11.3愈伤组织的诱导、形成及分化04
愈伤组织的诱导形成及分化
愈伤组织的诱导形成及分化第五章愈伤组织的诱导、形成及分化第⼀节愈伤组织的诱导、形成及特点⼀、愈伤组织的诱导和形成愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的⽆特定结构的组织。
经⼀段时间的⽣长和增殖以后，在其内部出现⼀定程度的分化，产⽣出⼀些具有分⽣组织结构的细胞团、⾊素细胞或管状分⼦。
植物外植体在培养基和外界环境的作⽤下，经过⼀个复杂的过程形成愈伤组织，即：外植体＋培养基＋环境愈伤组织愈伤组织的形成⼀般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。
图4.1 愈伤组织的形成特点1. 诱导期愈伤组织诱导期⼜称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂⽅向和代谢⽅式，合成代谢活动加强，⼤量合成蛋⽩质和核酸物质，为细胞分裂做准备。
诱导期的长短因植物种类、外植体的⽣理状态和外部因素⽽异，即使是同⼀种物种不同基因型同⼀外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。
有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），⽽有的植物诱导期需要数天（胡萝⼘）。
刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h ，但经贮藏5个⽉后，诱导期延长为2天。
2. 分裂期外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发⽣分裂，细胞脱分化。
愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜⾊浅⽽透明（见图4.2）。
分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。
⼩麦幼胚分裂期分裂期分化期分化期图4.2 ⼩麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期（东北农业⼤学⼩麦研究室，李⽂雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进⼊分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和⽣理状况⽽有很⼤差异。
烟草、胡萝⼘等的脱分化很容易，⽽⽲⾕类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，⽽成熟的⽼组织较难。
进⼊分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发⽣分化，产⽣新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可⽆限制地进⾏细胞分裂增殖，维持不分化的状态。
植物生物技术 第三章 植物愈伤组织的诱导与分化培养
第一节愈伤组织的诱导和继代培养
2. 愈伤组织的形态和细胞学特征
• 根据组织学观察、外观特征及其再生能力、再生方式等，愈伤组织分成两大类 ：胚性愈伤组织（embryonic callus，EC）和非胚性愈伤组织（non-embryonic callus，NEC）。
• 愈伤组织在长期的培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞，或者形成体 细胞胚，这种能够形成体细胞胚的愈伤组织叫做胚性愈伤组织(embryogenic callus)
愈伤组织 体细胞胚
再生植株
第二节 愈伤组织分化与植株再生
第二节 愈伤组织分化与植株再生
2. 植物体细胞胚的产生方式及结构特征
• 胚状体起源于外植体表面已分化的细胞 • 形成层细胞或薄壁细胞转变成迅速分裂的细胞，形成拟分生组织的细胞团和
小块愈伤组织，进而产生体细胞胚 • 在悬浮培养时,游离细胞产生细胞团,这些细胞团长大变成胚性细胞复合体,
Quiroz-Figueroa et al., 2007. Plant Cell Tiss Organ Cult
第二节 愈伤组织分化与植株再生
4. 体细胞胚的起源：
• 两种起源途径: 单细胞起源和多细胞起源
单细胞起源：可见单细胞发生的均 衡细胞分裂，胚与母体组织之间以一 个类似胚柄的结构相连 (Williams
一、器官发生与植株再生
• 器官发生：是指培养条件下的组织 或细胞团（愈伤组织）分化形成不 定根（adventitious roots）、 不定芽（adventitious shoots） 等器官的过程 。
第二节 愈伤组织分化与植株再生
1、器官分化过程：三个生长阶段
• 第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织
and Maheswaran 1986).
植物生物技术 愈伤组织的诱导继代及分化
⑶先芽后根： 愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心，从中仅分化出芽，一般情况下待芽 长到一定大小时，切下移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。有些植物在分 化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多数植物均属这 类正常的分化途径，这类苗移栽较易成活。 ⑷先根后芽： 有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤组织的根部 上再分化出芽，有的将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至在根 端也能分化出芽。
长素降低些，尤其是使用2，4-D时。 一般地，经过继代培养的愈伤组织在稳定生长1～2代后，具有S型生长曲线。开 始一周生长缓慢，中间3周生长很快，4周以后生长又变迟缓。
第二节 悬浮培养
悬浮培养:一般是把一些小块生长旺盛的愈伤组织
放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤 组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体。 愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一 的细胞，而且细胞增殖速度快，适宜进行大规模
（1）三角烧瓶容纳的培养基占总容积的20%～30%，培养基含量可随培养物量的减 少而减少； （2）转速一般为80～100 r/min； （3）细胞或愈伤组织的生长呈典型的S型曲线，即延滞期（lag phase），对数生长 期（log phase），然后逐渐减慢，直至停止。
3、愈伤组织的生长特性
一般情况下，25℃下培养的愈伤组织需要每4~6周继代一次。大多数研究工作表
官。可以把愈伤组织分化出芽、根器官概括为以下几种方式：
⑴单极分化： 愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根无芽或 者有芽无根的现象。 ⑵双极分化： 愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，其中有的分化芽， 有的分化根，根芽之间并无输导等组织沟通，在培养瓶内靠愈伤组织提供养料， 这种以愈伤组织隔离着的芽和根的苗，常常不能移栽成活。
第二节愈伤组织中的形态发生
2. 体细胞胚状体在发育早期的特征。在非洲紫
罗兰叶片培养过程中，叶片逐渐变大、肥厚， 形肿胀突起，表面逐渐出现密集的小突起，它 同芽点不同，初为淡绿色，逐渐转绿，呈球形 小点，用显微镜观察，可到叉状对生的子叶原 基。有些胚状体容易从形态、发生数量等方面 加以观察区分出来的，但有些胚状体在发育的 早期与发育的芽难以区分。1971年，Haccius提 出鉴别胚状体的标准：（ 1 ）胚状体具有极性， 出现茎端和根端，是一种单极性结构；（ 2 ） 在组织学上，胚状体的维管组织分布呈“Y”字 形，一般与愈伤组织或外植体的维管组织无联 系。
第二节 愈伤组织中的形态发生
愈伤组织通过再分化形成再生植株的方
式主要有三种： （1）先产生芽后在茎的基部长根； （2）先长根再长芽； （3）愈伤组织的不同部位分别形成根和 芽。
一．愈伤组织器官的形成
一般愈伤组织开始分化时，由大小不等
的细胞开始逐渐形成大小均匀的细胞， 保持相对稳定状态。在芽分化时，从愈 伤组织的表层开始，属外起源；但根发 生在愈伤组织的深处，与整体植株发生 类似，是内起源。愈伤组织的外部形态 业随分化而改变，一般右疏松转向紧密。
矮牵牛叶片诱导的愈伤组织
一．愈伤组织的诱导
1．一般认为，植物各器官和组织均有发
生愈伤组织的可能性。而且还认为愈伤 组织诱导成败的关键不在于植物材料的 来源，主要在于培养的条件。其中植物 生长调节剂是诱导愈伤组织成败的极为 重要因素。用于诱导愈伤组织形成的常 用激素是2.4-D、IAA、和NAA，所需浓 度在0.01~10mg/L范围内；常用的细胞分 裂素是激动素、玉米素和6-BA，使用的 浓度范围在0.1~10mg/L。
第一节 愈伤组织诱导和分化
已有特定结构与功能的植物组织，在一
愈伤组织培养 (1)
胡萝卜愈伤组织
愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导与分化 一、愈伤组织的诱导
在进行愈伤组织培养中，应根据不同的培养目的，获取不同的 外植体。 外源激素是植物愈伤组织诱导过程中不可缺少的组成成分。
第一节 愈伤组织的诱导与分化 二、愈伤组织细胞的分化
从单个细胞或外植体上形成典型的愈伤组织，大致要经历 三个时期：
愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导与分化
二、愈伤组织细胞的分化
质地不同的两种愈伤组织有时是可互变的，有时是不可逆 ห้องสมุดไป่ตู้。脆性愈伤组织由松散排列的细胞组成，而坚实愈伤组织则 由紧密排列的细胞组成。
加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆； 反之，减低或除去生长物质，则松脆愈伤组织可转变为坚实。
素而异。 菊芋1d，胡萝卜几天， 不同的光照条件，诱导情况不同，一般弱光易于诱导 ，且
分裂频率高。
愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导与分化
二、愈伤组织细胞的分化
外源激素是愈伤组织诱导过程中不可缺少的组成成分，是一 种诱导剂，能诱导细胞开始分裂，外源生长物质往往是通过调 整它的种类和浓度来诱导细胞开始分裂的。最常用的有2，4－ D、NAA、IAA和细胞分裂素等。2,4－D处理静止状态的组织 时，细胞的RNA含量明显增加，而且2，4-D可积累在分裂细胞 的核仁中。
愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导与分化
二、愈伤组织细胞的分化
（3）细胞的体积不再减小 愈伤组织分化时外植体细胞的大小发生十分明显的变化， 生长的愈伤组织的细胞平均大小不再减小，至此以后，保持相 对不变。 （4）出现各种类型的细胞 如薄壁细胞、分生细胞、管胞、石细胞、纤维细胞、色素细 胞、毛状细胞以及细胞丝状体等。 （5）出现一定的形态特征 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡 绿色或绿色的，老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。
实验二愈伤组织的诱导与分化
实验二 愈伤组织的诱导与再分化一、目的掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。
二、原理以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。
愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。
对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；四、仪器设备及用具（一） 仪器设备超净工作台 培养室（二） 用具（每组5人用量）量筒：100ml ×2培养皿：￠9cm ×1三角瓶：50ml ×2(无菌)，1000ml ×1枪形镊：×4无菌滤纸：（10cm ×10cm ）×5五、试剂及培养基（一） 试剂75%酒精，2% NaCLO ，无菌水(每组1瓶400ml)(二) 培养基1、诱导培养基：N 6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l2、分化培养基：N 6+ CuSO 4·5H 2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l六、实验步骤1、接种室、培养基及用具表面消毒用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。
之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、消毒剂的配制（1）、75%酒精：每组配95ml 。
量取95%酒精75ml ，加蒸馏水至95ml 即可.（2）、2%NaCLO ：每组配100ml.x ：应吸取的NaCLO 原液的毫升数；y ：NaCLO 原液的有效氯浓度。
3、种子去壳用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。
每人准备30粒去壳种子。
4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行）将米粒放入50ml 无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO ，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO ，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 yX= (ml)分钟→倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。
第五章愈伤组织培养
例：百合：鳞茎的鳞片分化能力：外层>中层>内层
（2）植物激素的作用（外因）
适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。
生长素
高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；
＝ 适中：有利于根芽的分化；
细胞分裂素 低：有利于芽的形成
芦荟的植物组织培养过程
1
2
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芽（单芽、丛芽）
第二节 愈伤组织中的形态发生
➢ 脱分化：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能
分裂期外植体的特征:
细胞分裂快，结构疏松， 缺少有组织的结构，维持 其不分化的状态，颜色浅 而透明。
细胞的主要表现:
外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂， 使得外层细胞数目增加， 细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。 逐步回到分生组织状态。 随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋 白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。 细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构， 维持其不分化的状态，颜色浅而透明。
生愈伤组织
愈伤组织生长良好
愈伤组织增殖强
NOA 萘氧乙酸
无愈伤组织形成 愈伤组织增殖中等
愈伤组织增殖中等
NOP 萘氧丙酸
无愈伤组织形成 愈伤组织增殖中等愈伤组 愈伤组织增殖强 织增殖强
第五章 愈伤组织的培养
第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子
第二节 愈伤组织中的形态发生
3.4 体细胞胚状体诱导的影响因素
1）生长素 形成体细胞胚的关键是除去或降低培
养基中的生长素成分（如2,4-D）。 愈伤组织在生长素0.5～1mg/L的培养
植物愈伤组织培养
酶活力 增加
细胞的 大小变 化不大
第一节 植物愈伤组织及形成过程
二 植物愈伤组织的形成过程：
诱导期长短
植物种类
外植体生理状 况
外部因素
第一节 植物愈伤组织及形成过程
二 植物愈伤组织的形成过程：
分裂期：细胞通过一分为二的分裂，不断
增生子细胞
细胞分裂 快
结构疏松
缺少有组 织的结构
颜色浅而 透明
第一节 植物愈伤组织及形成过程
第6章 植物愈伤组织培养
•2024/8/27
愈伤组织：原是指植物受伤之后于伤口表面形成的一团薄
壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体的增 生细胞产生的一团不定形、疏松的薄壁细胞。
第一节 植物愈伤组织及形成过程
增殖培 养基
连续有 丝分裂
分化组织中不 分裂的静止细
胞
细胞进入分裂 状态，变为分
养
体 获 取
的 芽
的 种 子
花 序
长 的 幼
胚
光培 诱 白不紧 保 分软软 下养 导 色透密 持 离而而
或皿 暗易 处于
到明的 浅的 黄
和
胚胶透 性质明
培 组状的
培观 养察
色 的
养
织的， ，，有
继常时
代带生
培根根
养
愈伤组织培养的应用
1、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度； 2、培育无病毒苗木； 3、获得倍性不同的植株； 4、克服远缘杂交困难； 5、利于种质资源长期保存和远距离运输； 6、提供育种中间材料； 7、诱发和离体筛选突变体； 8、制造人工种子。
第一节 植物愈伤组织及形成过程
二 植物愈伤组织的形成过程：
诱导期（起动期）
第四章愈伤组织培养PPT课件
再转入生长素含量极低或没有的培养基上====胚 一、愈伤组织培养中的形态发生 其中以维管组织（特别是木质部）的分化最为常见。 在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。 超过4％时则几乎完全为韧皮部； 体细胞胚胎发生的几个概念 二倍体细胞比单倍体细胞容易 愈伤组织的建立和增殖所需的是一种含有生长素的培养基，通常所用的生长素是2,4D，浓度范围0. 在组织培养的器官发生过程中，愈伤组织是一团无极性分化的细胞团，器官分化中芽或根分化只是具单极性，而胚状体在分化初期就 具胚根和胚芽两极，具明显的形态特征上的极性（Polarity）类似于合子发育中的种子结构。 2、影响维管组织分化的主要因素 幼年细胞和组织比成年的容易 赤霉素（GA3）抑制烟草、紫雪花（Plumbago indica）秋海棠（Begonia）及水稻的器官分化。
第四章愈伤组织培养
优选第四章愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导
郁李的愈伤组织
细胞的全能 性的体现
脱分化：一个已停止分裂的成 熟细胞转变为分生状态，并形 成未分化的愈伤组织的现象。
再分化 ：愈伤组织在一定的培养条
件下又可以经过胚胎发生形成双极性 的胚状体，或经过器官发生形成单极 性的芽或根，进而重新形成完整的植 株，这后一段过程一般称为再分化。
（一）诱导期（起动期）
诱导期又称起动期，指细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成 的起点。
Calrom root
Callus arising from vascular tissue
From embryo culture
Photo indicating where the
停止分裂的细胞发生生理 代谢变化而形成由不同形 态和功能的细胞组成的愈 伤组织。
愈伤组织的诱导
先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起 来形成一株小植株，只有芽和根的微管束是相通的，才能得到成 活的植株。
花枝、果枝、和树干
香果树简介
香 果 树 (Emmenopterys henryi) 又名庙瓜树、水萝卜， 为茜草科香果树属的单种，属落叶大乔木 ，为我国特产 单种属的古老珍稀濒危树种，属国家二级保护植物。
香果树是细木工艺、雕刻、装饰、建筑和家具的优良用 材 ， 其枝皮纤维细， 是供制蜡纸及人造棉的好原料。 它的花大， 树姿雄伟， 也是庭园观赏树种。
香果树简介
主要分布在西南地区和长江流域。香果树的分布虽然较广 泛，但多零星分散，种群数量不多，自然条件下种子萌发 率低，又由于长期以来人为的滥砍滥伐、过度放牧，使其 种群分布范围逐年缩小，种群数量日益降低，处于濒危甚 至灭绝的状态。
香果树生根
香果树移栽
当苗长到3～5cm高时，洗净根上的培养基， 将苗移入装有富含有机质、易排水、透气性好的椰 绒花盆里。然后置入人工气候箱中培养，温度25℃ 左右，湿度80%左右，在人工气候箱中生长一个月 后移到室外，成活率95%以上。
移栽成活的香果树的苗
【小结】
植物组织培养过程
离体的植物 脱分化
2.外植体来源及其生理状态
理论上讲，植物体细胞均具有全能性，但在一些 植物中，胚状体产生和器官分化与离体培养的器官或 组织密切相关。如油菜的花器官比叶、根易于分化成 苗，水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。 甜菜花芽和花茎愈伤组织能分化成芽，而根切断愈伤 则不能形成芽器官。
2.外植体来源及其生理状态
一.愈伤组织形成条件
愈伤组织的形成过程
愈伤组织的形成过程愈伤组织从单个细胞或⼀块外植体形成典型的愈伤组织，⼤致要经历三个时期：⼀、诱导期－细胞准备恢复分裂的时期。
处在静⽌状态的成熟细胞通过⼀些刺激因素和激素的诱导作⽤，使其合成代谢活动加强，迅速进⾏蛋⽩质和核酸物质的合成。
细胞⼤⼩变化不⼤。
诱导原理：静⽌细胞是具有分裂潜⼒的，只是被存在着的⼀类抑制剂所抑制，如果除去抑制物质，就可恢复分裂能⼒。
这些抑制物质的作⽤是阻碍DNA复制，若加⼊抵消抑制剂影响的物质，那么细胞就⽴即进⾏DNA复制，全部细胞进⼊合成期，并发⽣同步分裂。
⼆、分裂期指细胞通过⼀分为⼆的分裂，不断增⽣⼦细胞，即发⽣脱分化的过程。
特点：1．细胞的数⽬迅速增加。
胡萝⼘培养7天后，细胞数可增加10倍。
2．每个细胞平均鲜重下降。
这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数⽬的增加快的缘故。
3．⼦细胞具体积⼩，内⽆液泡的特点，和根茎尖的分⽣组织细胞⼀样。
4．细胞的核和核仁增⼤到最⼤。
5．细胞中 RNA含量减少，⽽DNA含量保持不变。
6．组织的总⼲重、蛋⽩质和核酸含量逐渐增加，新细胞壁的合成极快。
此时愈伤组织的形态特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。
三、分化期细胞停⽌分裂，内部发⽣⽣理代谢变化，导致细胞在形态和⽣理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。
主要特征：1．细胞分裂部位和⽅向发⽣改变。
分裂期的细胞分裂局限在组织的外缘，主要是单周分裂；在分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢，直⾄停⽌。
愈伤组织内部深处的局部地区的细胞开始分裂，使分裂⾯的⽅向改变了，出现了瘤状结构的外表和内部分化。
2．分⽣组织瘤状结构和维管组织的形成。
当愈伤组织⽣长速度减慢时，就形成由分⽣组织组成的瘤状结构，它变成不再进⼀步分化的⽣长中⼼，⽽在其周缘产⽣扩展的薄壁细胞。
瘤状结构团团地散布在愈伤组织块中。
这时形成了维管组织，但不形成维管系统，⽽呈分散的节状和短束状结构，它可单由⽊质部组成，也可由⽊质部、韧⽪部乃⾄形成层组成。
第八讲 愈伤组织培养
第八讲愈伤组织培养愈伤组织培养:指将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。
第一节愈伤组织的诱导和分化一、愈伤组织的诱导（一）诱导原理1、细胞全能性：植物每一细胞具有全套遗传信息，在特定环境下能进行表达，而产生一个独立完整的个体。
只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使已经是高度分化的植物细胞，也还保持恢复到分生状态的能力。
其恢复能力取决于该细胞原来所处的部位和生理状态。
2、脱分化现象：一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。
植物离体培养中的脱分化过程:植物离体培养利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原已分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道，失去其原有状态和功能，而恢复到未分化的愈伤组织状态。
（二）诱导方法：1、根据不同的培养目的，获取不同的外植体。
植株茎的切段、叶、根、花和种子，或某些组织切成片或块状，均可接种到培养基上。
接种时需考虑材料的一致性，来源、产地、大小、形状、生理部位。
常选组织块较大的材料。
获取外植体材料－消毒处理－修整除去坏死组织－切成5mm 的圆柱形或方形小块－直放或倒放到培养基上－每9cm培养基接种5－6块外植体－培养。
2、操作程序：选用较大组织做材料时，可用打孔器从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切成相同厚度的小圆片进行培养。
采用圆形的原因：能得到外形简单结构相同的材料、圆形的表面积大、圆柱形的外植体有利于组织块与外界进行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。
二、愈伤组织的形成从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：1、诱导期: 细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成的起点。
诱导期细胞内发生的变化气体交换增加，RNA含量增加，蛋白质量增加酶活性增强影响愈伤组织诱导的因素：弱光下植株比强光下的植株外植体易于诱导分裂、生长调节剂诱导细胞开始分裂、损伤剌激能加速脱分化进行，有时还是某些材料能否脱分化的决定条件。
第三章 愈伤组织诱导及分化调控
A
一般来说胚性愈伤组织来源于皮层组织细胞, 而非胚性愈伤组织则来源于中柱的组织细胞, 即维管束及髓部细胞
C
D
（2）胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织 愈伤组织在长期的培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞，或者形成体细胞胚，这种能够形成体细胞胚的愈伤组织叫做胚性愈伤组织(embryogenic callus)
(3) 形成期: 外植体的细胞经过诱导，分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期 ①．细胞分裂部位和方向发生改变 细胞大小不再发生变化，愈伤组织表层的分裂逐渐减慢和停止，内部组织细胞开始分裂 。
②．分生组织瘤状结构和维管组织的形成。 形成由分生组织组成的瘤状结构，它变成不再进一步分化的生长中心，而在其周缘产生扩展的薄壁细胞 瘤状结构团团地散布在愈伤组织块中。这时形成了维管组织，但不形成维管系统 ③．细胞的体积不再减小。 ④．出现了各种类型的细胞。 在愈伤组织的形成过程中，尽管在形态上可以划分出起动、分裂和形成三个时期，但实际这些时期的界限并不是十分严格的，尤其是分裂期和形成期，它们往往可以在同一组织块上观察到
全能性实现的两个必须满足的条件： 把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来 要给予植物细胞一定的刺激
二、植物细胞全能性的表达 从植物分离出根、茎、叶等一部分器官，在切口处组织受到了损伤，但这些受伤的部位往往会产生新的器官，长出不定芽和不定根，从而成为新的完整的植株 吊兰，它能在每个嫩芽处都可长出一个新个体，这就是最自然的“克隆”现象 自然界许多植物可以通过插条来实现个体繁殖
愈伤组织培养
（2）分裂期：
外植体的细胞一但经过诱导，细胞脱分化，其外层细胞开始 细胞分裂。
分生状态:细胞变小、细胞质稠密、液泡变小或无、核和核 仁变大并趋向细胞中央。 处于分裂期的愈伤组织的特片是：细胞分裂快， 结构疏松， 缺少组织结构，颜色浅而透明。 已具一定功能和结构的分化和成熟的细胞 回复到具分裂能 力的分生状态.细胞分裂的结果标志着脱分化的完成。
分裂期：起动后的细胞进行活跃的细胞分裂. 1．细胞的数目迅速增加（外层先开始旺盛分裂）。胡萝卜培养7天后，细胞数 可增加10倍。 2．每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的 缘故。 3．细胞形态改变：体积小，成多边型，质浓，液泡小或无，如同根尖和茎尖的 分生组织细胞一样。 细胞的核和核仁增大到最大。 4．细胞中 RNA含量减少，而DNA含量保持不变。 5．随着细胞不断分裂和组织生长，组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加， 新细胞壁的合成极快。 小愈伤颗粒
C 细胞的体积不再减小 愈伤组织分化时外植体细胞的大小发生十分明显的变化， 生长的愈伤组织的细胞平均大小不再减小，至此以后，保持 相对不变。 D 出现各种类型的细胞 如薄壁细胞，分生细胞，管胞，石细胞，纤维细胞，色素细 胞，毛状细胞以及细胞丝状体等。
E 出现一定的形态特征 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡 绿或绿色，老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。
2、愈伤组织的继代
愈伤组织诱导并生长一段时期后， 必须转移到新鲜培养 基上培养,这个过程叫做继代培养（营养、水分的耗失和 代谢产物积累的毒害）。
• 合适时间：愈伤生长即将达到顶峰以前，这时处于旺盛分裂时，继代
后容易生长，继代间隔一般四周，继代后3-7天恢复生长，2-3周内旺
愈伤组织培养
分裂期
是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞 的过程。
外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅 速分裂，使细胞脱分化。
在细胞分裂期，其形成结构和生理生化都发生深 刻的变化：
•
1.数目迅速增加。 2.平均鲜重下降。 3.体积小，内无液泡。 4．核和核仁增大到最大。
•
形成期
是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结 构的愈伤组织的时期。
•
由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如 果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变 成黑褐色，继而死亡。
用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保 存愈伤组织的一种方法。
•
一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼 脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增 殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。因此，由 于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变 成了一个不规则的馒头状的组织块。
它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。
•
•青苹果愈伤组织增殖培养
•
•乌桕愈伤组织增殖培养
•
三 愈伤组织的形态发生
形态建成：外植体在适宜的培养条件下经 过脱分化和再分化形成完整植株的过程。
在组织培养中，从外植体形成器官或无性 系的形态发生，有下面两种方式：
•
形态发生方式（一）
不定芽方式 指愈伤组织通过再分化形成不定芽再生植 株。这是组织培养中常见的器官发生方式。
这一时期愈伤组织内细胞的特点是： ①大而不规则，高度液泡化，整个组织是比较松 散的。 ②细胞增殖速度快,适合用液体培养或悬浮培养。
•
③生长旺盛的愈伤组织呈乳黄色或白色，有光泽 ，也有浅绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变 为黄色甚至褐色。
•
•愈伤组织形成
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注意：
**愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成 分和培养时间而异。 **同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变 异。 **组织培养中涉及到的遗传变异主要是细胞核组成的改变， 变异是不可逆的，这种遗传上的改变可以是染色体畸变，细 胞核破碎，或者是由于细胞内复制引起的多倍性以及分子水 平上的改变等形式。 **培养基成分，特别是外源激素的成分与变异的产生密切有 关。
周继代一次。
** 继代时应注意愈伤组织分割。
Typical callus growth curve. X indicates time for subculture
拟分生组织
**愈伤组织在分裂期会出现导管细胞，筛管细胞，分泌细胞， 毛状体细胞及木栓细胞等，并出现由小而密集的分裂细胞构 成的细胞团，称为拟分生组织。 **这些区域化的细胞团往往在以后分化中称为形成芽原基及 根原基的中心，愈伤组织也经常呈颗粒状的外形，这些颗粒 中含有韧皮部、木质部和形成层组织，这种具有类似微管组 织的愈伤组织颗粒也具有分化形成不定芽和不定根的能力。
在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中，对其调控幅 度最大的是植物生长调节物质，主要调节生长调节物质的 种类、浓度和比例，其中生长素和细胞激动素的浓度和配 比对大多数植物材料愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的 调控起重要作用。对绝大多数植物材料而言，2,4-D 是诱 导愈伤组织和细胞悬浮培养的最有效物质，常用浓度为 0.2～2mg/L，为促进细胞和组织的生长还要加入0.5～ 2mg/L的细胞激动素（KT）。
callus type
胚性愈伤组织 embryogenic callus
成熟胚 mature embryo
幼穗 immatur e spike
成熟胚 mature embry
o
幼穗 immatu re spike
+
+
-
-
非胚性愈伤组织
non-embryogenic
+
+
+
+
callus
胚性愈伤组织发生率
（三） Callus诱导、增殖及形态建成调控
颜色 color 表面 surface 质地 quality 胚性细胞的多少 the quantity of embr细yo胞g形en态ic cell cell morphology 细胞质 cytoplasm 内含物 content 细胞核及核仁 nucleus and nucleolus
以上4种类培养基中，前两种培养基较适合愈伤组织诱 导和细胞培养，但选用那类培养基，还应依植物种类、 基因型、外植体等而定；后两类培养基则有利于根的形 成。诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。高盐浓度的 培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜重增加有益。
5、培养基成分
（1）生长调节物质
培养基中生长调节物质对愈伤组织的诱导及增殖起着重 要的调节作用。 A、生长素和细胞分裂素
embryogenic callus
78
1
0
0
generating rate(%)
外植体的生理年龄也影响愈伤组织器官发生 的能力，如油菜植株的茎段自下而上进行培养 的效果不同，下部器官形成率较低，而上部形 成愈伤组织的苗分化率则较高（表4）
表4 油菜茎的不同节位与苗分化的关系（品种23）
部位（由上而下） 1 2 3 4 5 6 7
各基因型愈伤组织生长势分析
基因型 genotype
7757
辽10 (Liao10)
7742
Roblin
新克旱9 XinKehan9
相对生长率 relative growth
rate
130
指标 indices
生长势 growth potential
++++
S形曲线拟合方程 S curve equation
few or no 管状或不规则形
small and sphere 浓厚，染色深
dense, dark dying 多
tube or irregular 稀薄s，ha染pe色浅
thin, light dying 少
much 核明显，大，核仁多
核小，核li仁ttl少e ，或无核
distinct ,large
表1 不同基因型出愈率
Table 1 The comparation of callus induction rate between genotypes
基因型 genotype
辽10 东农7742
Roblin 东农7757 新克旱9
NXK9
重复1 replicate
1 ％
94.3
91.0
85.3
small or no nucleus
nucleus and many
nucleolus
1 基因型—重要影响因素
**基因型对离体培养条件反应的差异在以往报道中也多有提 及，表明离体培养过程，对起始材料的选择是十分重要的。 **基因型是控制愈伤组织形态建成的关键。不同物种的外植 体诱导的愈伤组织器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜、苜 蓿等较易发生器官分化，而禾本科（禾谷类）、豆类、棉花 等的愈伤组织形态建成相对较难。 **同属不同种，甚至同一物种不同品种的愈伤组织器官分化 的能力也不同。
不同器官作为外植体所诱导的愈伤组织，其器官发生 能力，有的植物差别不大，如烟草和水稻；而有的则明显 不同，如翅鞘莎，以根、茎和叶为外植体时，愈伤组织的 分化带有器官来源的特征，如根外植体的愈伤组织易分化 出根。
不同外植体胚性愈伤组织发生
基因型 genotype
愈伤组织类型
7742
新克旱9 XinKehan
形态建成方式
通过产生单极性不定芽或不定根， 再在不定芽下方长出不定根或在 不定根上产生不定芽，并在二者 之间分化出维管束组织形成完整 植株
通过体细胞胚胎 途径再生植株
Callus仅分化出不定根或不 定芽而形成无根苗或无苗根
在Callus的邻近部位分化出 不定根和不定芽，然后二者 通过维管束组织结合起来形 成完整植株
①
②
③
④
⑤
无根苗
形成有根苗
（二）具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织
**外植体细胞经离体诱导所形成的愈伤组织并不完全都 具有形态建成的能力。
**具有形态建成能力的愈伤组织都具有一定的形态结构 特点。
**具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的差 异是相对的，有时通过控制培养条件，尤其是生长调节 物质和继代的方式可以调控其进行形态建成。
4、培养基类型
依培养基配方中含盐量多少可将目前培养基分为4类：
**含盐量较大的培养基，如Murashige and Skoog于1962年设计的MS培
养基以及改良的MS培养基，这类培养基含较高浓度的硝酸盐、铵盐和 钾盐，微量元素非常全，此外LS（Linsmaier and Skoog, 1965）、 BL(Brown and Lawrence, 1968)、ER(Eriksson, 1965)培养基也属于这 类培养基。 **硝酸钾含量较高的培养基，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清 等，1975）、SH（Schenk 和 Hildebrandt，1972），这类培养基的 盐浓度也很高，其中NH+4和PO-34是由NH4H2PO4提供。 **含盐量中等的培养基，如H（Bourgin 和 Nitsch，1979）培养基，这类 培养基中大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生 素种类比MS的多，在Nitsch培养基中生物素提高了10倍。 **低盐浓度的培养基，如White培养基（1943），WS（Wolter和Skoog， 1966）和HE培养基（Heller，1953）。
第四章 愈伤组织的诱导 形成及分化
一、 愈伤组织的诱导和形成
二、 愈伤组织形态建成
三、 愈伤组织的形成及其形态
建成的某些生理生化基础
一、 愈伤组织的诱导和形成
愈伤组织形成
特点
诱导期 分裂期
改变原来的分化方向和代谢方式， 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定 基础
小麦幼胚
诱导期
分裂期
分裂期
分化期
愈伤组织诱导形成过程
分化期
** 愈伤组织保持与继代培养
愈伤组织颜色 1、Callus无任何形态结构，新鲜愈伤组织颜 色为奶黄色或白色有光泽，少数也有淡绿色 或绿色；老化的愈伤组织则转变为黄色至褐 色。
愈伤组织生长周期 2、愈伤组织生长周期为2－3周。一般2－3
外植体外层细胞开始分裂，细胞 脱分化，愈伤组织结构疏松，缺 少组织结构，颜色浅而透明
分化期
Callus表层细胞分裂逐渐停止， 而转向其内部的局部地区，并改 变分裂面的方向，出现瘤状结构 外表，Callus中可以发现维管组 织，但不形成维管系统
**诱导期长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因 素而异，即使同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤 组织诱导期也不同。
如有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的 植物诱导期需要几天（胡萝卜），而刚收获得菊芋块茎 诱导期只要22h，经贮藏5个月后，其诱导期延长到2天。
**愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、 基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。
如烟草、胡萝卜等脱分化很容易，而禾谷类的脱分化较 前者难；花器官脱分化较易，而茎叶则较难；幼茎组织 脱分化较易，而成熟的老组织较难。2
愈伤组织继代时间与植株再生能力与遗传稳定性
1、愈伤组织保持时间 已诱导并建立起来的愈伤组织可以长期保存，如有报道
大豆细胞系的愈伤组织在24℃和弱光下已保持15年。 2、继代时间与植株再生能力及变异