愈伤组织的诱导和培养
愈伤组织的诱导形成及分化
愈伤组织的诱导形成及分化第五章愈伤组织的诱导、形成及分化第⼀节愈伤组织的诱导、形成及特点⼀、愈伤组织的诱导和形成愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的⽆特定结构的组织。
经⼀段时间的⽣长和增殖以后，在其内部出现⼀定程度的分化，产⽣出⼀些具有分⽣组织结构的细胞团、⾊素细胞或管状分⼦。
植物外植体在培养基和外界环境的作⽤下，经过⼀个复杂的过程形成愈伤组织，即：外植体＋培养基＋环境愈伤组织愈伤组织的形成⼀般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。
图4.1 愈伤组织的形成特点1. 诱导期愈伤组织诱导期⼜称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂⽅向和代谢⽅式，合成代谢活动加强，⼤量合成蛋⽩质和核酸物质，为细胞分裂做准备。
诱导期的长短因植物种类、外植体的⽣理状态和外部因素⽽异，即使是同⼀种物种不同基因型同⼀外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。
有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），⽽有的植物诱导期需要数天（胡萝⼘）。
刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h ，但经贮藏5个⽉后，诱导期延长为2天。
2. 分裂期外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发⽣分裂，细胞脱分化。
愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜⾊浅⽽透明（见图4.2）。
分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。
⼩麦幼胚分裂期分裂期分化期分化期图4.2 ⼩麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期（东北农业⼤学⼩麦研究室，李⽂雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进⼊分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和⽣理状况⽽有很⼤差异。
烟草、胡萝⼘等的脱分化很容易，⽽⽲⾕类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，⽽成熟的⽼组织较难。
进⼊分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发⽣分化，产⽣新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可⽆限制地进⾏细胞分裂增殖，维持不分化的状态。
组织培养第三章 愈伤组织培养资料
2、操作程序
获取外植体材料－消毒处理－修整除去 坏死组织－切成5mm的圆柱形或方形小块－ 直放或倒放到培养基上－每9cm培养基接种5 －6块外植体－培养。 选用较大组织做材料时，可用打孔器 从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切 成相同厚度的小圆片进行培养。
采用圆形的原因：
能得到外形简单结构相同的材料
第一节 愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个 部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养 基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一 门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈 伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植 物离体培养的开始。
一、愈伤组织的诱导 （一）诱导原理 1、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息，在 特定环境下能进行表达，而产生一个独立 完整的个体。
（二）在园艺植物育种中的应用： 1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度， 迅速高效低成本 2、培养无病毒苗木 3、获得倍性不同植株，易染色体核内加 倍育种有利用价值 4、克服远缘杂交困难 5、利于种质资源长期保存 6、提供育种中间材料 7、诱发和离体筛选突变体 8、制造人工种子
植物离体培养中的器官发生类型： 不定芽型—诱导顶端分生组织产生不定 芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培养。 多数植物培养采用。
圆形的表面积大
圆柱形的外植体有利于组织块与外界进 行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈 伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。
培养基
MS培养基 激素 IAA、NAA、2,4-D、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物。
二、愈伤组织细胞的分化
单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤 组织，大致经历三个时期，这三个时期中细 胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。
细胞分化——持续细胞分裂增殖——原胚期— —球形胚——心形胚——鱼雷形胚——子叶期
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师资料
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师资料植物愈伤组织诱导培养实验实验目的：1.掌握植物愈伤组织的诱导和培养技术；2.了解植物生长素和植物生长调节因子的作用；3.实践动手能力，培养分析问题、解决实际问题的能力。
实验步骤：1.实验材料种子：芸苔、小麦、玉米等试剂：琼脂、SD综合培养基、激素溶液、酒精灯、移液管等2.种子的表面消毒取适量的芸苔种子，用70%的酒精灯烧消毒。
将种子放入无菌蒸馏水中浸泡20分钟，再用三次含酸性消毒液（NaClO）洗涤。
洗涤后，用无菌蒸馏水洗三次，并将水倒掉。
将种子放在干净、无菌的滤纸上晾干。
3.愈伤组织诱导3.1 试剂配制将SD综合培养基和激素溶液按体积比例配制成诱导培养基。
激素溶液的配方参考如下：IAA：千叶素：6-BA的比例为 10：1：1，浓度为0.108 mg/L；3.2 培养陈列室准备工作实验室必须具有无菌灯、搅拌器、制冷箱或培养箱等基本的实验设备。
实验前清洗设备，使用高压蒸汽或酒精灯等方式灭菌。
在无菌条件下制备琼脂、移液管、培养瓶等。
在实验操作台上，用70%的酒精清洗双手，并用无菌纸巾擦拭干净。
3.3 培养基的制作制好的培养基分装到15ml的培养瓶中。
琼脂用70%酒精擦拭干净，均匀铺在实验平台上，用于接种组织。
3.4 组织接种将种子放在培养基上，用无菌铁丝按一定距离排列成一排。
取出种子，切成0.5-1cm的暴露在外的子叶或幼芽，然后在接种组织区域按照一定距离进行均匀排列。
将培养瓶密封，并放在指定的温度下生长。
4．实验结果的处理和分析4.1 愈伤组织的诱导情况观察家哈的发育情况，如出现愈伤组织的形成，记录其在构型，大小等。
4.2 理化指标的测定在诱导完成后的期间，测定愈伤组织中的蛋白质含量，葡萄糖含量，游离氨基酸含量等指标。
注意事项：1.实验过程中要注意操作技巧，避免污染；2.在培养过程中，要注意温度和光照的控制；3.进行实验时，要做好实验记录和实验数据分析工作；4.实验后，要注意实验设备的清洁和归档。
实验1 愈伤组织的诱导
实验1 愈伤组织的诱导1、实验目的（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；（2）了解接种的无菌操作技术；（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。
2、实验原理植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。
3、实验仪器和试剂仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。
无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。
植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。
试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。
培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.84、实验步骤（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。
（2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。
（3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。
以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。
（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。
在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。
第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化
⑶先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心， 从中仅分化出芽，一般情况下待芽长到一定大小时，切下 移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。
有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根， 形成完整的植株。大多数植物均属这类正常的分化途径， 这类苗移栽较易成活。
⑷先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分 化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的 将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至 在根端也能分化出芽。
从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈 伤组织，大致经历三个时期：
起动期：又称为诱导期,
是愈伤组织形成的起点。 外植体已分化的活细胞 在 外源激素的作用下，
通过脱分化起动而进入 分裂状态，并开始形成 愈伤组织。
起动期
分裂期
分裂期：外植体切口边缘开
始膨大，外层细胞通过一分 为二的方式进行分裂，从而 形成一团具有分生组织状态 细胞的过程。
二、从愈伤组织建立悬浮培养体系
多数悬浮培养物（suspension cultures）是将生长快、质地 疏松的愈伤 小块转移到与愈伤诱导含同样成分的液体培养 基里进行振荡培养而获得。
接种时必须有足够多的细胞块，以保证有较合适的细胞密 度。振荡速度一 般为 30-150rpm。
第一次继代时，应去掉开始时接入的大块细胞团——过滤。
第三节 愈伤组织分化与植株再生
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的生产。 体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一 个体细胞胚称为胚状体，它可以同 合子胚一样发育成植株。 器官发生：指从愈伤组织形成芽及根的过程，芽是一个单 极性结构，物理地同母体组织联结着。
细胞分化
无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化 研究的重点是维管组织的分化，特别是木质部成 分的分化。
植物愈伤组织诱导实验
实验一植物愈伤组织诱导实验一、实验目的1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。
2、培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。
二、实验原理植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。
而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。
植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。
超净工作台原理：本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境三、仪器试剂培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、剪子、100ml烧杯、培养皿（或不锈钢浅盘）、封口膜、棉线、橡皮筋、次氯酸钠（或HgCl2）、MS 培养基全部试剂、植物激素及生长调节物质、无水乙醇、工业酒精、胡萝卜四、实验步骤（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用自来水冲洗后,用酒精棉擦拭欲取材部位表面, 或于70%酒精中浸沾数秒钟。
（3）将材料放入已灭菌的100ml烧杯（或试剂瓶）中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。
（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。
（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。
（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散，以绿豆为材料时，将绿豆纵切或横切，去皮后分别接种。
第三章-愈伤组织诱导
第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。
持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。
迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。
其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
第五章愈伤组织培养
例：百合：鳞茎的鳞片分化能力：外层>中层>内层
（2）植物激素的作用（外因）
适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。
生长素
高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；
＝ 适中：有利于根芽的分化；
细胞分裂素 低：有利于芽的形成
芦荟的植物组织培养过程
1
2
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5
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芽（单芽、丛芽）
第二节 愈伤组织中的形态发生
➢ 脱分化：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能
分裂期外植体的特征:
细胞分裂快，结构疏松， 缺少有组织的结构，维持 其不分化的状态，颜色浅 而透明。
细胞的主要表现:
外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂， 使得外层细胞数目增加， 细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。 逐步回到分生组织状态。 随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋 白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。 细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构， 维持其不分化的状态，颜色浅而透明。
生愈伤组织
愈伤组织生长良好
愈伤组织增殖强
NOA 萘氧乙酸
无愈伤组织形成 愈伤组织增殖中等
愈伤组织增殖中等
NOP 萘氧丙酸
无愈伤组织形成 愈伤组织增殖中等愈伤组 愈伤组织增殖强 织增殖强
第五章 愈伤组织的培养
第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子
第二节 愈伤组织中的形态发生
3.4 体细胞胚状体诱导的影响因素
1）生长素 形成体细胞胚的关键是除去或降低培
养基中的生长素成分（如2,4-D）。 愈伤组织在生长素0.5～1mg/L的培养
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班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223
愈伤组织的诱导和培养
一、实验目的及意义
植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。
通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。
二、实验原理
植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。
植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。
三、实验仪器与药品
超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉
材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗
四、实验步骤
1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固
2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。
洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。
进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。
3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。
取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。
4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况
五、实验结果
组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；
NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。
七、思考题
⑪诱导率（2,4-D）=100%
诱导率（NAA）=100%
⑫除去植物表面菌类，同时不破坏植物的蛋白质结构
⑬防止消毒液在外植体表面残留，对外植体造成损伤
⑭在超净工作台上操作，工作台在使用前要紫外消毒，酒精消毒等应在酒精灯火焰前操作
取外植体前酒精浸泡并灼烧镊子和手术刀
镊子和手术刀稍事冷却再取外植体，以免烧死细胞
接种后应尽快封上铝箔
⑮实验前消毒不彻底
实验中操作不规范
⑯外植体本身产生愈伤组织的潜在能力
基本培养基对外植体的影响
激素组合是最重要的影响因素。