第4章免疫分析及免疫传感器

度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结 合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑 制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的 酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应
染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
捕获法
原理：

抗体与被分析物（通常指抗原）在免疫分析体系或免疫传感器界面形 成稳定的复合物，通过分子识别达到高度的特异性
灵敏度取决于以下几个方面：
采用与分析物高亲和性特异结合的抗体；
抗体在免疫分析或免疫传感器界面的固定排列方式； 合适的信号检测系统

放射免疫分析：放射活性物半衰期短、损害
健康、污物难处理等
第4章 免疫分析及免疫传感器
4.1引言
4.2 抗体-抗原相互作用
4.3 免疫分析及免疫传感器 4.4 抗体固定模式
4.5 化学发光检测
4.6 电致化学发光（ECL) 4.7 电化学检测技术 4.8 微流控电化学免疫分析系统 4.9 结论
4.1 引言

临床、生物电化学及环境分析物的检测需要快速、简便的分析方法 基于抗体 -抗原相互作用的免疫分析及免疫传感器由于其特异性及灵 敏性显示良好的前景
抗体分类
根据重链C区氨基酸组成及排列顺序不同 抗体可分为五类
四肽链结构
N端
两条相同的重链和两条相同的轻链
链间二硫键连接，呈“Y”形
上部为N端，下部为C端
C端
可变区与恒定区
根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区(Variable Region ）和恒定区 （Constant Region） 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较 大 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序 及含糖量都比较稳定
基于竞争免疫分析的免疫传感器用来检测小分子物质雌二醇
图4.3 竞争免疫分析检测雌二醇的结构示意图
E. Zacco, R. Galve, M.P. Marco, S. Alegret, M.I. Pividori, Biosens. Bioelectron. 22 (2007) 1707.

Fig. 6. Schematic representation of the electrochemical competitive immunosensing strategy for the detection of atrazine in orange juice with ProtA-GEB-based biosensors, showing the immobilization (A and B) and the competitive immunological reaction (C).
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
黄色 红色
黄色 深蓝色 荧光 黄色
400 500
405 420 360,450 420
4.3.1.3 ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）捕获法测IgM抗体
• 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上， 但仍保留其免疫活性， • 然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物 （标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与 酶活性， • 当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应 结合后，再加上 酶的相应底物， 即起催化水解或 氧化还原反应而 呈颜色。
颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正 比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗 体或抗原。

免疫分析是一种利用抗体作为待测抗原（通常为被分析物） 的主要结合试剂来进行定量分析的方法。

免疫分析的最终结果通常是研究抗体 - 抗原之间的结合，以
及游离抗原与抗原-抗体复合物之间的识别。

所有的免疫分析都是基于测定识别位点的结合率，即测定结 合位点数或间接测定未结合位点数。
免疫分析
基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一 种手段； 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度 敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子 上，通过这些标记物的增强放大效应来显示 反应系统中抗原或抗体的性质与含量。

光学免疫分析：对于有色样品及不纯样品检 测的灵敏性有一定限制

电化学免疫分析及免疫传感器：快速、简便、 经济等特点，微型化，均相检测
本章主要介绍一些基础背景知识，包括抗体结构和 抗体-抗原相互作用，这对所有采用特殊的免疫分析 模式的免疫分析和免疫传感器来说，都是至关重要
的因素。重点介绍电化学免疫分析和免疫传感器的

免疫的原理
Ag + Ab
特异性、灵敏性
在Ag，Ab反应中，用容易示踪的化学物质标记 一种反应物，以了解反应是否发生，发生部位， 以及发生的程度（即对未知成分的样品进行定 性、定位及定量分析）。
Ag－Ab
免疫学检测历史演进
放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现仍 普遍使用于县级以上医院）； 酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临 床机构普遍使用）； 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检 测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品 步入成长期）三个阶段。
非竞争性免疫分析（b）示意图
抗人IgMμ链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特 异性抗原的抗体
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色
捕获法原理
-
4.3.2竞争性免疫分析体系
将样品与已标记待测物混合后再 去竞争有限的抗体结合位点 标记复合物产生的信号与样品中 待测物的量成反比关系
图4.2 竞争性免疫分析示意图
竞争性电化学免疫分析和免疫传感器还广泛应用于重要的临
床分析物的检测。
尽管竞争免疫分析比较简单，但其缺点在于待测物标记后与
抗体的结合能力可能减低甚至消失，特别是当标记物靠近抗原 决定簇时，此现象尤为突出。
4.3.3 非竞争性免疫分析体系

非竞争性免疫分析体系 （即双抗体夹心免疫分析） 通过过量的抗体与抗原反 应，使抗原与样品溶液分 离，形成的免疫复合物再 与过量的信号二抗反应， 其中二抗只特异性地与固
D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改
变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。
+
双抗体夹心法测抗原
E
E
E E
E E
E
E
E
-
（二）间接法 方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
优点
一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体
应用
常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定
E
E
E
E
E
+
E E E E
间接法测抗体
-
（三）竞争法
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原
（药物、激素等）
步骤：
A 将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；
B 将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原 溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中， 温育后清洗； C 加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示 结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的 抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原 少，而待检溶液中抗原量多。

酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶 标记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两 个方面： 免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记， 与抗原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所 产生的不溶性颜色产物，借助于光学或电子显 微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。 酶联免疫吸附法（ ELISA) ：根据可溶性抗原 或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免 疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。
发展现状，以便能够比较容易地理解该领域取得的
成就，并加以应用。
4.2 抗体-抗原相互作用

免疫分析和免疫传感器都是通过抗体对抗原的特异性分子识 别来进行分析的系统。

抗体是一类称为免疫球蛋白（ Ig）的糖蛋白，通常分为 5类
（IgA、IgG、IgM、IgD、IgE），其中IgG是最主要的成分 （约占70%），经常用于免疫分析技术中。


ELISA
ELISA的基本原理和方法
ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
4.3.1.1 基本原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接， 然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）

4.3.1 酶联免疫法

免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用
原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试 验的优点，并克服上述两种方法的缺点。

酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏 感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的 仪器作定量测定，所得结果比较客观。
这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子 显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪） 加以测定。