肝素-毕业论文

一．肝素酶的作用及来源

肝素酶（heparinase）是指一类能够特异性地裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，可以清除血液中的肝素，并常用于测定肝素的结构以及抗肿瘤等方面的研究。乙酰肝素酶在肿瘤转移、血管生成、组织发生等过程中起重要作用，其羧基端大亚基蛋白是该酶的重要组成部分，但由于此蛋白在体内含量少，易降解，很难直接从组织内得到一定数量的蛋白。肝素酶最初从肝素黄杆菌中发现并分离，后来发现其他一些微生物或动物组织中也存在[4]。肝素酶除了通过降解硫酸类肝素蛋白聚糖（HSPG），破坏ECM和BM促进肿瘤侵袭、转移外，还可通过促进HS结合性生长因子或细胞因子释放，间接促进肿瘤转移。

二. 肝素酶的特性

2.1

酶的最适催化条件为：温度45℃，pH 6.4~7.0，离子强度150 mmol/L。酶在35℃以上极易失活，在pH 7~11之间基本稳定。该酶的最大紫外吸收位于280 nm。

2．2分子生物学特性

1979年Klein等首次报道了人胎盘肝素酶，之后在许多正常和恶性肿瘤细胞中也发现了该酶的存在。Vlodavsky等首先纯化了肝素酶，1999年Vlodavsky以及Hulett等三个研究小组几乎同时分离到了肝素酶基因。现已明确肝素酶基因（～50kb）位于人染色体4q21.3，通过选择性剪接形成5kb和1.7kb的两种mRNA。肝素酶cDNA编码543氨基酸的61.2kD的多肽，经加工后变成具有肝素酶活性的分子质为50kD的多肽。

肝素酶前体结合到细胞表面的HS上，进而转化成为具有高度催化活性的50kD的形式，加工后通过入胞作用进入细胞。Pikas认为肝素酶结合的底物至少含有2－O－硫酸基。HS链接并聚集到细胞外基质蛋白上，在细胞－细胞间及细胞－基质间发挥重要作用，此外，由于HS链具有结合多种蛋白的特殊能力，使许多具有生物活性分子（如生长因子、趋化因子、脂蛋白以及酶等）结合到细胞及细胞外基质上，因此在形态发生、组织修复、神经突生长、炎症、自身免疫及肿瘤转移和血管生成等生理和病理过程中发挥调控作用。

三. 肝素酶的提取、纯化工艺

1.2.1分离乙酰肝素酶蛋白编码基因和测序鉴定以人胎盘cDNA文库为模板，进行PCR. 上游引物5′ATGCTGCTGCGCTCG AAGCCTGCGCT3′，下游引物5′TCAGATGCAAGCAGCAA CTTTGGCAT3′.PCR条件为：95℃ 5 min，变性进入循环；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环后72℃继续延伸5 min. 8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，直接克隆入pGEMT载体，测定基因序列.

1.2.2构建载体PGEX2TK50 ku HPA根据测定的乙酰肝素酶核苷酸序列，设计了如下一对引物扩增乙酰肝素酶50 ku大亚基基因片段：5′CGGGATCCAAAAAGTTCAAGAACAGCAC 3′，其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，5′CGGAATTCTCAGATGCAAGCAG CAACTTTGG 3′,其中GAATTC为EcoRⅠ酶切位点. PCR条件为：95℃ 5 min 变性进入循环；94℃ 30 s，60℃ 30 s, 72℃ 30 s，30个循环后72℃继续延伸5 min. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物. 将扩增出来的乙酰肝素酶基因大亚基的基因产物纯化，酶切，与质粒载体连接，克隆入PGEX2TK原核表达载体，构建载体PGEX2TK50 ku HPA，转化DH5α. 测序鉴定表达载体的序列和阅读框架.

1.2.3温度、诱导时间、浓度对表达的影响①温度对表达的影响：将重组表达质粒pGEX 2TK50 ku HPA转化大肠杆菌BL21（DE3, PLyS），挑取重组子单菌落接种于LB液体培养基（氨苄青霉素100 mg/L, 氯霉素34 mg/L）中，分别于25℃，30℃，37℃进行诱导表达，收集菌液，进行SDSPAGE分析. ②诱导时间对表达的影响：加入IPTG后继续培养5 h诱导

目的蛋白表达,每隔1 min取1mL培养物，离心收集菌体分析. ③诱导剂浓度对表达的影响：加IPTG至终浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mmol/L，37℃, 200 r/min继续培养3 h，分别取1 mL菌液，离心收集菌体分析.

四. 肝素酶的应用

4.1胃癌组织中肝素酶的表达及其意义

细胞外基质（ECM）与基底膜（BM）是肿瘤细胞侵袭及转移的屏障。糖氨聚糖是此屏障的主要成分之一，它的主要成分为硫酸类肝素蛋白聚糖（HSPG）。肝素酶是近年来发现并克隆成功的与肿瘤侵袭与转移相关的酶，是裂解连接于HSPG核心分子上的硫酸类肝素的一类葡萄苷酸内切酶。/乙酰肝素酶（heparanase, HPA）是迄今发现的惟一能特异性降解细胞外基质和基底膜中的硫酸肝素糖蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)的内切糖苷酶［1］。在肿瘤转移的过程中，肿瘤细胞过度表达乙酰肝素酶破坏细胞外基质和基底膜，降低细胞间质屏障功能，促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁，诱发新生肿瘤血管形成。

乙酰肝素酶在肿瘤转移、血管生成、组织发生等过程中起重要作用，其羧基端大亚基蛋白是该酶的重要组成部分，但由于此蛋白在体内含量少，易降解，很难直接从组织内得到一定数量的蛋白. 本研究利用工程菌表达乙酰肝素酶的大亚基蛋白以期得到相当数量的蛋白，以便进一步用于该酶的抗体制备和功能研究. 方法：从人胎盘cDNA文库中分离乙酰肝素酶蛋白全长编码基因，通过PCR和酶切等方法将乙酰肝素酶大亚基的基因克隆入原核表达载体pGEX2TK中，测序鉴定序列完全正确后，转化大肠杆菌BL21（PlyS,DE3）进行表达。结果：工程菌BL21（PlyS, DE3, pGEX2TK50 ku HPA）成功表达出乙酰肝素酶大亚基融合蛋白。六．肝素酶纯化检测

五. 展望

类肝素酶作为影响肿瘤转移的一个重要的酶，为人们防治肿瘤转移提供了一个很有前途的新靶点。但肝素酶的基因调控机制及活化机制尚不清楚，进一步研究将有助于揭示它在肿瘤发生发展过程中所起的作用。肝素酶抑制剂有望成为肿瘤治疗的一种新药物，加强新型肝素酶抑制剂的开发及研究将具有重要的意义。由于肝素酶在转移性肿瘤组织中表达增高，且表达程度与患者的预后具有相关性，因此，定量检测癌症患者肝素的表达，将有助于判断肿瘤的恶性程度；术后肝素酶的表达水平，将有望成为判断肿瘤复发、预后的一个新的指标；术前及术后应用肝素酶抑制剂将有可能提高患者的生存率、改善提高生活质量。

六．参考文献

［1］Kussie PH, Hulmes JD, Ludwig DL, et al. Cloning and functional expression of a human heparanase gene ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1999,261:183-187.

[2]《第四军医大学学报》-2006年27卷2期 -101-104页