草地早熟禾愈伤组织诱导和分化中内源激素水平分析
玉米幼胚和成熟胚愈伤组织诱导过程中内源激素的比较
收稿日期:2008212228 接受日期:2009202224基金项目:国家高新技术研究发展计划(863计划)项目(2004AA207140)作者简介:贾小霞(19782),女,甘肃定西人,在读博士研究生,专业方向为作物遗传育种。
E 2mail :jiaxx0601@ 通讯作者:张金文(19582),男,甘肃武威人,教授,博士生导师,研究方向为作物遗传育种。
E 2mail :jwzhang305@1631com文章编号:100028551(2009)042555206玉米幼胚和成熟胚愈伤组织诱导过程中内源激素的比较贾小霞1 王汉宁1 孔维萍2 梁慧光3 张金文1(11甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;21甘肃省农业科学院,甘肃兰州 730070;31甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070)摘 要:以玉米自交系87-1的幼胚和成熟胚为材料,用酶联免疫法测定了不同培养时间诱导的幼胚及成熟胚愈伤组织内源脱落酸(ABA )、吲哚乙酸(I AA )、赤霉素(G A 3)和细胞分裂素(ZR )含量的动态变化。
结果表明,在0～7d 时,幼胚及成熟胚的I AA 和G A 3含量均急剧下降,说明在胚萌发阶段I AA 和G A 3需求量较大。
在幼胚胚性愈伤组织发生初期(14d 左右),2种激素含量出现峰值,反映出幼胚较高水平的I AA 和G A 3含量,有利于胚性愈伤组织的诱导。
在胚萌发后的愈伤诱导阶段,成熟胚愈伤中I AA 、G A 3和ABA 含量以及I AA ΠABA 和G A 3ΠABA 比值明显高于幼胚愈伤,且I AA ΠABA 和G A 3ΠABA 比值均大幅度上升;而幼胚愈伤组织中I AA ΠABA 和G A 3ΠABA 比值则稳定地维持在较低的水平上。
可以认为,成熟胚愈伤组织中过高水平的I AA 、G A 3和ABA 含量及I AA ΠABA 和G A 3ΠABA 比值大幅度上升可能是导致其难以形成胚性愈伤组织的主要生理原因之一。
草地早熟禾根茎扩展与内源激素及碳氮代谢随生育时期的动态变化
草地早熟禾根茎扩展与内源激素及碳氮代谢随生育时期的动态变化草地早熟禾（Poa pratensis L.）是一种常见的牧草和草坪覆盖植物，其根茎在植物的生长和分布过程中起着重要的作用。
根茎是植物地下的主要器官之一，它们通过分枝和伸展来扩展植物的根系，并与土壤中的水分和养分进行吸收和交换。
根茎的扩展与植物的内源激素合成和碳氮代谢密切相关，这些因素在不同生育时期可能会发生动态变化。
根茎的扩展过程受到多种内源激素的调控，其中赤霉素、生长素和植物激素等是最为重要的。
这些内源激素在植物的根茎分裂、扩张和生长过程中发挥着重要的作用。
赤霉素是一种促进植物生长的重要激素，它能够促进根茎的伸长和伸展以及根膜的形成。
生长素则是调节细胞分裂和伸展的主要激素，它在根茎的伸长和分支过程中起着关键作用。
植物激素则能够影响植物的根茎发育和生长过程。
这些内源激素之间相互作用，共同调控了草地早熟禾根茎的扩展过程。
此外，草地早熟禾的根茎扩展过程也与植物的碳氮代谢密切相关。
碳氮代谢是植物生长和发育过程中的重要生化过程，它在维持植物的能量供应和物质交换方面起着重要作用。
根茎的扩展需要大量碳水化合物和氮素供给，以满足其分枝和伸展的能量需求。
植物通过光合作用和氮代谢将光能和氮素转化为碳水化合物和氮化合物，进而提供给根茎的生长和扩展。
而根茎的发育和分枝也能够影响植物的碳氮代谢过程。
根茎的生长和分枝增加了植物的碳素和氮素分配，促进了植物的生长和代谢活动。
在草地早熟禾的生育过程中，根茎的扩展以及与内源激素和碳氮代谢的关系会发生动态变化。
在生育的早期阶段，根茎的扩展主要依赖于赤霉素的促进作用，其可以促进根茎的伸长和分枝增加。
在生育的中期，赤霉素的作用逐渐减弱，生长素开始发挥主导作用，促进根茎的伸长和分支。
在生育的后期，赤霉素和生长素的作用逐渐减弱，植物激素成为主导因素，对根茎的扩展发挥重要的作用。
同时，碳氮代谢在这个过程中也会发生相应的变化，植物将碳水化合物和氮素更多地分配到根茎生长和分枝的需求上。
草地早熟禾（poapratensisl.）耐热性能及其生理机制的研究
ｉｎ‘ＥｖｅｒＧｌａｄｅ’ｔｈａｎ ｉｎ‘Ｋｅｎｂｌｕｅ’．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｎｄｅｒ ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
４．Ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｄ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＡＢＡ ａｎｄ ＩＡＡ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ ｔｗｏ
ｃｕｌｔｉｖａｒｓ，ｂｕｔ ｔｈｅ‘ＥｖｅｒＧｌａｄｅ’ｗａｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ‘Ｋｅｎｂｌｕｅ’ｉｎ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｐｅｒｉｏｄ．Ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ
签名：趁生坠
日期：垫！三：笸：睦
关于论文使用授权的说明
本人完全了解北京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 （保密的论文在解密后应遵守此规定）
趔日 签 名： 邈，坦 导师签名：
及其同工酶的表达。耐热性强的‘超级歌来德’膜脂过氧化程度较低，并且抗氧化酶 的活性较高，因此，具有较好的清除体内自由基的能力。高温抑制了部分同工酶的表 达，同时也促进了部分同工酶的表达，耐热性强的草地早熟禾品种同工酶的条带更多 更亮。
３．高温胁迫结束时，草地早熟禾叶片中可溶性蛋白质和游离氨基酸的含量降低， 但在整个处理期间，‘超级歌来德’始终高于‘兰肯’；游离脯氨酸含量呈上升趋势， 并且‘兰肯’上升幅度较大。
禾本科牧草胚性愈伤组织诱导及再生研究进展
愈伤组织的诱导和再生涉及到外植体的脱分化过程和胚性愈伤组织的再分化过程，植物生长素和细胞分裂素对这两个分化过程起主导调节作用。
多数情况下，双子叶植物再生体系的植物生长调节剂、各种激素组合及配比和培养基等，并不适合单子叶植物，尤其是禾本科牧草。
因此对于不同的单子叶植物品种，仅仅通过激素调节来实现愈伤组织的诱导和再生是远远不够的，还需要对其外植体来源以及基因型个体差异等因素进行研究，才能获得最佳的胚性愈伤组织诱导及再生途径。
1胚性愈伤组织形态发生方式自从1944年Brink 等[1]利用大麦和黑麦的胚为外植体开创了禾本科牧草的组培再生研究以来，越来越多的科研工作者投入到单子叶植物组培再生研究中。
LaRue （1949）[2]和Straus 等（1954）[3]利用玉米的未成熟胚乳诱导出愈伤组织，迈出了单子叶植物组培再生极有意义的一步。
随后，Carter 等（1967）[4]首次建立了单子叶植物燕麦再生体系；Cheng 和Smith （1975）[5]建立了大麦的再生体系。
但在多数情况下，这些植株再生是偶然发生的，再生频率低。
从20世纪80年代后，植物的再生技术取得了突破性的发展，从未成熟的花穗、胚芽鞘组织、胚或来自于这些外植体的原生质体细胞诱导出愈伤组织，通过组织器官发生或体细胞胚胎发生，最终建立了一系列植株的高频再生体系。
从愈伤组织形态发生方式来看，主要有不定芽方式和胚状体方式，其中胚状体来源于单细胞，再生稳定，具有完整的胚性结构，数量比不定芽再生多，可以制成人工种子，用于大规模生产。
禾本科胚性愈伤组织再生于1980年首次报道[6~8]，但许多胚性愈伤组织只能形成叶原基，绿点和许多芽分生组织，不能形成完整植株。
1981年后，一系列禾本科牧草品种的胚性再生被相继报道（见表1）。
研究表明，禾本科植物胚性愈伤组织的显著特征是它们的颜色和表面特征。
通常胚性愈伤组织的颜色是白色到灰白色，结构致密，有组织分化，并包含大量的小的富含细胞质和含有淀粉的分生组收稿日期：2014-08-18基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD17B03）和四川省草种质资源平台建设项目资助作者简介：李达旭（1968-），男，四川绵阳人，高级畜牧师，主要从事草种质资源评价及品种选育等工作。
草地早熟禾发生分蘖时内源激素调控研究
草地早熟禾发生分蘖时内源激素调控研究草地早熟禾（Poa pratensis L.）是一种重要的牧草品种，广泛分布于世界各地，并被广泛用于草坪、牧场和高原草地的修复。
它具有营养丰富、耐寒性强等优点，因此备受农牧业生产者的喜爱。
草地早熟禾的分蘖形成对于其生长发育和产量具有重要影响，因此研究草地早熟禾分蘖的内源激素调控机制对于提高其产量和品质具有重要意义。
内源激素是植物生长发育的重要调节因子，对于众多生理过程的调控起着关键作用。
多年来的研究表明，内源激素参与了草地早熟禾的分蘖发育调控。
在草地早熟禾的分蘖过程中，赤霉素（gibberellins，GA）、生长素（auxins，IAA）、细胞分裂素（cytokinins，CK）、赤霉烷酸（abscisic acid，ABA）等内源激素在调控分蘖数量和分蘖位置方面起到了重要的作用。
首先，赤霉素是调控草地早熟禾分蘖的关键激素之一。
研究发现，赤霉素可以促进分蘖的形成和增加分蘖的数量。
实验证明，在赤霉素处理下，草地早熟禾的分蘖数量显著增加，并且分蘖的初始生长速度也较快。
此外，赤霉素还可以影响分蘖的分化和分蘖器官的发育。
研究发现，赤霉素可以促进分蘖原基的分化，并且使得分蘖的叶片和根系发育更加健壮。
因此，赤霉素通过促进分蘖的形成、增加分蘖数量以及促进分蘖器官的发育，对草地早熟禾的分蘖发育起到了积极的调控作用。
其次，生长素也是调控草地早熟禾分蘖的重要激素之一。
生长素可以通过控制分蘖原基分化和生长，对草地早熟禾的分蘖产生影响。
研究表明，生长素的供应能够促进分蘖原基的分化和延长分蘖发育的过程。
此外，生长素还可以通过影响分蘖的干重分配，调控从侧分蘖向中央分蘖的转变。
因此，生长素通过影响分蘖原基的分化、分蘖的生长以及分蘖的干重分配，对于草地早熟禾的分蘖发育具有重要的调控作用。
另外，细胞分裂素也参与了草地早熟禾分蘖的调控过程。
细胞分裂素能够促进分蘖原基的分裂和细胞增殖，从而增加分蘖的数量。
草地早熟禾BBML基因的克隆及表达模式分析
第32卷第2期V o l.32N o.2草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年2月F e b.2024d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2024.02.006引用格式:余江弟,李玉珠,苗佳敏,等.草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析[J].草地学报,2024,32(2):396-408 Y UJ i a n g-d i,L IY u-z h u,M I A OJ i a-m i n,e t a l.C l o n i n g a n dE x p r e s s i o nP a t t e r nA n a l y s i s o f B B M L G e n e i n P o a p r a t-e n s i s(K e n t u c k y B l u e g r a s s)[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2024,32(2):396-408草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析余江弟,李玉珠*,苗佳敏,丁菲菲,白小明,牛奎举(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州730070)摘要:为探究婴儿潮(B A B YB O O M,B B M)基因诱导草地早熟禾(P o a p r a t e n s i s)体胚发生的潜在功能,本研究采用同源克隆方法获得P p B B M L(P p B B M-l i k e)基因,并对其进行生信分析㊁亚细胞定位和表达模式分析㊂结果表明: P p B B M L编码的蛋白具B B M特有的b b m-1基序且定位于细胞核,并与小麦(T r i t i c u ma e s t i v u m)B B M亲缘关系最近㊂P p B B M L的表达水平存在组织特异性,表达量为花药>茎基>幼叶>根茎>老叶>不定根㊂6-B A,N A A(除0h外),M e J A和E B R(除4h外)处理后的P p B B M L表达量均高于C K;G A3处理后的P p B B M L表达量均低于C K㊂在仅添加生长素的愈伤组织诱导培养基上,其表达量在接种第2d最高㊂综上所述,P p B B M L是A P2亚家族的转录因子基因,其表达量在幼嫩组织中最高且受到不同激素的诱导,并在愈伤组织形成初期表达量急剧上升,因此,该基因可能具有诱导草地早熟禾胚性愈伤组织发生的潜力㊂关键词:草地早熟禾;B B M基因;基因克隆;生物信息学分析;表达模式分析中图分类号:S688.4文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)02-0396-13C l o n i n g a n dE x p r e s s i o nP a t t e r nA n a l y s i s o f B B M L G e n e i nP o a p r a t e n s i s(K e n t u c k y B l u e g r a s s)Y UJ i a n g-d i,L IY u-z h u*,M I A OJ i a-m i n,D I N GF e i-f e i,B A IX i a o-m i n g,N I U K u i-j u(C o l l e g e o f P r a t a c u l t u r a l S c i e n c e,G a n s uA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y;K e y L a b o r a t o r y o fG r a s s l a n dE c o s y s t e m,M i n i s t r y o fE d u c a t i o n;S i n o-U.S.C e n t e r f o rG r a s s l a n dE c o s y s t e mS u s t a i n a b i l i t y,L a n z h o u,G a n s uP r o v i n c e730070,C h i n a)A b s t r a c t:T o e x p l o r e t h e p o t e n t i a l f u n c t i o no f t h eB A B YB O O M(B B M)g e n e i n i n d u c i n g s o m a t i c e m b r y o-g e n e s i s i n P o a p r a t e n s i s.T h e P p B B M L(P p B B M-l i k e)g e n ew a so b t a i n e dt h r o u g hh o m o l o g o u sc l o n i n g a n da n a l y z e du s i n g b i o i n f o r m a t i c s,s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n,a n de x p r e s s i o n p a t t e r na n a l y s i s.T h er e s u l t s s h o w e d t h a t t h e p r o t e i ne n c o d e db y P p B B M L h a d t h e u n i q u e b b m-1m o t i f o f B B M a n dw a s l o c a t e d i n t h e n u c l e u s,a n dw a s c l o s e l y r e l a t e d t ow h e a t(T r i t i c u ma e s t i v u m)B B M.T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e P p B B M L g e n e e x h i b i t s t i s s u e s p e c i f i c i t y,w i t h t h eh i g h e s t e x p r e s s i o n i na n t h e r s,f o l l o w e db y s t e mb a s e,y o u n g l e a v-e s,r h i z o m e s,o l d l e a v e s,a n d a d v e n t i t i o u s r o o t s.T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f P p B B M L a f t e r t r e a t m e n tw i t h6-B A,N A A(e x c e p t0h),M e J A,a n dE B R(e x c e p t4h)w e r eh i g h e r t h a n t h o s eo f t h e c o n t r o l;h o w e v e r,t h e e x p r e s s i o no f P p B B M L a f t e rG A3t r e a t m e n tw a s l o w e r t h a n t h a t o f t h e c o n t r o l.I n c a l l u s i n d u c t i o nm e d i-u ms u p p l e m e n t e d o n l y w i t h a u x i n,t h e e x p r e s s i o no f P p B B M L p e a k e d o n t h e s e c o n dd a y o f i n o c u l a t i o n.I n s u m m a r y,P p B B M L i sat r a n s c r i p t i o nf a c t o r g e n eo f t h eA P2s u b f a m i l y.I t se x p r e s s i o ni s t h eh i g h e s t i n y o u n g t i s s u e s,i s i n d u c e db y d i f f e r e n th o r m o n e s,a n d i n c r e a s e ss h a r p l y i nt h ee a r l y s t a g eo f c a l l u s f o r m a-t i o n.T h e r e f o r e,t h i s g e n em a y h a v e t h e p o t e n t i a l t o i n d u c e e m b r y o n i c c a l l u s f o r m a t i o n i n P o a p r a t e n s i s. K e y w o r d s:K e n t u c k y B l u e g r a s s;B B M g e n e;G e n e c l o n i n g;B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s;E x p r e s s i o n p a t t e r n a n a l-y s i s收稿日期:2023-10-30;修回日期:2023-12-07基金项目:草业生态系统教育部重点实验室(甘肃农业大学)2022年开放课题(K L G E202217);甘肃农业大学科技创新基金(青年导师扶持基金)(G A U-Q D F C-2021-02);草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室开放基金课题(S K L H I G A202301)资助作者简介:余江弟(1999-),女,汉族,甘肃天水人,硕士研究生,主要从事草类植物分子育种方面研究,E-m a i l:2605257509@q q.c o m;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:l i y z@g s a u.e d u.c n第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析植物体细胞胚胎(体胚)发生是指由体细胞经过离体培养产生胚状体的过程,该过程可直接从外植体表皮㊁亚表皮㊁悬浮细胞㊁原生质体发生,也可以从脱分化的外植体形成愈伤组织的外部或内部产生[1]㊂玉米(Z e am a y s)㊁小麦和水稻(O r y z a s a t i v a)均可通过体胚发生途径再生完整植株,再生的体胚来自胚性愈伤组织[2-4]㊂随着对植物胚性愈伤组织发生分子机制研究的不断深入,隶属于A P2亚家族的转录因子基因B B M已被证明是植物胚胎发生的关键调节因子,该基因能促进细胞增殖㊁愈伤组织诱导及体胚形成等[5]㊂F l o r e z等[6]发现可可(T h e o b r o m ac a c a o)的B B M基因在种胚和胚性愈伤组织中均高表达,且过表达T c B B M可显著提高可可体胚的诱导率㊂M a u l i d i y a等[7]发现甘蔗(S a c c h a r u mo f f i c i n a r u m)的B B M基因可显著提高其胚性愈伤组织的诱导率及体胚的产生㊂最近的研究表明B B M基因能促进植物尤其是单子叶植物的遗传转化效率㊂L o w e 等[8]利用农杆菌胭脂碱合成酶启动子(N o s:Z m-WU S2)低水平表达WU S2,结合玉米泛素启动子(Z m U b i:Z m B B M)高水平表达B B M成功获得了玉米,高粱(S o r g h u mb i c o l o r),甘蔗和水稻经体胚发生途径再生的转基因植株㊂共表达B B M和WU S 也能明显提高玉米胚性愈伤组织诱导率,进而实现玉米组培执拗型品种的高效遗传转化[2,9]㊂草地早熟禾是温带地区应用最广泛的冷季型草坪草和重要牧草[10]㊂迄今为止,草地早熟禾通过愈伤组织分化再生的研究已有很多报道㊂M c D o n n e l l 等[11]首次用成熟种子诱导出胚性愈伤组织,但植株再生率仅有6%㊂之后,研究者们先后利用不同外植体(幼穂㊁根㊁芽㊁胚根和胚轴等)诱导草地早熟禾愈伤组织,其中,幼穗因组织幼嫩㊁分生能力强㊁再生频率高,其胚性愈伤组织率最高,但该外植体的取材受季节限制[12]㊂愈伤组织的诱导和分化是建立再生体系的关键,而高效的再生体系是草地早熟禾遗传转化的基础[13]㊂K e等[14]采用农杆菌介导法,以草地早熟禾品种 T o u c h d o w n 的胚芽鞘为外植体,通过愈伤组织再生途径最早实现了G U S和r o l C基因的遗传转化,但转化效率仅有3.7%㊂H a等[15]采用基因枪介导法,以草地早熟禾品种 K e n b l u e 的愈伤组织为受体细胞,用含有潮霉素磷酸转移酶基因(h p t)㊁β-葡萄糖醛酸酶基因(u i d A;g u s)和合成绿色荧光蛋白(G F P)基因[s g f p(S65T)]的三个质粒(p A c t1I H P T-4,p A H C15和p A c t1I s G F P-1)共转化,转化率为2.2%㊂佘建明等[16]利用农杆菌侵染草地早熟禾胚性愈伤的方法转化B t基因,共获得5株阳性转化植株,转化率为45%㊂由此可见,尽管草地早熟禾已建立了稳定遗传转化体系,但相对于水稻等模式物种而言,仍存在遗传转化效率低,可转化品种少的问题㊂利用B B M等胚胎发生标记基因提高草地早熟禾胚性愈伤组织诱导率和体胚发生率,有望缩短该草种的遗传转化时间,提高遗传转化效率,实现在更多品种上开展转基因和基因编辑技术㊂目前草地早熟禾的B B M基因仍未得到鉴定,本文以分蘖能力强,根系发达的野生栽培品种 清水 草地早熟禾(P o a p r a t e n s i s Q i n g s h u i )为材料,以Z m B B M1/2的蛋白序列为请求序列,基于本课题组的5个转录组数据库检索并克隆B B M L基因,进而分析其蛋白的理化性质和保守基序,构建系统进化树;通过构建该基因的过表达载体进行亚细胞定位试验;利用实时荧光定量P C R检测P p B B M基因在不同的组织器官和外源激素处理以及不同外植体诱导愈伤组织形成阶段表达水平的差异,以期为进一步验证草地早熟禾B B M基因的胚性愈伤组织诱导功能奠定基础㊂1材料与方法1.1试验材料及处理以 清水 草地早熟禾为材料,将其成熟种子栽种于育苗穴盘,于人工培养室中进行培养㊂期间每星期浇灌1次1/2H o a g l a n d营养液直至长出3~4个叶片,然后进行单株移栽,待移栽苗生长10d后,一部分材料混合单株采集叶片(幼叶㊁老叶)㊁不定根㊁茎(根茎㊁茎基)等不同的组织;另一部分材料叶面喷施N A A (N a p h t a l i cA c e t i cA c i d)(0.1m g㊃L-1),G A3(G i b b e r e l-l i cA c i d)(10μm o l㊃L-1),6-B A(6-B e n z y l a m i n o p u r i n e)(0.1m g㊃L-1),A B A(A b s c i s i cA c i d)(10m g㊃L-1),E T H(E t h y l e n)(200m g㊃L-1),E B R(24-E p i b r a s s i n o l-i d e)(0.01m g㊃L-1)和M e J A(M e t h y l J a s m o n a t e)(0.1 m m o l㊃L-1)等激素[17],每个处理3株以上,C K为喷施蒸馏水㊂喷激素后取样时间点分别为0,2,4,6,12和24h,混合单株采集叶片㊂于2022年5月单株种植 清水 草地早熟禾于甘肃农业大学草坪实训基地(103ʎ34'E,36ʎ5'N),试验地地势由西北向东南倾斜,海拔1517.30m,属中温带气候区,内陆性气候特征明显,易干旱㊂田间管理包括间苗㊁中耕除草㊁适时灌溉㊂于2023年6月10日混合单793草地学报第32卷株采集草地早熟禾的花药㊂将 清水 草地早熟禾成熟种子消毒后,置于1/2 M S基础培养基上,待胚根和初生叶分别长到15~ 20m m和9~10m m时,切取根尖(约5m m长)和叶基(约2~3m m长)为外植体,在添加外源激素(4m g㊃L-12,4-D)㊁3%碳源(根尖用蔗糖;叶基用麦芽糖)和0.7%琼脂的M S基础培养基上诱导愈伤组织[18],每个处理5皿,每皿30个外植体㊂预试验表明,以根尖和叶基为外植体时,均在第3d形成肉眼可见的愈伤组织㊂因此,取样时间设为接种后第0,1,2,3和8d㊂所有采集的样品存于冻存管中,液氮速冻后放于-80ħ冰箱保存,用于基因表达量的荧光定量P C R分析㊂1.2P p B B M L基因的鉴定以2个Z m B B M s蛋白序列(N M_001154063.1, N M_001138224.1)作为鉴定草地早熟禾P p B B M L 基因的请求序列,将本课题组已有的转录组数据作为本地数据库[19-23],利用B i o e d i t软件中的 b l a s t n 功能,E x p e c t a t i o nV a l u e选择1.0E-10,在本地数据库中进行检索㊂将所得到的序列通过N C B I(N a-t i o n a lC e n t e r f o rB i o t e c h n o l o g y I n f o r m a t i o n)网站中的b l a s t X进行验证,之后获得含完整开放阅读框(O R F)的P p B B M L基因㊂1.3P p B B M L基因的克隆采用天根生物科技有限公司的总R N A试剂盒提取草地早熟禾总R N A㊂利用N a n o d r o p2010/2020超微量紫外可见分光光度计检测R N A的浓度和纯度,并通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测R N A的完整性㊂c D N A由T a K a R a公司的P r i m e S c r i p t T M R Tr e a-g e n t K i t w i t h g D N AE r a s e r(P e r f e c t R e a l T i m e)试剂盒反转录生成㊂根据草地早熟禾转录组数据库中鉴定获得的P p B B M L基因序列,利用O l i g o7软件设计特异性引物(表1)㊂以反转录的c D N A为P C R扩增模板,使用P r i m e S T A R G X LD N AP o l y m e r a s e(T a K a-R a)高保真D N A聚合酶进行扩增㊂反应体系为: 12.5μL P r i m e S T A R G X L P r e m i x,1μL c D N A, 1μL P p B B M L-F,1μL P p B B M L-R,9.5μL d d H2O,共25μL㊂反应程序为:98ħ变性10s,55ħ退火15s, 68ħ延伸1m i n,30个循环㊂扩增结束后,将P C R产物经凝胶电泳检测后,切胶回收,进行加A尾反应(M i g h t y T A-c l o n i n g R e a g e n t S e t f o r P r i m e-S T A R ,T a K a R a),通过T A克隆(M i g h t y T A-c l o-n i n g K i t,T a K a R a),将含有P p B B M L基因片段的序列连接到入门载体p C R8/GW/T O P O上,转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,获得含有准确目的基因片段的阳性克隆并进行P C R鉴定,挑选阳性克隆送华大基因进行测序并提交N C B I,获得G e n B a n k登录号㊂表1草地早熟禾B B M L基因克隆及q R T-P C R引物序列T a b l e1 C l o n i n g a n d q R T-P C R p r i m e r s e q u e n c e o f B B M L g e n e i n P o a p r a t e n s i s引物名称P r i m e r n a m e序列(5'-3')S e q u e n c e s(5'-3')功能F u n c t i o n P p B B M L-F A T G A T G A A A T C C G G G G A A G A A C基因克隆P p B B M L-R T T C T G G C T T T G T T G G A A T C A G G e n e c l o n i n gp E G101-P p B B M L-F A T G A T G A A A T C C G G G G A A G A A C亚细胞定位p E G101-P p B B M L-R T T C T G G C T T T G T T G G A A T C A G S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n Q-P p B B M L-F C A G A T G C G A A G A A C A A C A C C A q R T-P C RQ-P p B B M L-R T A T A C C C C G C A A T T G T T A C A G GQ-G A P DH-F A G G C C G C A T C T G A G G G A A A C内参基因Q-G A P DH-R T T G C T G T A A C C C C A C T C G T T G R e f e r e n c e g e n e1.4P p B B M L蛋白的生物信息学分析利用表2中的在线软件工具对草地早熟禾B B M L基因编码的蛋白进行生物信息学分析㊂1.5P p B B M L过表达载体构建及亚细胞定位利用L R重组技术,把克隆到入门载体(p C R8/ G W/T O P O)的目的基因片段连接到p E G101载体上,构建p E G101-35S-P p B B M L过表达载体㊂根据P p B B M L基因C D S区设计特异性引物p E G101-P p B B M L-F和p E G101-P p B B M L-R,以草地早熟禾叶片c D N A为模板进行P C R扩增,利用胶回收试剂盒回收D N A并与p E G101-35S-P p B B M L载体连接转化大肠杆菌D H5α,通过质粒小提取试剂盒(T I A N-G E N,北京)获得p E G101-35S-P p B B M L-G F P重组质粒㊂将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌(G V3101),30ħ培养2d,用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下,接于相应抗性的1m LL B液体培养基中,吹打均匀后摇床培养1h,5000r㊃m i n-1,离心893第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L 基因的克隆及表达模式分析5m i n ,去上清,收集菌体,用10m m o l ㊃L -1M g C 12(含120μm o l ㊃L -1A S )悬浮液重悬菌体,调O D 600至0.6左右,室温静置3~4h ;挑选生长状况良好的烟草(N i c o t i a n a t a b a c u m )植株,用去枪头的1m L 注射器从烟草叶片下表皮注射,并做好标注;将注射完成的烟草植株弱光培养2d ,即可观察;取标记的农杆菌注射的烟草叶片,制作成玻片,激光共聚焦显微镜下观察,并拍照[24]㊂表2 生物信息学分析软件T a b l e 2 B i o i n f o r m a t i c s a n a l ys i s s o f t w a r e 软件名称S o f t w a r en a m e 分析项目A n a l y s i s p r o je c t 网址W e b s i t eE x P A S y 蛋白理化性质分析A n a l y s i so f p r o t e i n p h y s i c o c h e m i c a l p r o pe r t i e s h t t p s ://w e b .e x p a s y .o r g /p r o t pa r a m /P S I P R E D蛋白的二级结构预测P r e d i c t i o no f S e c o n d a r y S t r u c t u r eo fP r o t e i n s h t t p s ://w w w.n o v o p r o .c n /t o o l s /s e c o n d a r y -s t r u c t u r e -p r e d i c t i o n .h t m l /S W I S S -MO D E L 蛋白的三级结构预测P r e d i c t i o no f t e r t i a r y st r u c t u r eo f p r o t e i n s h t t p s ://s w i s s m o d e l .e x p a s y .o r g/i n t e r a c t i v e /S o f t B e r r y 亚细胞定位预测S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n p r e d i c t i o nh t t p ://w w w.s o f t b e r r y .c o m /b e r r y .p h t m l ?g r o u p =p r o g r a m s &s u b g r o u p =p r o l o c &t o p i c =p r o t c o m pa n E x P A S y 蛋白质亲/疏水性预测P r e d i c t i o no f p r o t e i nh y d r o p h i l i c i t y /h y d r o p h o b i c i t yh t t p s ://w e b .e x p a s y .o r g /pr o t s c a l e /S i g n a l P -5.0蛋白质信号肽预测P r o t e i nS i g n a lP e pt i d eP r e d i c t i o n h t t p s ://s e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e .p h p ?S i gn a l P -5.0D e e p TMHMM 蛋白质跨膜结构预测P r e d i c t i o no f p r o t e i n t r a n s m e m b r a n es t r u c t u r e h t t p s ://s e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e .p h p ?D e e p TMHMM N e t p h o s 蛋白的磷酸化位点预测P r e d i c t i o no f p r o t e i n p h o s p h o r yl a t i o ns i t e s h t t p s ://s e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e .p h p ?Ne t P h o s -3.1M EM E 保守结构域分析C o n s e r v a t i v e s t r u c t u r a l d o m a i na n a l ys i s h t t p s ://m e m e -s u i t e .o r g/m e m e /M E G A7.0进化树分析P h y l o g e n e t i c a n a l ys i s 本地软件L o c a l S o f t w a r e D N AMA N8多序列比对M u l t i p l eS e q u e n c eA l i g n m e n t 本地软件L o c a l S o f t w a r e 1.6 实时荧光定量P C R 分析本研究采用相对定量方法,G A P DH 为内参基因,用O l i go 7软件设计引物㊂选用T a K a R a 公司的T B G r e e n R P r e m i x E x T a q T M I I (T l i R N a s e H P l u s )试剂盒㊂20μL 反应总体积包括2μLc D N A ,6.4μL d d H 2O ,0.8μL 上游和0.8μL 下游引物(10μM )和10μL T B G r e e n P r e m i x E x T a q l l (T l i R N a s e H P l u s )(2ˑ)㊂反应程序为:95ħ预变性30s ,P C R 反应为95ħ变性5s 和60ħ退火30s ,40次循环,溶解曲线分析保留默认,为95ħ持续1s,65ħ持续15s ,95ħ持续1s㊂每个样品设生物学重复3次,技术重复4次,采用2-ΔΔC t法计算基因的相对表达水平[25]㊂利用S P S S22.0和O r i g i n2019软件进行统计分析和作图[26]㊂2 结果与分析2.1 植物总R N A 电泳及浓度检测提取草地早熟禾叶片R N A ,结果显示R N A 条带清晰且完整,符合后续试验要求(图1)㊂用N a n -o d r o p 2010/2020超微量紫外可见分光光度计检测R N A 的浓度和纯度符合要求,提取的草地早熟禾R N A 基本无酶和蛋白污染,可用于后续试验㊂图1 R N A 电泳检测图F i g .1 R N Ae l e c t r o ph o r e s i s d e t e c t i o n c h a r t 注:M 为M a r k e r 2000,1,2和3均为重复N o t e :M ,D L2000D N A M a r k e r ;1,2,a n d3a r e a l l d u pl i c a t e s 2.2 P pB B M L 基因的克隆根据NC B I 数据库中Z m B B M 2(A C G 29578.1)序列信息,在草地早熟禾u n i g e n e _t i l l e r (P R J N A 718697)转录组数据库中检索获得P p B B M L (O R 699039)的序列㊂经N C B I 比对分析,该序列与硬直黑麦草(L o l i -u m r i gi d u m )的B B M 序列比对完整,可进行后续试验㊂根据该基因序列设计特异性引物,以反转录获得的叶片c D N A 为模板,P p B B M L -F 和P p B B M L -R 为引物进行P C R 扩增,获得1个长度为1000b p 左右的基因片段(图2)㊂在筛选培养基上共挑选5个单克隆进行测序,结果正确的有4个㊂1个单克隆的测序结果中间有重叠区域,将序列拼接到一起后,获得的993草 地 学 报第32卷序列与转录组检索到的序列完全一致,目的片段长1128b p ,使用N C B I 在线软件进行比对分析,将其命名为P pB B M L ㊂图2 草地早熟禾B B M L 基因的扩增产物(M 为M a r k e r 2000)F i g .2 A m pl i f i c a t i o n p r o d u c t s o f B B M L g e n e i n P o a p r a t e n s i s (M :D L 2000D N A M a r k e r)2.3 P pB B M L 蛋白的生物信息学分析2.3.1 理化性质分析 利用E x P a S y 中的P r o t -P a r a m 软件对P p B B M L 蛋白进行理化性质分析㊂结果表明,P pB B M L 的分子量为41.05K D ,等电点为(pI )为6.12,属于酸性蛋白;蛋白质分子式为C 1763H 2803N 527O 582S 11;不稳定指数(I n s t a b i l i t y i n -d e x )为46.82,平均亲水指数(G r a n da v e r a g eo f h y -d r o p a t h i c i t y ,G R A V Y )为-0.680,说明P pB B M L 是不稳定的亲水性蛋白[27],脂肪指数(A l i ph a t i c i n -d e x )为68.80;该蛋白无跨膜结构和信号肽;磷酸化位点包括26个丝氨酸(S )㊁12个苏氨酸(T )和6个酪氨酸(Y )(图3)㊂图3 P pB B M L 蛋白磷酸化位点预测F i g .3 P r e d i c t i o no fP p B B M L p r o t e i n p h o s p h o r yl a t i o n s i t e s 2.3.2 二级和三级结构预测 通过在线网站预测了P p B B M L 蛋白质序列的二级结构㊂结果发现,P p B B M L 蛋白二级结构以不规则卷曲和α-螺旋为主,分别占42.82%和32.98%,其次是占13.30%的β-折叠和10.90%的β-转角(图4)㊂P p B B M L 蛋白三维结构均由1个P D B 号为7w q 5.1.A 的结构为模板建立,7w q5.1.A 属于乙烯反应性转录因子WR l 1(E t h y l e n e -r e s po n s i v e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r )㊂P p B B M L 序列的一致性为56.32%,范围为185~356a a ㊂P pB B M L 蛋白三级结构与二级结构预测结果一致,均以不规则卷曲和α-螺旋为主(图5)㊂图4 P pB B M L 蛋白质二级结构图F i g .4 S e c o n d a r y s t r u c t u r e o f P pB B M L p r o t e i n 2.3.3 系统进化树构建和基序分析 通过NC B I(h t t p s ://w w w .n c b i .n l m.n i h .g o v /)/P h y t o z o m e v 13(h t t p s ://p h y t o z o m e -n e x t .j g i .d o e .go v /)共获得22个B B M /B B M L 蛋白序列,包括15个单子叶植物和9个双子叶植物,用于系统发育分析[17]㊂分析的B B M/B B M L 序列包括来自有性繁殖单子叶植物节节麦04第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析(T r i t i c u ma e s t i v u m)㊁野生二粒小麦(T r i t i c u m d i c o c-c o i d e s)㊁乌拉尔图小麦(T r i t i c u mu r a r t u)㊁旱麦草(E r-e m o p y r u m t r i t i c e u m)㊁小麦㊁硬直黑麦草(L o l i u mr i g i-d u m)㊁多年生黑麦草(L o l i u m p e r e n n e)㊁梁山慈竹(D e n d r o c a l a m u s f a r i n o s u s)㊁狗尾草(S e t a r i a v i r i d i s)㊁粱(S e t a r i a i t a l i c a)㊁水稻㊁大麦(H o r d e u mv u l g a r e)和玉米的B B M/B B M L序列,来自双子叶植物有性生殖物种拟南芥㊁甘蓝型油菜(B r a s s i c an a p u s)和大豆(G l y c i n e m a x)的B B M/B B M L序列,利用M e g a7.0软件绘制系统发育进化树㊂结果表明,所有的B B M s聚在3个不同的分支(图6)㊂草地早熟禾B B M L与节节麦㊁野生二粒小麦㊁乌拉尔图小麦及小麦的B B M蛋白位于第1分支,其中P p B B M L与T a B B M1亲缘关系最近㊂采用M E M E网站在线预测P p B B M L蛋白的保守基序,设置返回m o t i f参数为10,发现m o t i f1-10在众多物种的B B M/B B M L蛋白中都存在㊂比对发现, m o t i f1和m o t i f3是两个A P2保守结构域,即A P2-R1,A P2-R2㊂说明比对的不同物种B B M/B B M L成员在进化过程中其功能具有高度保守性㊂m o t i f8对应B B M-l i k e基因特有的b b m-1基序㊂根据m o t i f 分析结果,可归为3类:第1类具有10个m o t i f(m o-t i f1-10),包括P p B B M L,T a B B M1,E t B B M, T u B B M1,T d B B M1,A e t B B M1,L r B B M1, L p B B M1,D f B B M和H v B B M2;第2类具有9个m o t i f(m o t i f1-4和m o t i f6-10),包括Z m B B M2和Z m B B M L;第3类具有5个m o t i f(m o t i f1-4和m o-t i f6),包括A t B B M,S v B B M1,S i B B M1,O s B B M1, B n B B M1/2和G m B B M(图6)㊂图5P p B B M L蛋白质三级结构预测F i g.5 P r e d i c t e d t e r t i a r y s t r u c t u r e o fP p B B M L p r o t e in图6P p B B M L蛋白的基序结构和聚类分析F i g.6 M o t i f c o m p o s i t i o na n d c l u s t e r a n a l y s i s o fP p B B M L p r o t e i n注:A e t,节节麦;T d,野生二粒小麦;T u,乌拉尔图小麦;E t,旱麦草;T a,小麦;A t,拟南芥;L r,硬直黑麦草;L p,多年生黑麦草;D f,梁山慈竹; S v,狗尾草;S i,粱;O s,水稻;H v,大麦;B n,甘蓝型油菜;G m,大豆;Z m,玉米N o t e:A e t,A e g i l o p s t a u s c h i i;T d,T r i t i c u md i c o c c o i d e s;T u,T r i t i c u mu r a r t u;E t,E r e m o p y r u mt r i t i c e u m;T a,T r i t i c u ma e s t i v u m;A t,A r a b i-d o p s i s t h a l i a n a;L r,L o l i u m r i g i d u m;L p,L o l i u m p e r e n n e;D f,D e n d r o c a l a m u s f a r i n o s u s;S v,S e t a r i a v i r i d i s;S i,S e t a r i a i t a l i c a;O s,O r y z a s a-t i v a;H v,H o r d e u mv u l g a r e;B n,B r a s s i c a n a p u s;G m,G l y c i n em a x;Z m,Z e am a y s利用D N AMA N8软件对P p B B M L蛋白进行多序列比对发现:该蛋白中检测到2个A P2结构域(A P2-R1和A P2-R2)㊂此外,还检测到e u A N T2,e u A N T3,e u A N T4和b b m-1等4个基序,但P p B B M L蛋白的e u A N T2-e u A N T4基序中存在氨基酸残基差异,因此将其命名为P p B B M L(图7)㊂2.4P p B B M L蛋白亚细胞定位为探究P p B B M L基因编码的蛋白质在细胞内的具体存在部位,本研究构建了p E G101-35S-P p B B M L-G F P表达载体,通过注射烟草叶片观察荧光信号分布情况确定其位置㊂图8的结果表明,空载体在细胞膜及细胞核组分中荧光信号分布均匀且强104草地学报第32卷度较高,无特异性亚细胞定位现象;而P p B B M L-G F P 的较强荧光信号主要分布于细胞核中,与生信分析结构一致,这表明P p B B M L蛋白在细胞内的位置主要存在于细胞核中,该蛋白可能在细胞核中发挥作用㊂图7P p B B M L蛋白与不同植物B B M同源蛋白序列比对分析F i g.7 S e q u e n c e a l i g n m e n t a n a l y s i s o fP p B B M L p r o t e i n sw i t hd i f f e r e n t p l a n tB B M h o m o l o g o u s p r o t e i n s注:蛋白质序列从N C B I和转录组数据库获得㊂M o t i f序列被鉴定并用下划线标注㊂2个A P2结构域用A P2-R1和A P2-R2表示N o t e:P r o t e i n s e q u e n c e sw e r e o b t a i n e d f r o m N C B I a n d t r a n s c r i p t o m ed a t a b a s e s.M o t i f s s e q u e n c e sw e r e i d e n t i f i e da n du n d e r l i n e d.T h e t w o A P2d o m a i n s a r e r e p r e s e n t e db y A P2-R1a n dA P2-R2图8P p B B M L蛋白亚细胞定位情况F i g.8 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fP p B B M L注:用含G F P空载及P p B B M L-G F P重组质粒瞬时转化烟草细胞(图中标尺:50μm)N o t e:T o b a c c oe p i d e r m a l c e l l s w e r e t r a n s i e n t l y t r a n s f o r m e dw i t h c o n s t r u c t s c o n t a i n i n g e i t h e r c o n t r o l(G F P a l o n e)o r P p B B M L-G F P f u s i o n p l a s m i d(b a r s:50μm) 2.5P p B B M L基因的表达分析2.5.1不同组织部位结果表明,P p B BML在不同组织部位的表达量差异较大,存在组织特异性㊂该基因在花药中的表达量最高,是不定根中的8.37倍,显著高于其它组织(P<0.05);在茎基和幼叶中的表达量显著高于根204第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L 基因的克隆及表达模式分析茎㊁老叶和不定根(P <0.05),在不定根中表达量最低(图9)㊂2.5.2 不同外源激素处理 为了研究外源性激素对P p B B M L 表达量的影响,对分别喷施N A A ,G A 3,6-B A ,A B A ,E T H ,M e J A 和E B R 的草地早熟禾叶片进行荧光定量分析㊂结果表明,6-B A 处理后的P p B B M L 表达量均高于C K ,处理2h 时表达量最高,是对照的2.91倍,并显著高于其余时间(P <0.05)㊂N A A (除0h 外),M e J A 和E B R (除4h 外)处理后的P p B B M L 表达量均高于C K ,其中,N A A 处理12h ,P p B B M L 表达量最高,是对照的6.64倍;M e J A 和E B R 处理24h ,P p B B M L 的表达量最高,分别是对照的3.47倍和1.91倍㊂G A 3处理后的P pB B M L 表达量均低于C K ,且差异显著(P <0.05)㊂A B A 和E T H 处理后的P p B B M L 表达量在不同时间点表现出不同的变化,A B A 在处理24h 的表达量最高,E T H 在处理12h 表达量最高(图10)㊂图9 草地早熟禾B B M L 基因在不同组织中的表达分析F i g .9 E x p r e s s i o na n a l ys i s o f B B M L g e n e i nd i f f e r e n t t i s s u e s o f P o a p r a t e n s i s注:图中不同小写字母表示在0.05水平差异显著(P <0.05)㊂下同N o t e :D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i nt h ef i g u r er e p r e s e n ts i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e a t t h e 0.05l e v e l .T h e s a m e a s b e l ow图10 P pB B M L 基因在激素处理下的表达分析F i g .10 E x p r e s s i o na n a l y s i s o f P pB B M L g e n eu n d e r h o r m o n e t r e a t m e n t 304草 地 学 报第32卷2.5.3 不同外植体愈伤组织形成阶段 分别以草地早熟禾的根尖和叶基为外植体,分析愈伤组织形成阶段P p B B M L 基因表达量的动态变化㊂结果显示,以根尖为外植体时,P p B B M L 表达量呈先上升后下降的趋势,接种第2d 时达最大,与其它时间点差异均显著(P <0.05);接种第8d 时,表达量最低,显著低于接种第1d 和第3d (P <0.05)㊂以叶基为外植体时,P pB B M L 表达量在接种第2-3d 时显著高于其它时间点(P <0.05),并在接种第2d 达最大值,显著高于接种第3d (P <0.05);接种第8d 时,表达量最低,与接种第3d 差异显著(P <0.05)(图11)㊂图11 P pB B M L 基因在愈伤组织中的表达分析F i g .11 E x p r e s s i o na n a l y s i s o f P pB B M L g e n e i n c a l l u s t i s s u e 注:RC 0,根尖诱导愈伤组织第0天;R C 1,根尖诱导愈伤组织第1天;R C 2,根尖诱导愈伤组织第2天;R C 3,根尖诱导愈伤组织第3天;R C 8,根尖诱导愈伤组织第8天㊂L C 0,叶基诱导愈伤组织第0天;L C 1,叶基诱导愈伤组织第1天;L C 2,叶基诱导愈伤组织第2天;L C 3,叶基诱导愈伤组织第3天;L C 8,叶基诱导愈伤组织第8天N o t e :R C 0,D a y 0o f r o o t t i p c a l l u s i n d u c t i o n ;R C 1,D a y 1o f r o o t t i p c a l l u s i n d u c t i o n ;R C 2,r o o t t i p c a l l u s i n d u c t i o n d a y 2;R C 3,r o o t t i p ca l l u s i n d u c t i o nd a y 3;R C 8,D a y 8o f r o o t t i p c a l l u s i n d u c t i o n .L C 0,D a y 0o f l e a fb a s ec a l l u s i nd u c t i o n ;L C 1,D a y 1of l e a f b a s e c a l l u s i n d u c t i o n ;L C 2,D a y 2o f l e a f b a s e c a l l u s i n d u c t i o n ;L C 3,D a y 3o f l e a f b a s e c a l l u s i n d u c t i o n ;L C 8,D a y 8of l e a f b a s e c a l l u s i n d u c t i o n 3 讨论3.1 草地早熟禾B B M L 蛋白的理化性质分析解析蛋白的理化性质和空间结构对于认识蛋白的功能㊁功能的执行㊁生物大分子间的相互作用等具有重要意义㊂Y a v u z 等[28]对高粱B B M s 蛋白进行理化性质分析发现,S b B B M -l i k e 1的等电点(p I )为4.85,S b B B M -l i k e 2的等电点为5.99,两个蛋白均为酸性蛋白;S b B B M -l i k e 1被分类为高分子量蛋白质(171k D a ),而S b B B M -l i k e 2为低分子量蛋白质(72k D a );两个蛋白均定位于细胞核㊂杨紫彤等[29]对毛白杨(P o pu l u s t o m e n t o s a )B B M s 蛋白进行理化性质分析发现,P t o B B M 1和P t o B B M 2蛋白分子量各为78.71k D a 和78.44k D a ,理论等电点为5.95和6.08,均属于酸性蛋白;不稳定系数为47.46和48.63,总平均疏水性为-0.816和-0.758,推测均为亲水性不稳定蛋白,不具有信号肽;二㊁三级结构均以不规则卷曲为主;2个B B M 蛋白均定位于细胞核㊂本文检索并克隆得到1个草地早熟禾B B M L基因,对该基因编码的蛋白进行理化性质分析,发现P pB B M L 蛋白属于酸性蛋白;并且是亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽;二㊁三级结构均以不规则卷曲和α-螺旋为主,与高粱和毛白杨B B M s 蛋白具有相似的理化性质和空间结构㊂蛋白结构决定着其功能,S b B B M 和P t o B B M 已被报道在胚性愈伤组织形成中发挥作用[28-29]㊂因此,推测P pB B M L 可能具有促进草地早熟禾胚性愈伤组织发生的功能㊂3.2 草地早熟禾B B M L 蛋白的保守结构域和基序分析基因的结构域是调控顺式作用元件活性和基因表达的重要因素[30]㊂B B M 基因隶属于A P 2亚家族,该亚家族具有2个A P 2结构域㊂此外,该亚家族还含有3个特定的e u A N T 2-4基序和e u A N T 5,e u A N T 6,b b m -1,b b m -2和b b m -5等5个基序[31]㊂b b m -1是B B M /B B M L 的特有基序,存在于所有已鉴定的B B M /B B M L 基因的蛋白序列中,而e u -A N T 5,b b m -2和b b m -5等基序并不一定在B B M /B B M L 中存在[32]㊂小麦的B B M s 蛋白均有两个404第2期余江弟等:草地早熟禾B B M L基因的克隆及表达模式分析A P2结构域,并具有保守的b b m-1和e u A N T2-e u-A N T6基序;T aB B M蛋白C端的b b m-2,b b m-3和b b m-4基序与其它植物的B B M同源蛋白相比,保守性较低[33]㊂高粱的B B M蛋白具有2个A P2保守结构域和保守的b b m-1,e u A N T2-e u A N T6基序; S b B B M蛋白的C端含有b b m-2,b b m-3和b b m-5基序,但保守性较低[32]㊂本研究通过对草地早熟禾B B M L蛋白序列的同源比对发现,该蛋白具有两个A P2结构域,同时具有b b m-1和e u A N T2,e u-A N T3,e u A N T4基序,但该蛋白的e u A N T2-4基序中存在个别氨基酸残基差异㊂研究表明,A P2结构域高度保守并能特异性结合顺式作用元件如GC C-b o x(核心元件A G C C G C C)或D R E/C R T(核心元件A/G C C G A C)等,在调控植物发育方面具有重要的功能[34]㊂b b m-1基序是B B M蛋白的识别基序,该基序与e u A N T2基序协同工作以调节体胚发生[35]㊂缺失和结构域交换分析表明,B n B B M1需要b b m-1基序协同e u A N T2来诱导拟南芥的体胚发生[35]㊂由此推断,B B M蛋白中的b b m-1和e u A N T2基序协同作用是该蛋白发挥功能的关键㊂草地早熟禾B B M L蛋白的e u A N T2基序存在氨基酸残基变异,这是否会对该蛋白的功能产生影响还有待进一步的研究㊂3.3草地早熟禾B B M L蛋白的系统进化分析系统进化分析可以反映物种之间的进化关系,以及某个基因或蛋白质之间的关系或功能㊂李晓慧[33]检索得到3个小麦B B M基因(T a B B M-3A, T a B B M-3B和T a B B M-3D),进化树分析结果显示3个小麦B B M与二穗短柄草(B r a c h y p o d i u m nd i s-t a c h y o n)的A I L7(A I N T E G UM E N T A-L I K E7)㊁水稻的B B M3和P L T1(P L E T H O R A1)以及玉米㊁谷子(S e t a r i a i t a l i c a)㊁高粱等的B B M蛋白在同一分支上,同源性较高㊂韩少鹏[32]检索得到2个高粱的B B M基因(S b B B M-p u t a t i v e1和S b B B M-p u t a t i v e2),对高粱B B M基因编码的蛋白进行系统进化分析发现,高粱B B M蛋白与拟南芥的B B M㊁水稻的B B M㊁玉米的B B M和油菜的B B M蛋白聚在一起㊂D u等[2]对玉米B B M s基因编码的蛋白进行系统进化分析发现,玉米B B M与水稻B B M3聚集在一起;玉米B B M2与水稻B B M2聚在一起,具有78%的相似性;玉米B B M2与玉米B B M具有43%的相似性㊂本研究对草地早熟禾B B M L蛋白进行系统进化树分析发现,P p B B M L与拟南芥的B B M L 和小麦的B B M1聚集在一起,并与小麦B B M1的亲缘关系最近㊂有研究指出,T a B B M1基因的异位表达可促进体胚的形成[33],因此,推测P p B B M L基因也具有诱导草地早熟禾体胚形成的功能㊂3.4草地早熟禾B B M L基因的组织特异性表达模式分析表达模式分析可揭示不同物种的基因在不同细胞类型㊁组织器官或发育阶段中的表达差异,以此推测基因的功能㊂Y a v u z等[28]研究了高粱的B B M基因在不同组织中的表达模式,发现S b B B M-l i k e1在幼苗的根中表达量最高,其次为胚性愈伤组织,在叶片和地上部组织中表达量较低;与S b B B M-l i k e1相比,S b B B M-l i k e2在胚性愈伤组织中的表达增加了近200倍㊂李晓慧[33]研究了小麦的幼根㊁节间㊁叶㊁茎尖㊁小穗㊁小花㊁14d的胚和不同时期的籽粒中B B M基因的表达模式,结果表明T a B B M s在14d 的胚中的表达水平最高,在幼根㊁叶和不同发育时期的籽粒中也有不同程度的表达,其他部位几乎不表达㊂B i l i c h a k等[36]在小麦胚性小孢子培养中发现T a B B M的表达在籽粒和根中富集㊂B o u t i l i e r等[37]利用m R N A原位杂交技术研究了甘蓝型油菜小孢子衍生的胚和拟南芥种子发育过程中B B M的表达,发现在发育的早期和晚期,在整个小孢子和合子胚发育时期中都检测到B B M表达㊂D u等[2]对培养0,1,2,4,6和8d的玉米未成熟胚进行表达模式分析,发现Z m B B M和Z m B B M2在培养的第2d 开始显著且快速的表达,Z m B B M在第6d时达到峰值,Z m B B M2在第8d时达到峰值㊂本研究发现草地早熟禾的P p B B M L在花药中的表达量最高,其次是茎基,在不定根中的表达量最低㊂K h a n d a y 等[38]发现O s B B M1是在花药中特异表达的转录因子基因㊂在甘蓝型油菜未成熟的花粉粒诱导产生的体胚中分离获得了B B M基因,该基因过表达能促进体胚的发生[37]㊂因此,过表达草地早熟禾的P p B B M L基因很可能也会促进体胚的发生㊂3.5草地早熟禾B B M L基因在激素诱导下的表达模式分析L i等[39]在落叶松(L a r i xk a e m p f e r iˑL.o l-g e n s i s)的B B M中鉴定了许多重要的潜在顺式作用元件,例如A U X R E P S I A A4元件(参与生长素反应性和根分生组织基因表达的元件)㊁A R R1A T元件(参与细胞分裂素反应的元件)㊁G A R E1O S R E P1元504。
影响草地早熟禾原生质体生长和分裂的生理生化因素分析
体在培养过程中生长状态 良好 ， 持续分裂分化 ， ‘ 而 橄榄球Ⅱ ’ 生质体在分裂数次后死 亡． 号 原 在愈伤组织更换新鲜培
（ 甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室 ， 美草地畜牧业 可持续研究 中心 ， 中一 甘肃 兰州 ７０ ７ ） ３ ００
摘要 ： 以草地早熟禾 ‘ 午夜Ⅱ 、新格莱德 ’ ‘ 号’ ‘ 和 橄榄球Ⅱ ３ 号’ 个品种继代 ２ 次的愈伤组织为材料 ， 行原 生质体 Ｏ 进 培养 ， 测定愈伤组织可溶性蛋 白质含量、 氨基酸含量 、Ｏ Ｓ Ｄ和 Ｐ Ｘ酶活性． Ｏ 结果表明 ： 个草地早熟禾品种原生 质体经 ３
Ａｂ ｔａ ｔＴｈ ａｌｓｓ ｂ ｕｔｒｄ ｆｒ２ ｉ ｓｆ ｍ ｈ Ｍ ｉｎｇ ｔ ’ ‘ ｇａ ｅ ｎ Ｒｕ ｂ ［’ ｉｈｗｅｅｖ — ｓｒｃ ： ｅｃｌ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ０ｔ ｕ ｕ ｍｅ ｒ ｔ ｅ‘ ｄ ｉｈ１ ， Ｎｕ ｌｄ ’ａ ｄ‘ ｇ ｙ［ｗｈｃ ｒ ａ ｏ
ｒｅｉｓｏ ａｐ ａ ｅ ｓ ｒ ｓｄａ ｔｒａ ｒｐｏ ｏ ｌｓｓｃ ｌ ｒ ｎ ｓ ｒ ｗｔ ｔｔｓｗｅｅｏ ｓｒ ｅ ｉ ｐ — ｉｔ ｆＰｏ ｒ ｔｎｉ ｗｅｅｕ ｅ ｓｍａｅｉ１ ｏ ｒｔ ｐａｔ ｕｔ ｅａ ｄｉ ｏ ｈｓａｕ ｒ ｂ ｅｖ ｄｉ ｔ ｓ ａ ｅ ｓ ｆ ｕ ｔｇ ｎ ｈ ｐ ｒＭ ｅｎ ｉ ，ｈ ｏｕ ｌ ｐ ｏｅｎ ｃ ｎｅ ｔａ ｄｉ ｏ ｔｎ ｈ ｎ ｅｗｉｈｃ ｌ ｓｇｏ ｈ ａ ｎ ｃｄｃ ｎｅ ｔＳ ｅ． ａ ｗｈｌ ｔｅｓ ｌｂｅ ｒ ｔｉ ｏ ｔｎ ｎ ｓｃ ｎ ｅ ｔ ａ ｇ ｔ ａｌ ｒｗｔ ，ｍｉｏａｉ ｏ ｔｎ ， ０Ｄ ｎ ｅ ｔ ｃ ｕ ａｄ Ｐ ＯＸ ｃｉｉ ｅ ｒ ｅｅｍｉｅ ｈ ａｉｔ ｓ Ｔｈ ｅｕｔ ｎ ｉａｅ ｈ ｔ ｆｅ ５ｄｏ ｒ ｔｐａ ｔ ｕｔｒ ，ｈ ｒ — ａ ｔ ｔ ｓｗｅｅｄ ｔｒ ｎ ｄ ｉ ｔ ｅ３ｖ ｒｅｉ ． ｅｒｓ ｌ ｉｄｃ ｔｄｔａ ｔｒ１ ｆ ｏｏ ｌｓｓｃ ｌ ｅ ｔ ｅｐ ｏ ｖｉ ｎ ｅ ａ ｐ ｕ
草地早熟禾及其空间诱变矮化突变体叶片组织结构的比较观察
草地早熟禾及其空间诱变矮化突变体叶片组织结构的比较观察甘露;尹淑霞【摘要】To provide the foundation for the research about the molecules,physiology and resistance of Ken-tucky bluegrass and its dwarf mutant by space mutagenesis,leaf blades were investigated and measured under elec-tronic microscope and for morphological and anatomy characteristics.Results showed that the two dwarf mutant, which had wider and thinner leaf blades,all had more epidermal cells and smaller length-width ratio of up-epider-mal cells compared to the control.The further correlation analysis showed that the increase of cell number and broadening of epidermal cells might be the reason of the wider leaf in the dwarf strains.In addition,the stoma size and distribution of the dwarf mutants also were different from the pared to WT,the stoma density in dwarf plants was increased,but the stoma size was decreased,which was beneficial to the water transpiration diffu-sion.The study would provide a scientific basis for further research on the physiological and biological characteristic of these materials.%为给草地早熟禾及其空间诱变矮化突变体的生理、抗性及分子研究提供基础，对草地早熟禾野生型及矮化变异株系叶片的外观形态、表面组织结构进行了观察和测量。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
草地早熟禾（Paspalum notatum Flüggé）是一种常见的草地植物，广泛分布在热带和亚热带地区。
在草原生态系统中具有重要的生态和经济价值。
草地早熟禾的繁殖和病害抵抗性研究对于其种植和保护具有重要意义。
离体培养是研究植物组织发育和生理过程的一种重要方法。
愈伤组织是植物细胞再分化和再生的中心，对于研究植物组织培养、基因转化和细胞工程具有重要意义。
植物激素在植物组织培养中起着重要的调控作用，可以促进愈伤组织的诱导和增殖。
植物激素主要包括生长素、赤霉素、生长素和赤霉素等，它们在愈伤组织的诱导和增殖过程中起着不同的作用。
生长素是一种重要的促进细胞分裂和组织再生的激素，在愈伤组织的诱导过程中有很重要的作用。
赤霉素则是一种促进细胞分裂和伸长的激素，在愈伤组织的生长和分化过程中也有重要作用。
草地早熟禾愈伤组织的诱导主要通过外源激素的添加来实现。
文献中报道了不同浓度和比例的激素对草地早熟禾愈伤组织的影响。
在液体培养基中添加适量的生长素和赤霉素可以促进愈伤组织的生长和分化。
一般来说，生长素浓度低而赤霉素浓度高可以促进细胞增殖和伸长，而生长素浓度高而赤霉素浓度低可以促进愈伤组织的分化和器官再生。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导起着重要的调控作用。
在愈伤组织培养中，适当的添加生长素和赤霉素可以促进愈伤组织的生长和分化。
细胞分裂素和激素等其他激素也可以影响愈伤组织的诱导和增殖。
对植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导机制的深入研究有助于提高草地早熟禾的繁殖和抗逆能力，为其利用和保护提供科学依据。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导一、植物激素对愈伤组织诱导的影响愈伤组织是一种脱分化的植物组织，具有较强的再生和分化能力，是植物再生过程的关键环节。
植物激素在愈伤组织的诱导过程中起着重要的调节作用，不同种类和浓度的激素对愈伤组织的形成和再生过程有着不同的影响。
常见的植物激素包括赤霉素（gibberellins，GA）、生长素（auxin）、细胞分裂素（cytokinin）、赤霉酸（abscisic acid，ABA）等。
1. 赤霉素（GA）赤霉素是一种重要的植物激素，对植物生长发育和代谢过程具有重要的调节作用。
研究表明，适当浓度的赤霉素可以促进草地早熟禾愈伤组织的形成和再生能力，加快再生植株的生长速度。
赤霉素通过促进细胞分裂和分化，提高愈伤组织中细胞分裂和再生的频率，从而加快愈伤组织形成和再生植株的发育过程。
2. 生长素（auxin）3. 细胞分裂素（cytokinin）植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导作用主要通过调节愈伤组织细胞的生长、分化和再生过程实现。
植物激素可以影响细胞内激素信号传导通路和相关基因表达，从而调控愈伤组织的形成和再生过程。
1. 调节细胞分裂和增殖植物激素可以促进细胞的分裂和增殖，提高愈伤组织中细胞再生的频率和速度。
赤霉素、生长素和细胞分裂素可以促进细胞分裂和增殖，加快愈伤组织的形成和再生过程。
2. 调控基因表达植物激素可以影响细胞内激素信号传导通路和相关基因的表达，从而调控愈伤组织的形成和再生过程。
赤霉素、生长素、细胞分裂素和赤霉酸可以影响多个基因的表达，包括细胞分裂相关基因、生长发育相关基因和逆境适应相关基因等。
3. 提高抗逆性赤霉酸等植物激素可以提高植物对逆境的抗逆性，增加愈伤组织的逆境适应能力。
植物激素可以通过调节细胞内逆境信号传导通路和相关基因的表达，提高愈伤组织的抗逆性和逆境适应能力。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导具有重要的调节作用，包括促进细胞分裂和增殖、调控基因表达和提高抗逆性等。
草地早熟禾原生质体的培养及影响其分裂生长的生理因素分析
草地早熟禾原生质体的培养及影响其分裂生长的生理因素分析草地早熟禾（Poa pratensis）是一种广泛分布在草地和草原的多年生禾本科植物。
它以其茂密的绿色和耐寒性受到人们的喜爱，并被广泛用于草坪、高尔夫球场等景观绿化项目中。
为了满足对草地早熟禾的大规模种植需求，进行草地早熟禾原生质体的培养是一种有效的繁殖手段。
本文将探讨草地早熟禾原生质体的培养方法，并分析其分裂生长的生理因素。
草地早熟禾原生质体的培养方法可以通过离体培养来实现。
首先，选择健康的草地早熟禾植株作为供体植株，从其幼嫩部位（如幼苗的叶片和茎段）采集组织。
将采集的组织经过表面消毒处理，然后进行小块切割。
将切割后的组织转移到富含营养物质的培养基中。
常用的培养基包括MS培养基、B5培养基等。
培养基中添加适量的糖类、植物激素（如激素BA、KT等）和维生素可以促进原生质体的发育和分裂生长。
培养基应保持适宜的温度、光照和湿度条件，以提供良好的生长环境。
草地早熟禾原生质体的分裂生长受到许多因素的影响。
首先，植物激素在原生质体分裂生长中发挥着关键的调控作用。
激素BA促进细胞分裂，KT则促进细胞伸长和分化。
适宜的激素配比可以促进原生质体的发育和分裂。
其次，培养基的养分含量也影响着原生质体的分裂生长。
适量的糖类和无机盐对细胞分裂和细胞伸长至关重要。
过多或过少的养分供应都会影响原生质体的生长情况。
此外，光照和温度等环境因素也对原生质体的生长起到重要的调节作用。
适宜的光照和温度条件可以促进细胞分裂和伸长，从而促进原生质体的发育。
草地早熟禾原生质体的培养和分裂生长研究对于草地早熟禾的种植和繁殖具有重要的意义。
通过原生质体培养研究，可以大规模快速地繁殖草地早熟禾，提高整体种群的数量和素质。
同时，了解原生质体分裂生长的生理因素，有助于优化培养条件，提高原生质体的生长效率和质量。
此外，原生质体培养还为遗传转化、基因编辑等研究提供了重要的基础和手段。
总之，草地早熟禾原生质体的培养和分裂生长是一项重要且具有挑战性的研究。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
４ 种: ７５％ 乙醇消毒 ３０ｓꎬ 再 用 １％ ＮａＣｌＯ 消 毒 ５ｍｉｎꎬ
无菌水冲洗 ５ ~ ６ 遍ꎬ 之后将种子置于无菌滤纸ꎻ ７５％
乙醇消毒 ３０ｓꎬ 再用 １％ ＮａＣｌＯ 消毒 １０ｍｉｎꎬ 无菌水冲
洗 ５ ~ ６ 遍ꎬ 之后将种子置于无菌滤纸ꎻ ７５％乙醇消毒
６０ｓꎬ 再用 １％ＮａＣｌＯ 消毒 ５ｍｉｎꎬ 无菌水冲洗 ５ ~ ６ 遍ꎬ
基础ꎮ 结果表明ꎬ “ 如意” 最佳的初代和继代愈伤培养基为 ＭＳ 加 １ ０ｍｇ / Ｌ２ꎬ ４－Ｄ 加 ０ １ｍｇ / Ｌ６－ＢＡꎻ “蓝之梦”
最佳的初代和继代愈伤培养基为 ＭＳ 加 ３ ０ｍｇ / Ｌ２ꎬ ４－Ｄꎻ “优美” 最佳的初代愈伤培养基为 ＭＳ 加 ３ ０ｍｇ / Ｌ２ꎬ ４－Ｄꎬ 其
最佳的继代培养基为 ＭＳ 加 ２ ０ｍｇ / Ｌ２ꎬ ４－Ｄꎮ
关键词: 草地早熟禾ꎻ 愈伤组织ꎻ 组织培养ꎻ 植物激素
中图分类号: Ｓ－３ 文献标识码: Ａ
草地早熟禾 ( Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ Ｌ ) 为禾本科早熟禾
属ꎬ 是一种优质的冷季型草坪草ꎬ 其优点包括耐冷、
其再生体系的构建ꎮ 本研究选择 ３ 种抗旱性较强的草
地早熟禾品种ꎬ 研究不同激素种类和浓度对于其愈伤
组织诱导情况的差异ꎬ 筛选适宜的初愈培养基及继代
培养基ꎬ 为后续完整再生体系的构建提供数据ꎮ
ＤＯＩ: １０ １９７５４ / ｊ ｎｙｙｊｓ ２０２００４３０００１
菌水 ３０ｍｉｎꎮ 在无菌环境中进行消毒ꎬ 消毒方式分为
农业与技术 ※农业科学
表 １ 诱导培养基选用的激素组合
培养基编号
Ｎ－１
Ｎ－２
Ｎ－３
Ｎ－４
Ｎ－５
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导引言植物激素是一类具有广泛生物活性的有机物质，它们参与了植物的生长发育、信号传导、抗逆性等多种生理过程。
植物激素可通过调控植物的生长、发育和适应环境等生理活动而发挥重要作用，对植物细胞和组织的诱导具有重要影响。
草地早熟禾（Lolium perenne L.）是一种重要的牧草和草坪植物，对其愈伤组织的诱导具有重要意义。
本文将围绕植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导进行探讨，并为该领域的研究提供参考。
一、植物激素对愈伤组织的诱导作用1.1 胚乳素胚乳素（auxin）是一类重要的植物生长激素，它能够促进植物细胞的分裂和伸长，对植物的愈伤组织诱导具有重要作用。
研究表明，胚乳素能够促进愈伤组织的形成和增殖，加速组织再生和植株生长。
在草地早熟禾中，添加适量的胚乳素可以显著提高愈伤组织形成率和增殖速度，为草地早熟禾的组织培养和遗传改良提供了重要的参考。
2.2 调节蛋白合成植物激素还能够通过调节蛋白的合成和降解，影响愈伤组织的形成和增殖。
研究表明，胚乳素、赤霉素和细胞分裂素可以调节草地早熟禾中多种关键蛋白的合成和降解，促进了植物细胞的生长和分化，加速了组织再生和植株生长的过程。
2.3 调节植物激素的相互作用植物激素之间存在复杂的相互作用关系，它们能够通过调节彼此之间的代谢和信号传导，影响愈伤组织的形成和增殖。
研究表明，胚乳素、赤霉素和细胞分裂素的诱导作用受到了彼此之间的相互调节，它们之间的协同作用对草地早熟禾的愈伤组织诱导起到了重要的作用。
三、结论和展望本文通过综述了植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导作用及其机制，得出了以下结论：植物激素能够通过促进基因表达、调节蛋白合成和调节植物激素的相互作用等途径，对草地早熟禾的愈伤组织诱导起到重要作用。
本文也指出了当前研究中存在的不足之处，例如对植物激素诱导机制的具体分子调控机制还不够清晰，对植物激素诱导效应的细胞和分子水平机制研究欠缺等。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
草地早熟禾（Festuca arundinacea Schreb.）是一种重要的草地植物，具有抗旱、耐盐碱、适应性强等优良特性，被广泛应用于草原恢复、草坪建设等领域。
然而，草地早熟禾的繁殖性状和品种的快速育种仍然是亟待解决的问题，植物激素诱导愈伤组织的研究可以为解决这一问题提供技术支持。
植物激素是植物生长和发育中重要的内源性调节因子，其种类繁多，作用广泛。
激素诱导愈伤组织是一种常见的生物技术手段，是通过外源性激素诱导植物组织发生不同程度的分化，形成愈伤组织，从而实现某些快速繁殖或育种的目的。
本文研究了不同激素浓度对草地早熟禾叶片愈伤组织的诱导效果，并分析了激素类型和浓度对愈伤组织分化和生长的影响。
实验结果表明，不同浓度的IAA和6-BA对草地早熟禾叶片的愈伤组织形成有非常显著的诱导作用。
当IAA浓度为1.0 mg/L，6-BA浓度为0.5 mg/L时，愈伤组织的形成率最高，同时生长速度也最快。
此外，不同浓度的激素类型对愈伤组织的形态和结构也产生了显著的影响，高浓度的IAA和6-BA可以促进愈伤组织细胞的增生和分裂，形成茂密的愈伤组织。
以上实验结果表明，草地早熟禾叶片愈伤组织可以通过IAA和6-BA的诱导迅速形成，从而实现草地早熟禾的快速繁殖和育种。
因此，在草地早熟禾的育种和生产中，可以通过外源性激素的诱导方法，加速育种速度，提高效率，从而更好地满足市场需求。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导植物激素是一类具有广泛生长调节作用的化合物，对植物的生长发育起着重要的作用。
赤霉素、生长素、独脚金素、脱落酸、激素素等是植物中较为常见的激素。
近年来，关于植物激素对植物愈伤组织的诱导机制，已经成为植物生物学研究的热点之一。
草地早熟禾（Lolium multiflorum Lam.）是一种重要的牧草作物，具有广泛的适应性和良好的产草性。
本文将重点讨论植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导过程，旨在为进一步研究植物生长调控机制提供理论支持。
一、植物激素在愈伤组织诱导中的作用1. 赤霉素赤霉素是一种重要的植物生长素，对植物的生长发育起着重要作用。
研究表明，赤霉素能够显著促进草地早熟禾叶片愈伤组织的形成和增殖。
赤霉素通过调控细胞分裂和伸长，促进细胞再生和愈伤组织的形成。
赤霉素还能够调节愈伤组织中生长素和生长素转运蛋白基因的表达，进而影响愈伤组织的生长发育。
2. 生长素3. 独脚金素1. 激素信号传导途径植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导主要通过激素信号传导途径进行调控。
在植物细胞内，激素通过激活/抑制特定的信号传导途径，进而诱导/抑制愈伤组织的形成和增殖。
赤霉素能够通过激活赤霉素反应因子（ARF）和调节赤霉素原核受体（SMR）等基因，促进愈伤组织的形成和生长。
生长素能够通过激活生长素响应因子（GRF）和调节生长素原核受体（GRF）等基因，促进愈伤组织的形成和生长。
2. 基因表达调控3. 代谢途径调控1. 育种改良植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导具有重要的育种改良价值。
通过调控植物激素的组合和浓度，可以有效提高草地早熟禾的愈伤组织形成和增殖能力，进而加速育种改良进程。
通过适当增加赤霉素和生长素的浓度，可以促进草地早熟禾愈伤组织的形成和增殖，有效提高育种改良效率。
2. 分子生物学研究植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导还具有重要的分子生物学研究价值。
通过分析植物激素对愈伤组织形成和增殖的调控机制，可以深入理解植物激素在植物生长调控中的作用，为进一步研究植物生长调控机制提供理论支持。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
植物激素是一类对植物生长发育具有重要调控作用的生物活性物质，其对植物生长发
育的调控效应已经得到了广泛的认可。
植物激素包括赤霉素、生长素、赤霉酮、细胞分裂
素和硝基胺等一系列化合物，它们在植物的生长发育、光合作用、开花结果、免疫反应等
方面发挥着重要的作用。
植物激素不仅仅在植物的正常生长发育过程中扮演着重要的角色，它们还能够通过对植物体内各种生化反应的调节，对植物的生理代谢产生重要的影响。
本
文将探讨植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导的相关研究。
草地早熟禾（Festuca arundinacea）是一种重要的牧草种类，广泛分布于欧洲、亚洲和北美洲。
草地早熟禾广泛用于草坪、草场、牧场和高山地区的种植，并且作为优质饲草
和土壤保护植物，有着重要的经济和生态意义。
草地早熟禾的繁殖方式主要是通过种子繁殖，这限制了其在短时间内大面积扩展种植的可能性。
通过组织培养技术诱导草地早熟禾
愈伤组织，是一种有效的繁殖方式。
而植物激素在愈伤组织的诱导过程中起着重要的调控
作用，对愈伤组织的形成和增殖有着重要的影响。
赤霉素在愈伤组织的诱导中起着促进作用。
赤霉素具有促进植物细胞分裂和伸长的作用，能够促进植物的生长发育。
在草地早熟禾的愈伤组织诱导中，适当的赤霉素浓度能够
促进细胞分裂和增殖，从而促进愈伤组织的形成和增殖。
研究表明，适当的赤霉素处理可
以显著提高草地早熟禾愈伤组织形成的效率，促进其增殖和分化。
在草地早熟禾的愈伤组
织诱导过程中，适当的赤霉素处理是非常重要的。
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导
植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导【摘要】植物激素在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。
本研究旨在探讨植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导机制，通过对激素诱导对愈伤组织形成的影响、各种激素在诱导过程中的作用以及植物激素在草地早熟禾愈伤组织诱导中的应用进行深入分析。
研究表明，植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导具有重要意义，对于提高愈伤组织的形成效率和提升植物再生能力具有积极作用。
未来的研究可进一步探讨植物激素在诱导过程中的关键因素，以期为植物愈伤组织培养和再生生物技术的发展提供更多的理论支持。
【关键词】植物激素、草地早熟禾、愈伤组织、诱导、形成、作用、应用、重要性、未来研究、总结1. 引言1.1 研究背景草地早熟禾是一种重要的农作物，在种植过程中常常会遇到一些疾病或虫害的困扰，影响着作物的生长和产量。
针对这一问题，人们开始探索利用植物激素对草地早熟禾愈伤组织进行诱导，以促进愈伤组织的生成和增加作物的抗病能力。
植物激素是植物在生长发育过程中起着重要调节作用的一类生物活性物质，包括生长素、赤霉素、激素、脱落酸等。
通过研究植物激素在草地早熟禾愈伤组织诱导中的作用机制，可以为作物的抗病育种提供理论基础和技术支持。
对植物激素对草地早熟禾愈伤组织诱导的研究具有重要的理论和实践意义。
本文旨在探讨植物激素对草地早熟禾愈伤组织诱导的影响，并寻求未来研究的方向，以期为农作物生产提供更好的技术支持。
1.2 研究目的草地早熟禾是一种重要的禾本科农作物, 在农业生产中具有广泛的应用价值。
但是, 在草地早熟禾的生长过程中, 由于环境因素、病虫害等原因造成的损伤会导致愈伤组织的产生。
因此, 本研究旨在探究植物激素在草地早熟禾愈伤组织诱导中的作用机制, 以及激素诱导对愈伤组织形成的影响。
通过深入研究植物激素的作用机制和草地早熟禾愈伤组织的特点, 可以为进一步提高草地早熟禾的生长能力和抗逆性提供理论支持和实验依据。
同时, 也有助于揭示植物激素在愈伤组织诱导过程中的重要作用, 为植物生长发育领域的研究提供新的思路和方法。
干旱胁迫下甘肃野生草地早熟禾内源激素水平的动态变化
干旱胁迫下甘肃野生草地早熟禾内源激素水平的动态变化俞玲;马晖玲【摘要】The selected two indigenous bluegrass,Anding bluegrass,Xihe bluegrass,as samples to test the content of ABA,IAA and ZT in bluegrass leaves under drought stress by using HPLC.The results showed that ZT was decreased,ABA and IAA increased firstly and then deceased under drought stress.but compared with the control,ABA increased significantly and IAA decreased significantly.Moreover,the ratio of ZT/ABA,ZT/IAA and(ZT+IAA)/ABA decreased.Anding bluegrass had the biggest decreased in (ZT+IAA)/ABA under drought stress between two indigenous bluegrass.Therefore,the rank of drought resistance was Anding blue-grass > Xihe bluegrass based on the hormone level.%为了研究草地早熟禾在干旱胁迫下的响应机制,以甘肃安定野生草地早熟禾和西和野生草地早熟禾为试验材料,采用HPLC 法测定了干旱胁迫下草地早熟禾叶片中的 ZT,ABA 和 IAA 含量的变化。
结果表明：干旱胁迫下,ZT 含量下降,ABA 含量和 IAA 含量均先上升后下降,但与对照相比前者显著上升,后者显著下降,此外,ZT/ABA,ZT/IAA 和(ZT+IAA)/ABA 均下降。
橄榄球2 号草地早熟禾愈伤组织的诱导和植株再生张彦琴，梁改梅，杨丽莉，等
橄榄球2 号草地早熟禾愈伤组织的诱导和植株再生张彦琴，梁改梅，杨丽莉，等作者：张彦琴，梁改梅，杨丽莉，等来源：《山西农业科学》 2015年第1期张彦琴1，梁改梅1，杨丽莉1，刘晶玉1，郭先龙1，常建忠1，曲俊民2（1.山西省农业科学院旱地农业研究中心，山西太原 030031；2.太原生态工程学校，山西太原 030025）摘要：以橄榄球2号草地早熟禾种子为外植体，研究了不同培养基、不同类型的生长调节剂（2，4-D，BA等）对愈伤组织诱导、增殖继代、幼苗分化及植株再生的影响。
结果表明，在愈伤组织诱导培养基中附加10 mg/L AgNO3抑制了橄榄球2号叶芽生长，促进了愈伤组织的诱导效果；HNP2培养基诱导频率明显高于HNP3培养基，是橄榄球2号的最适诱导培养基；愈伤组织的增殖继代方面激素配比宜采用附加适当浓度的6-BA，TDZ的N19，N21，N22这3个培养基；继代1～2次的愈伤在分化培养基R1上培养分化率可达78.4%，再生频率可达30%～50%，为后期相关抗性基因的转化提供了良好的受体系统。
关键词：早熟禾；愈伤组织；植株再生中图分类号：S688.4文献标识码：A文章编号：1002-2481（2015）01-0007-03草地早熟禾是禾本科早熟禾属植物[1]，是温带地区重要的草坪草种之一，具有兼性无融合生殖特性，在城镇绿化、水土保持中起着重要的作用，在我国栽培历史悠久，种植面积迅速增长，主要分布在我国西北和华北地区[2]。
它具有叶色秀美、观赏性好、喜光耐阴、耐修剪、耐践踏等优点，广泛用于公园、机关、学校、居住区、运动场等地绿化。
但它具有一些缺点，如易受病虫为害、抗热性较差，在气温达到25 ℃左右时，逐渐枯萎，抗旱能力不强等。
由于草地早熟禾兼性无融合生殖特性，常规育种技术如杂交育种等应用起来比较困难[3]。
随着现代生物技术发展，草地早熟禾遗传转化已有成功报道[4-8]，因此，通过生物技术，可以在一定程度上对这些草地早熟禾进行改良，改良成功的关键首先依赖良好的植物受体系统的建立。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
甘
肃
农
业
大
学
学
报
第 ２期 ７ ４ ￣７ ９
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＡＮＳ Ｕ ＡＧＲＩ Ｃ ＵＬ ＴＵ ＲＡＬ ＵＮＩ ＶＥＲＳ Ｉ ＴＹ
第 ４ ８卷 双 月 刊
草 地 早 熟 禾 愈 伤组 织 诱 导 和分 化 中 内源
激 素水 平 分 析
Ｔｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ｃ ｕｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎｄ ｅ ｎ ｄｏ ｇｅ ｎｏ ｕ ｓ ｈｏ ｒ ｍｏ ｎｅ ｓ ｃ ｈ ａ ｎｇ ｅ ｏ ｆ Ｐｏ ａ ｐｒ ａｔ ｅ ｎｓ ｉ ｓ
Ｚ Ｈ ＡＮＧ Ｙｕ ａ ｎ － ｙ ｕ ａ ｎ， Ｍ Ａ Ｈｕ ｉ — ｌ ｉ ｎ ｇ， ＹＵ Ｌｉ ｎ ｇ， ＺＨ ＡＯ Ｙｕ ａ ｎ
０ ． ４ ９ ５ ｇ ／ ｇ 和０ ． ６ ２ ９ ｇ ／ ｇ ，ＡＢ Ａ和 Ｚ Ｔ含 量 在 愈伤 组 织 培养 和分 化 过程 中一 直处 于 较 低 水平 ， ＡＢ Ａ分 别 为 ０ ． １ ２ ０ ｇ ／ ｇ 和０ ． １ ４ １ ｇ ／ ｇ ， Ｚ Ｔ分别为 ０ ． １ １ １ ｇ ／ ｇ和 ０ ． ２ ０ ２ ｇ ／ ｇ ， 二者在胚 性愈伤组 织形成期含 量逐渐升 高 ， 在 愈 伤组织 分 化 能力 强 的时期 也 有 升 高趋 势 ， 对 胚 性 愈 伤组 织 的形 成 和 分 化 出芽 有促 进 作 用 ； 高 Ｚ Ｔ： Ｉ ＡＡ 和 高
ＡＢ Ａ： Ｉ ＡＡ 有利于愈伤组织 的生长发育 ， 并促进胚性 愈伤组织 的形成 ， 高 ＡＢ Ａ： Ｉ Ａ Ａ有利于愈伤组织分化形成 芽． 关键词 ： 草地早熟禾 ； 愈伤组织 ； 生 长素 ； 脱落酸 ； 细胞分裂素
中 图分 类号 ： Ｓ ５ ４ ３ 文献标志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：１ ０ ０ ３ — ４ ３ １ ５ （ ２ ０ １ ２ ） ０ ６ — ０ ０ ７ ４ － ０ ６
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｃａ ｌ ｌ ｕ ｓ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｆ ａ ｃ ｕ ｌ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｐ ｏ ｍｉ ｃ ｔ ｉ ｃ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｅ ｓ Ｐｏ ａ ｐ ｒ ｅ ｔ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ Ｌ ．。 Ｃ Ｖ ． ‘ Ｍｉ ｄ ｎ ｉ ｇ ｈ ｔ Ｉ Ｉ ’ ， Ｃ Ｖ ． ‘ Ｎｕ ｇ ｌ ａ ｄ ｅ ’ａ ｎ ｄ Ｃ Ｖ ． ‘ Ｒｕ ｇ ｂ ｙ Ｉ Ｉ ’ ， ｂ ｙ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｉ ｒ ｍａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｓ ｅ ｅ ｄ ｓ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｃ ａ ｒ ｒ ｉ ｅ ｄ ｏ ｕ ｔ ． Ｔｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｅ ｎ ｄ ｏ ｇ ｅ ｎ ｏ ｕ ｓ ｐ ｈ ｙ ｔ ｏ ｈ ｏ ｒ ｍｏ ｎ ｅ ｓ（ Ｉ ＡＡ ， ＡＢＡ ， Ｚ Ｔ） ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｉ ｔ ｉ ａ ｌ ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｉ ｒ ｃ ａ ｌ ｌ ｕ ｓ ａ ｔ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｓ ｔ ａ ｇ ｅ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｅ ｓ ｔ ｉ ｍａ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｈ ｉ ｇ ｈ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｎ ｃ ｅ ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｒ ａ ｔ ｅ ｏ ｆ ｃ ａ ｌ ｌ ｕ ｓ ｈ ａ ｄ ｐ ｏ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｈ ｏ ｒ ｍｏ ｎ ｅ ｌ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｆ Ｉ ＡＡ ａ ｎ ｄ ＡＢＡ ｉ ｎ ｍａ —
张媛媛 ， 马晖玲 ， 俞玲 ， 赵嫒
（ 甘肃农业大学草业学 院， 草业 生态 系统教育部重 点实验室 ， 中一 美草地畜牧业可持续
研究 中心 ， 甘肃 兰州
７ ３ ０ ０ ７ ０ ）
摘要 ： 以草地早熟禾 ‘ 午夜 ２号’ 、 ‘ 新格莱德 ’ 、 ‘ 橄榄 球 ２号 ’ 成熟种子 为材料 ， 进行 愈伤组 织的诱导 和分化 培 养， 利用高效液相色谱法对愈伤组织在不同培养期 中的内源激素生长素（ Ｉ ＡＡ） 、 脱 落酸 （ ＡＢ Ａ） 、 玉米素 （ ｚ Ｔ ） 进行测
ｏ ｆ Ｇｒ ａ ｓ ｓ ｌ ａ ｎ ｄ Ｅｃ ｏ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ， Ｍｉ ｎ ｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｅｄ ｕ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 。 Ｓ ｉ ｎ ｏ － Ｕ． ｓ － Ｃｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｓ ｆ ｏ ｒ
Ｇｒ ａ ｚ ｉ ｎ ｇ ｌ ａ ｎ ｄ Ｅｃ ｏ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ Ｓ ｕ ｓ ｔ ａ ｉ ｎ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ， Ｌａ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕ ７ ３ ０ ０ ７ ０， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
定和分析． 结果表明 ： 愈伤组织诱导率 与成熟种子 中 Ｉ Ａ Ａ和 Ａ ＢＡ水平呈正相关 ． ３个 品种种 子 中的 Ｉ ＡＡ水平相对
较高 ， 分别为 ０ ． ５ ７ ４ 、 ０ ． ３ ９ ３和 ０ ． ４ １ ５ ９ ｇ ／ ｇ ， 内源激素 Ａ Ｂ Ａ 的含量微 小 ， 分 别为 ０ ． １ ５ ７ 、 ０ ． ０ ８ ８和 ０ ． １ ２ ３ ｇ ／ ｇ ， Ｚ Ｔ含 量在 ３ 个 品种 间差异不大 ； 在供试材料愈伤组织 的继代培 养和分化 阶段 ， Ｉ ＡＡ含量在 ‘ 午 夜 ２号 ’ 中始终处 于较高 的水 平 ， 分别为 ０ ． ４ ２ ５ ９ ｇ ／ ｇ和 ０ ． ５ ５ ４ ￣ ｇ ／ ｇ ， 变 化 幅度 不 大 ， 在愈伤组织生长旺盛和分化成芽期最高， 分 别 为