Zeiss公司)。

最小必需培养基(minimum essential medium，MEM)基础培养基，青霉素-链霉素溶液均购自美国Hyclone公司；新生胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国GIBCO 公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)荧光探针、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、TritonX-100通透试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒购自日本Dojindo研究所；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 实验方法1.
2.1 细胞培养
HaCaT购自北京协和医学院细胞库。

使用含10%胎牛血清和1%双抗的MEM培养基，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO 2)饱和湿度培养箱内培养。

1.2.2 细胞照射及分组
使用KUBTEC XCELL 225型X射线辐照仪对HaCaT进行照射，实验前用射线装置探测器对X射线辐照仪进行剂量校准。

实验参数：工作电压为225 kV，工作电流为13.2 mA，剂量率为1 Gy/min。

将照射的HaCaT依据照射剂量分为0 Gy组、5 Gy组和10 Gy组。

1.2.3 ROS检测
选取对数生长期的HaCaT制备成为单细胞悬液后接种于12孔板中(1×104个细胞/孔)，待细胞贴壁后进行照射，于照射后24 h检测细胞内ROS表达水平。

使用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗细胞后加入无血清培养基，配制浓度为10 μmol/L的2,7-二氯二氢荧光素二乙酸
酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate， DCFH-DA)。

将HaCaT置于37 ℃细胞培养箱内孵育30 min，用无血清培养基洗涤细胞3次后，利用荧光显
微镜观察。

荧光酶标仪定量检测时，将消化细胞进行计数，将计数好的细胞悬液在无血清培养基配制的浓度为10 μmol/L的DCFH-DA中孵育30 min，无血清培养基洗涤细胞3次，用酶标仪测量波长485 nm处的光密度(optical density，OD)值。

1.2.4 MDA和SOD检测
选取对数生长期的HaCaT制成单细胞悬液，以5×106个细胞接种于T25细胞培养瓶，待细胞贴壁后进行照射。

于照射后24 h收取细胞沉淀，并参照MDA、SOD试剂盒说明书测定细胞上清中MDA、SOD含量。

1.2.5 免疫荧光染色
制备HaCaT细胞爬片，待细胞贴壁后进行照射，照射后1 h加入4%组织细胞固定液，于室温固定细胞30 min；使用0.25% TritonX-100通透试剂进行室温通透30 min，5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭1 h，加入磷酸化组蛋白2A变异体(γ-histone family2A variant，γ-H2AX)一抗于4 ℃孵育过夜，荧光二抗染色1 h后加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液，染色10 min，10%甘油封片，在荧光显微镜下观察γ-H2AX焦点。

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1.2.6 CCK-8法测细胞增殖
选取对数生长期的HaCaT制备成单细胞悬液接种于96孔板中(5×103个细胞/孔)，待细胞贴壁后进行照射，于照射后6、24和48 h进行细胞增殖检测，每孔加入10 μl CCK-8溶液，放置于培养箱中孵育2 h，用酶标仪测量波长450 nm处的OD值。

1.2.7 β-半乳糖苷酶染色
将HaCaT细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后进行不同剂量X射线照射。

于照后72 h对HaCaT进行β-半乳糖苷酶染色。

按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书，在每孔细胞中加入1 ml固定液，室温下固定15 min。

倒掉固定液，用PBS清洗3次。

在每孔中加入1 ml配制好的染色工作液后，放置于37 ℃孵箱中孵育过夜。

使用倒置相差显微镜及其成像系统观察并随机选取3个视野拍摄，采用ImageJ图像处理软件分析染色阳性细胞数所占比例。

1.2.8 蛋白提取及免疫印迹分析
选取对数生长期的HaCaT进行照射，于照后72 h 收集细胞，将含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液加入细胞中，冰浴振荡30 min裂解细胞，以12 000 r/min转速，离心10 min后取细胞上清。

取出1 μl上清液，使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒测定上清液中目的蛋白浓度，并计算30 μg p21、p53蛋白的体积。

剩余上清液加入5×上样缓冲液，煮沸10 min将蛋白变性后可放置于-20 ℃冰箱保存。

配制12%的聚丙烯酰胺凝胶，取出30 μg变性后的蛋白进行垂直电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜后，用5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗及二抗孵育后采用增强化学发光法显影，使用ChemiDoc型多功能成像系统曝光成像，采集图像数据后用ImageJ图像处理软件分析p21、p53蛋
白的相对表达水平。

1.3 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行数据处理，符合正态
分布，计量资料以x
-±s 表示。

两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析。

以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 不同剂量X 射线照射HaCaT 后活性氧水平、MDA 含量及SOD 活性比较
X射线照射HaCaT后24 h，5 Gy组和10 Gy组细胞内2',7'-二氯荧光素(2',7'-dichlorofluorescein，DCF)荧光强度随着剂量增加而增加，与0 Gy组相比差异具有统计学意义(F =38.35，P ＜0.01)。

不同剂量X 射线照射HaCaT后24 h，5 Gy组和10 Gy组细胞MDA 含量较对照组表达量显著升高，差异有统计学意义(F =92.22，P ＜0.01)。

5 Gy组和10 Gy组X射线照射HaCaT后24 h，SOD活性较对照组显著下降，差异有统计学意义(F =5.22，P ＜0.05)，见表1。

注：HaCaT 为人永生化角质形成细胞；与0 G y 比较，a t =12.38、13.31，P <0.05
图1 不同剂量X 射线照射1 h 后HaCaT 细胞γ-H2AX 焦点的变化 A 为激光共聚焦显微镜观察图 免疫荧光染色×630；
B 为照射后γ-H2AX 焦点变化相对表达量
注：HaCaT 为人永生化角质形成细胞；ROS 为活性氧；MDA 为丙二醛；SOD 为超氧化物歧化酶
表1 3组不同剂量X 射线照射后对HaCaT 的
ROS 水平、MDA 含量和SOD 活性的比较(x
-±s
)2.2 不同剂量X 射线照射对HaCaT DNA 损伤的影响
利用激光共聚焦显微镜观察X射线照射HaCaT 后1 h，5 Gy、10
Gy组细胞内γ-H2AX焦点变化，
177
注：HaCaT 为人永生化角质形成细胞
注：HaCaT 为人永生化角质形成细胞
γ-H2AX焦点随着剂量增加而增加，5 Gy组和10 Gy组与0 Gy组相比差异有统计学意义(F =129.3，P ＜0.05)，见图1。

2.3 不同剂量X 射线照射对HaCaT 增殖能力的影响
利用CCK-8试剂盒检测5、10 Gy X射线照射细胞后6、24和48 h对HaCaT增殖能力影响。

不同剂量X射线照射后，与0 Gy组相比，5 Gy组和10 Gy组OD值显著降低，3组比较差异具有统计学意义(F =116.41、62.20、34.29，P ＜0.01)。

结果表明照射后6、24和48 h，5 Gy 组和10 Gy组HaCaT增殖受到抑制，见表2。

2.4 不同剂量X 射线照射对HaCaT 衰老相关β-半乳糖苷酶活性的影响
不同剂量X射线照射HaCaT后72 h，0 Gy组细胞衰老相关标志物β-半乳糖苷酶染色较浅且数量较少，细胞β-半乳糖苷酶染色深度随着剂量升高而增加。

结果表明，5 Gy组和10 Gy组HaCaT细胞β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例较0 Gy组显著增加，其差异有统计学意义(F =1629.22，P ＜0.01)，见图2。

表2 3组不同剂量X 射线照射后不同时间
对HaCaT 增殖能力光密度值的比较(x
-±s )表3 3组不同剂量X 射线照射HaCaT 后
72 h p21、p53蛋白相对表达水平比较(x
-±s
)
注：HaCaT 为人永生化角质形成细胞；与0 Gy 比较，
a
t =7.74、68.36，P <0.05
图2 不同剂量X 射线照射后72 hHaCaT 细胞β-半乳糖苷酶表达 A 为倒置相差显微镜观察图 β-半乳糖苷酶染色×100；B 为细胞内β-半乳糖苷酶染色阳性细胞
比例
图3 不同剂量X 射线照射后72h p21和p53蛋白表达电泳2.5 不同剂量X 射线照射对HaCaT 的p21、p53蛋白表达影响
利用蛋白免疫印迹法检测不同剂量X射线照射HaCaT后72 h对p21、p53蛋白的表达水平。

5 Gy组、10 Gy组与0 Gy组相比，HaCaT中p21、p53蛋白表达显著增加，3组比较差异有统计学意义(F =104.4、
66.69，P ＜0.01)，见表3、不同剂量X射线照射后72h
p21、p53蛋白表达电泳见图3。

3 讨论
电离辐射作用于细胞产生大量ROS进而破坏细胞内氧化平衡机制，引起细胞氧化应激水平变化[14]。

本研究结果表明，在5、10 Gy剂量照射后24 h，HaCaT 内ROS水平显著增加，同时脂质过氧化物的最终产物MDA含量显著增加，SOD活性显著下降。

持续的氧化应激会导致生物分子产生氧化损伤，尤其是对DNA 损伤的发生，包括缩短端粒、DNA双键断裂；氧化应激还可以引发炎症反应[15]，炎症与衰老密切相关[16]。

当细胞内的染色质发生DNA双链断裂时组蛋白H2AX 139位点丝氨酸残基快速磷酸化，即形成γ-H2AX焦点[17]。

因此，γ-H2AX焦点变化可用来检测细胞DNA双链断裂水平。

本研究结果显示，5、
10 Gy X射线照射HaCaT后1 h，细胞内γ-H2AX焦点较对照组显著升高且呈剂量依赖性，表明电离辐射照射导致DNA损伤的发生。

不同种类的射线可诱导正常细胞及肿瘤细胞发生早衰。

而持续的DNA损伤反应可激活细胞衰老，导致衰老细胞在组织中广泛积累[12]。

有研究发现，X射线照射可引起人肺癌细胞A549、H322、H1299[18]、皮肤成纤维细胞[19-20]发生早衰。

本研究结果表明，不同剂量X射线照射后，HaCaT
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收稿日期：2023-11-10
增殖能力受到抑制，同时细胞糖酵解相关标志物β-半乳糖苷酶活性增加，早衰相关蛋白p21、p53表达水平升高，表明5、10Gy X射线照射可导致HaCaT发生早衰，早衰的发生可能与氧化应激和DNA损伤相关。

4 结论
X射线照射可诱导HaCaT氧化应激水平变化和DNA损伤发生，且损伤具有剂量依赖性。

X射线能够诱导HaCaT早衰的发生，并伴随p53通路的激活。

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