双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤实验目的：本实验采用双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统，探究基因调控机制。
通过构建表达报告基因的质粒，研究不同因素对基因转录的影响。
实验材料：1. 双荧光素酶检测试剂盒（Promega）2. 293T细胞系3. Lipofectamine 2000转染试剂4. 培养基（DMEM + 10% FBS）实验步骤：1. 构建表达报告基因的质粒。
选择含有目标基因启动子区域的DNA片段，与质粒载体pGL3-基因报告载体连接，形成表达质粒pGL3-目标启动子-火萤酶（Luciferase）。
2. 细胞培养。
将293T细胞接种于6孔板中，培养至70-80%的稳定生长。
注意，细胞仅用到2×105个，否则检测结果会受内源性酶的影响。
3. 细胞转染。
将转染试剂与质粒混合，加入到细胞培养皿中。
注意，Lipofectamine 2000转染试剂与质粒的比例应按照转染试剂说明书进行调整。
4. 点亮荧光素酶（Luciferase）。
在细胞转染后48小时，加入荧光素酶检测试剂和积木酶抑制剂，使细胞产生发光，并通过微量板阅读器记录荧光值。
5. 关闭荧光素酶（Luciferase）。
在荧光素酶检测试剂作用后加入积木酶检测剂，称为“阻滞液”，使细胞发出的光信号被阻断。
加入Renilla荧光素酶检测试剂，使细胞重新产生新的发光信号，并通过微量板阅读器记录荧光值。
6. 数据统计。
按照公式计算相邻荧光信号的比值（荧光素酶/Renilla荧光素酶），以此作为表达目标启动子的相对活性。
（注意，双荧光素酶检测试剂盒中已包含此项标准）实验结果：通过双荧光素酶报告系统，研究了不同生物因素对基因转录的影响。
在细胞实验中，通过记录不同重复单元（replicate）的相对活性，为科研人员提供基因调控机制的新思路。
（数据统计请参照附表）结论：本实验采用双荧光素酶报告系统，通过构建表达报告基因的质粒，检测对基因转录的影响。
双荧光素酶报告基因检测实验步骤
双荧光素酶报告基因检测实验步骤引言：双荧光素酶报告基因检测是一种常用的实验方法，它利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）系统来研究基因表达的调控机制。
本文将详细介绍双荧光素酶报告基因检测的实验步骤，以及实验中需要注意的事项。
一、材料准备1. 双荧光素酶报告基因载体：包含荧光素酶基因和Renilla荧光素酶基因。
2. 细胞培养基：适用于所研究细胞的培养基。
3. 转染试剂：常用的转染试剂有聚乙烯醇（Polyethylenimine，PEI）、脂质体等。
4. 荧光素酶底物：如荧光素、Renilla荧光素等。
5. 其他实验所需试剂：如维生素C、PBS缓冲液等。
二、细胞处理1. 细胞培养：将所研究的细胞株接种在含有适当浓度的培养基中，培养至适当的细胞密度。
2. 细胞分组：根据实验设计，将细胞分为实验组和对照组。
3. 细胞转染：将双荧光素酶报告基因载体转染至细胞中，可以使用PEI等转染试剂进行转染。
三、荧光素酶检测1. 收集细胞：根据实验设计，收集转染后的细胞。
2. 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放内部的荧光素酶和Renilla荧光素酶。
3. 荧光素酶检测：将细胞裂解液与荧光素酶底物混合，测定荧光素酶活性。
4. Renilla荧光素酶检测：将细胞裂解液与Renilla荧光素酶底物混合，测定Renilla荧光素酶活性。
四、数据处理与分析1. 荧光素酶活性计算：根据荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算荧光素酶活性。
2. Renilla荧光素酶活性计算：根据Renilla荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算Renilla荧光素酶活性。
3. 相对荧光素酶活性计算：将荧光素酶活性除以Renilla荧光素酶活性，得到相对荧光素酶活性。
4. 统计分析：使用适当的统计方法，如t检验、方差分析等，对实验数据进行统计分析。
五、注意事项1. 实验条件统一：实验过程中，保持细胞培养条件的统一，如培养基组成、温度、湿度等。
双荧光素酶报告基因实验步骤
生物试剂双荧光素酶报告基因实验详解
如果要研究特定基因在体内的表达情况，常常采用转染法将双荧
光素酶报告基因植入目标细胞，在其表达后添加荧光素底物观察样品
中的荧光反应。
以下是使用该方法的实验步骤。
1. 构建双荧光素酶报告基因
首先需要构建双荧光素酶报告基因质粒，一般包括荧光素酶基因
和双荧光素酶基因，常用的是pGL3系列荧光素酶报告质粒和pRL-TK
双荧光素酶报告质粒，它们均是双质粒，具有耐药性和多克隆位点。
为了使荧光素底物反应在细胞中时产生荧光信号较强，需要在LUC和RLUC序列之前插入适当的顺式依赖启动子和增强子。
2. 细胞系的选择及转染
可以根据实验需要选择最适合的细胞系，例如HEK293、HeLa等。
将转染载体和搭配的化学试剂（如Lipofectamine 2000）按照实验方
案设定的比例混合，加入到无血清培养基中和细胞悬液混合，然后在
适当的时间内（如26-30小时）取样观察表达情况和筛选。
3. 荧光素底物检测
荧光素底物可以通过公司购买，也可以自制。
将荧光素底物溶解
在试剂液中，加入细胞中，等待几分钟可以看到发出荧光的细胞。
注意：在观察荧光之前，需在处理样品之前过滤荧光素底物以去除杂质。
另外，使用荧光计或流式细胞检测仪记录荧光信号，荧光信号强度与细胞内琥珀酸盐浓度成比例，可用于定量分析。
总之，双荧光素酶报告基因实验是一种重要的分子生物学技术，可以用于基因表达、基因调节和蛋白质交互作用研究等方面，具有广泛的应用前景。
质粒转染步骤
质粒转染步骤引言：质粒转染是基因工程中常用的实验技术之一，用于将外源基因导入目标细胞内，从而使目标细胞表达外源蛋白或产生特定的功能。
本文将详细介绍质粒转染的步骤及相关注意事项。
一、质粒制备在进行质粒转染实验前，首先需要制备质粒。
质粒通常由DNA构成，可由质粒抽提试剂盒等方法进行提取。
提取质粒的关键是确保DNA质量和纯度，以及质粒的浓度，这将直接影响到后续转染的效果。
二、细胞培养在进行质粒转染前，需要培养目标细胞。
细胞培养的关键是选择适当的培养基和培养条件，以保证细胞的健康生长。
细胞的形态、生长速度和细胞密度等因素需要在细胞培养过程中进行监测和调整。
三、质粒转染试剂的选择质粒转染试剂是实现质粒导入细胞的关键。
根据不同的细胞类型和转染目的，可以选择不同的转染试剂，如磷脂体转染试剂、聚合物转染试剂等。
在选择转染试剂时，需考虑其转染效率、细胞毒性和适用细胞类型等因素。
四、质粒转染步骤1. 细胞处理：将培养好的细胞用适当的培养基洗涤，并吸取适量的细胞悬液。
2. 质粒与转染试剂的混合：将提取好的质粒与转染试剂按照一定比例混合，形成转染复合物。
注意避免过高的转染试剂浓度，以免对细胞产生毒性影响。
3. 转染复合物的加入：将转染复合物缓慢加入细胞悬液中，充分混合，并保持一定的转染时间。
转染时间的长短需根据实验要求来确定。
4. 转染条件的优化：根据实验需要，可以对转染条件进行优化，如转染时间、转染温度、转染复合物的浓度等。
5. 转染后的培养：转染完成后，将细胞悬液转入含有适当选择性抗生素的培养基中进行培养，以筛选成功转染的细胞。
五、转染效果的验证转染完成后，需要进行转染效果的验证。
常用的验证方法包括荧光显微镜观察、蛋白质表达分析、PCR验证等。
根据实验要求，选择合适的验证方法，评估转染效果。
六、注意事项1. 转染试剂的质量需经过严格检测和筛选，确保其稳定性和转染效率。
2. 转染过程中需注意无菌操作，避免细菌、真菌等污染对实验结果的影响。
promega双荧光素酶说明书
promega双荧光素酶说明书
Promega双荧光素酶说明书
一、简介
Promega双荧光素酶系统是一种灵敏的报告基因检测工具，用于检测细胞
或组织中荧光素酶的表达水平。
该系统包括荧光素酶基因报告质粒、荧光素酶活性检测试剂和荧光检测仪。
通过将荧光素酶基因报告质粒转染到细胞中，可以监测荧光素酶的表达水平，从而了解基因的表达情况。
二、主要特点
1. 高灵敏度：可检测低至 pg荧光素酶的活性。
2. 快速：可在短时间内完成检测。
3. 简便：无需特殊设备，只需一台荧光检测仪即可完成检测。
4. 稳定：荧光素酶基因报告质粒可在细胞内稳定表达，提供可靠的检测结果。
三、使用方法
1. 转染荧光素酶基因报告质粒：将荧光素酶基因报告质粒转染到细胞中，按照说明书操作。
2. 培养细胞：在适宜条件下培养细胞，使荧光素酶表达。
3. 收集细胞：离心收集细胞，并洗涤去除培养基中的荧光素酶抑制剂。
4. 检测荧光素酶活性：将细胞悬浮在检测缓冲液中，加入荧光素酶活性检测试剂，充分混匀后进行荧光检测。
5. 数据分析：通过荧光检测仪获取数据，并使用相关软件进行数据分析。
四、注意事项
1. 请在专业人员的指导下操作。
2. 避免直接接触试剂，以免对皮肤和眼睛造成刺激。
3. 试剂应存放在阴凉干燥处，避免阳光直射和高温。
4. 转染荧光素酶基因报告质粒时，应遵循无菌操作原则，避免交叉污染。
双萤光素酶实验的具体步骤及注意事项
双萤光素酶实验的具体步骤及注意事项
双萤光素酶实验的具体步骤
1、报告基因质粒的构建。
将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。
2、转染细胞。
将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。
共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。
Luciferase活性测定：
⑴ 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。
将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。
⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。
⑷ 测定荧光值。
向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。
加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。
⑸ 数据处理。
首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。
实验注意事项
1、为保证荧光素酶检测试剂的稳定性可以采取适当分装后避光保存的方法，以免反复冻融和长时间暴露于室温。
2、为取得最佳检测效果，同一批样品最好保证相同的测定时间，通常为10 s。
双荧光素酶报告实验
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参考案例
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案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶 报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性 。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为 相对荧光素酶活性。实验重复3次。
报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性
。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100
Step2：共转染 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为
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参考案例
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案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别
Step1：构建载体 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶
植物双荧光素酶报告基因实验步骤
植物双荧光素酶报告基因实验步骤植物双荧光素酶报告基因实验是一种常用的遗传工程技术，用于研究植物生长和发育过程中的基因表达。
本文将介绍植物双荧光素酶报告基因实验的步骤，包括实验材料的准备、实验过程和数据分析。
希望通过本文的介绍，读者能够了解植物双荧光素酶报告基因实验的基本原理和操作步骤，从而在实验中取得良好的结果。
实验材料的准备1.植物基因表达载体：选择适合植物的基因表达载体，通常是含有CaMV 35S启动子的质粒载体。
2.双荧光素酶基因：选择适合植物的双荧光素酶基因，通常是含有GFP和RFP标记的基因。
3.植物材料：选择要进行基因表达研究的植物材料，通常是拟南芥或番茄等模式植物。
4.转化试剂：选择合适的转化试剂，例如农杆菌或利用基因枪进行转化。
实验过程1.构建双荧光素酶报告基因表达载体：首先将选择的双荧光素酶基因插入到基因表达载体中，通常采用限制酶切和连接酶切方法进行构建。
2.转化植物细胞：将构建好的基因表达载体转化到植物细胞中，可以采用农杆菌介导的转化方法或利用基因枪进行转化。
3.筛选转化植株：筛选转化后的植株，通常通过抗生素筛选或基因标记筛选的方法确定转化植株。
4.观察基因表达：观察转化植株中双荧光素酶基因的表达情况，通常通过荧光显微镜观察GFP和RFP的荧光表达情况。
5.分析基因表达：对双荧光素酶基因的表达进行定量分析，通过荧光素酶酶活性测定或荧光强度测定等方法进行分析。
数据分析1.统计分析：对实验得到的数据进行统计分析，包括双荧光素酶基因的表达比例、荧光强度等指标进行统计。
2.图表分析：将统计分析的结果用图表的形式进行展示，包括柱状图、折线图等形式，直观地展示基因表达的情况。
3.结果解读：根据统计分析和图表分析的结果，对双荧光素酶基因在植物中的表达情况进行解读，探讨其在植物生长和发育过程中的作用。
通过以上步骤，可以完成植物双荧光素酶报告基因实验，研究植物生长和发育过程中的基因表达情况，为了解植物生物学和遗传学提供重要的实验数据。
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤双荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因表达、蛋白质相互作用等生物学过程。
下面将介绍双荧光素酶报告基因实验的详细步骤，希望能对您的实验工作有所帮助。
1. 质粒构建。
首先，需要将双荧光素酶报告基因构建到适当的表达载体中。
一般来说，可以选择pGL3基因表达载体，将双荧光素酶报告基因插入到该载体的多克隆位点中。
构建好的质粒可以用于转染细胞进行后续的实验操作。
2. 细胞培养。
接下来，需要选择适当的细胞系进行实验。
常用的细胞系有HEK293、HeLa等。
将选定的细胞系进行培养，直至细胞密度达到要求，可以进行后续的转染实验。
3. DNA转染。
将构建好的双荧光素酶报告基因质粒转染至培养好的细胞中。
可以选择合适的转染试剂，按照试剂说明书的操作步骤进行转染。
转染后，将细胞培养在含有适当抗性筛选剂的培养基中，以筛选转染成功的细胞。
4. 荧光素酶活性检测。
转染后的细胞需要进行荧光素酶活性检测。
首先将培养基抽取，然后加入荧光素底物，测定细胞中荧光素酶的活性。
可以使用荧光素酶检测试剂盒进行操作，按照说明书进行操作。
5. 双荧光素酶报告基因实验结果分析。
最后，根据实验结果进行数据分析。
可以通过比较不同组的荧光素酶活性来研究基因的表达水平，或者研究蛋白质的相互作用等生物学过程。
通过实验结果，可以得出相应的结论并进行讨论。
以上就是双荧光素酶报告基因实验的详细步骤。
希望对进行该实验的科研工作者有所帮助，也希望大家能够在实验中取得理想的结果。
祝实验顺利！。
双荧光素酶报告基因实验
双荧光素酶报告基因实验双荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因的表达情况和调控机制。
该实验利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其荧光强度来反映目标基因的表达水平。
以下是双荧光素酶报告基因实验的详细步骤及注意事项。
实验步骤：1. 转染细胞，首先，将目标基因的启动子区域和报告基因的编码区域克隆到适当的表达载体中，然后将该表达载体转染至目标细胞中。
2. 处理细胞，在转染后的细胞中，根据实验设计的需要，可以给予不同的处理，如药物处理、基因敲除等。
3. 提取蛋白，收集处理后的细胞，进行蛋白提取，并测定蛋白的浓度。
4. 测定荧光强度，将提取的蛋白加入相应的底物，利用荧光分光光度计测定双荧光素酶的荧光强度。
5. 数据分析，根据测定的荧光强度数据，分析目标基因的表达水平及其受到处理的影响。
注意事项：1. 转染条件的优化，不同细胞对转染条件的要求不同，需要进行转染条件的优化实验，以确保转染效率和细胞存活率。
2. 底物的选择，选择适合双荧光素酶的底物，并根据实验需要选择合适的检测波长。
3. 控制实验的设计，在实验中应设置适当的对照组，以确保实验结果的可靠性和准确性。
4. 数据的统计分析，对实验数据进行统计分析，包括均值、标准差等指标的计算，以确保实验结果的可靠性。
总结：双荧光素酶报告基因实验是一种重要的分子生物学实验方法，可以用于研究基因的表达调控机制。
在进行该实验时，需要严格控制实验步骤，注意实验细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文提供的实验步骤和注意事项对您进行双荧光素酶报告基因实验有所帮助。
双荧光素酶报告实验细胞转染详细步骤及说明
双荧光素酶报告实验细胞转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm 培养皿中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2 ml PBS洗涤
细胞两次；
2. 加入2 ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，37ºC 放置1-5 分钟；
3. 小心吸去胰酶溶液，加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml。
按5×10 5 细胞/孔的浓度接种12 孔板，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
5. 每1 OD 260 microRNA 用125 μl DEPC-H 2 O 溶解，终浓度约为20 μM；
6. 在1.5 ml EP 管中加入100 μl 无血清培养基，加入10 μl microRNA，再加入对应的双荧光报告载体1 μg，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入100 μl 无血清DMEM，加入4μl lipofectamine 2000，混匀，室温放置5 分钟后将两管混合，室温放置20 分钟；
7. 实验分组：
验证分组为：A. mimic NC+ WT；B. mimic NC+ MUT；C. miRNA + WT；D. miRNA + MUT；E. mimic NC+ miRNA PC；F. miRNA + miRNA PC，各组设3 复孔；
8. 吸去12 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入12 孔板中，混匀后，在培养箱中温育5 小时；
9. 吸弃转染液，加入500 μl 完全培养基。
37ºC 5% CO 2 继续培养24、48 小时，分别收样；
10. 所得细胞用于双荧光素酶系统检测。
双荧光素酶报告实验
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参考案例
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案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别
Step1：构建载体 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶
相对荧光素酶活性。实验Ti重p复：3次此。处使用的是实验中相应的肿瘤细胞
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参考案例
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案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-
CADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX和阴性对照质粒分别共转染
载体以及与目标分
子结合位点突变的
突变体。
2 共转染
将两种报告质粒、过 表达质粒以及阴性对 照质粒分别共转染至 细胞中，转染24 h后 裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收 集上清。
3 检测荧光素酶活性
每个细胞样品中加入 100 μL萤火虫荧光素 酶工作液检测萤火虫 荧光素，加入100 μL 海肾荧光素酶工作液 检测海肾荧光素酶 ， 实验重复3次。
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参考案例
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案例二
生物信息学进行LINC01082和miR-XX结合关系的分析，利用荧光素酶报告法验证miR-XX是 LINC01082的直接靶点，人工合成LINC01082 基因片段利用内切酶位点SpeI 和Hind III 引入pMIRreporter (北京华越洋生物科技有限公司) 中，在LINC01082野生型上设计种子序列的互补序列突变位点 ，通过限制性内切酶酶切后使用T4 DNA 连接酶将目的片段插入到pMIR-reporter 报告质粒中。将测序 正确的荧光素酶报告质粒WT和MUT分别与miR-XX共转染至细胞HEK-293T (上海北诺生物科技有限公司) 中。转染48 h后收集并裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒 (K801-200，Biovision 公司) Glomax20/20
双荧光素酶实验详细步骤
双荧光素酶实验详细步骤
双荧光素酶实验是一种常用的基因表达分析方法，它可以用于检测细胞中的基因表达水平。
以下是双荧光素酶实验的详细步骤：
1. 细胞培养：将需要检测的细胞培养在合适的培养基中，使其生长到适当的密度。
2. 转染：将含有目的基因和荧光素酶报告基因的质粒转染到细胞中。
转染可以使用化学转染、电穿孔或病毒转染等方法。
3. 培养：将转染后的细胞培养在合适的条件下，使其表达荧光素酶报告基因。
4. 细胞裂解：将培养后的细胞用细胞裂解液裂解，以释放荧光素酶报告基因和目的基因的产物。
5. 荧光素酶活性检测：将细胞裂解液与荧光素酶检测试剂混合，然后在荧光仪上检测荧光素酶的活性。
荧光素酶活性的高低反映了目的基因的表达水平。
6. 数据分析：将荧光素酶活性的检测结果与对照组进行比较，以确定目的基因的表达水平是否发生了变化。
双荧光素酶实验的结果受到多种因素的影响，如细胞类型、转染效率、培养条件等。
因此，在进行实验时，需要严格控制实验条件，以确保实验结果的准确性。
双荧光素酶报告基因检测实验过程
双荧光素酶报告基因检测实验过程在生物实验室里，双荧光素酶报告基因检测可真是一门有趣的技术。
听起来复杂，其实也不难，咱们就来聊聊这其中的酸甜苦辣吧。
双荧光素酶就像两个好朋友，默契配合，帮助我们探测基因的活动。
想象一下，一对小伙伴儿，打着灯笼，帮你照亮那条神秘的基因小路。
你看看，这灯光一亮，哎呀，所有的秘密都暴露无遗了！咱们实验的第一步就是准备样品。
这个过程呢，就像做一顿美味的家常菜，得有好食材。
我们需要选择适合的细胞或者组织，像是挑选新鲜的蔬菜水果一样，小心翼翼。
然后把这些样品处理得干干净净，保证它们能发出耀眼的荧光。
你瞧，这准备工作就像打好基础，只有基础打牢，后面的实验才会顺顺利利。
就这点小细节，可别大意了哦。
就是要把我们的双荧光素酶基因转染到细胞里。
转染的过程其实挺像是给细胞植入一个小秘密，嘿嘿，细胞可不知道它们要接收什么新鲜玩意儿。
一旦转染成功，细胞就开始疯狂表达这两个荧光素酶，像是开了趴一样热闹。
不久后，这些小家伙儿就会开始发光，灯火通明。
这时候，你可能会想，“哇，真的发光了？”没错，这就是科学的魅力，真是让人惊叹不已啊。
然后，我们就得用荧光显微镜来观察这些细胞。
看着这些发光的小家伙，就像看星星一样，特别美妙。
这里的关键在于调节显微镜的参数，光亮得刚刚好，不多不少。
太亮了可能看不清，太暗了就显得有些无趣。
就像调味料，得掌握好分寸。
这个过程有点像是在做一场灯光秀，要把每一个细节都调到最佳，才能让你眼前一亮。
然后呢，咱们得定量分析一下这些荧光的强度。
说白了，就是要算一算，哪些基因在欢欢喜喜地工作，哪些可能在“打瞌睡”。
这可不是简单的算术题，而是一场数据的盛宴。
把所有的荧光强度都记录下来，汇总成一个漂亮的数据表。
看到那些图表的时候，你会觉得，哎，自己的努力真是没有白费。
每一个数字都像是一颗颗璀璨的宝石，闪闪发光。
哦，对了，实验过程中还得小心翼翼，不要让外部因素影响到结果。
就像在厨房里，锅得掌握好温度，火候过了就糟糕了。
手把手教你双荧光素酶报告实验
手把手教你双荧光素酶报告实验萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，检测灵敏度高。
荧光素酶报告基因被广泛用于miRNA靶基因验证。
荧光素酶报告基因的原理在于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至pGL3-basic载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。
然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。
结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
同时，为了减少内在的变化因素，比如：培养细胞的数目、细胞转染和裂解的效率等对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录效率的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。
在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂Luciferase Assay Reagent II时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶活性。
定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo Reagent试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，进行第二次测量，称之为双荧光素酶报告基因实验。
下面就介绍一下萤光素酶实验检测步骤：一、样品准备：1质粒转染细胞（1）细胞铺板：将细胞按50%的密度接种到细胞培养12孔板内。
（2）转染：16h左右细胞约70%时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔。
首先设计四组：1.空白组（转染试剂+细胞）2.质粒组3.质粒+miRNA NC组4.质粒+miRNA mimics组2.1配制质粒组：按照每空50ng质粒，同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，标记为A。
双荧光素酶报告分析
双荧光素酶报告分析引言双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统是一种广泛应用于生物学研究中的实验技术。
该系统利用荧光素酶（Luciferase）酶的催化活性，通过测量荧光信号的强度来研究基因表达、信号转导和细胞代谢等过程。
本文将介绍双荧光素酶报告系统的原理、操作流程以及数据分析方法。
双荧光素酶报告系统原理双荧光素酶报告系统由两种荧光素酶构成：荧光素酶1（Luciferase 1）和荧光素酶2（Luciferase 2）。
荧光素酶1（Firefly Luciferase）主要用于检测目标基因表达水平，而荧光素酶2（Renilla Luciferase）则作为内部对照用于标准化实验结果。
这两种酶的催化反应都需要荧光素底物供应。
当目标基因表达时，荧光素酶1会催化荧光素底物产生荧光信号。
通过测量荧光信号的强度，可以了解目标基因的活性水平。
同时，荧光素酶2也会催化荧光素底物产生荧光信号，用于对实验结果进行内部对照和标准化。
实验操作流程1.细胞转染：首先，将目标基因转染入感兴趣的细胞中。
这一步可以通过化学方法或者质粒转染等技术实现。
2.荧光素底物处理：待转染细胞充分恢复并生长后，将荧光素底物加入培养基中。
荧光素底物会被细胞摄取，并被荧光素酶催化产生荧光信号。
3.荧光信号测量：使用荧光酶标仪或者其他荧光测量设备对细胞培养物进行测量。
通过测量荧光强度，可以得到目标基因表达的水平。
4.数据分析：将荧光素酶1产生的荧光信号除以荧光素酶2产生的荧光信号，可以得到标准化后的目标基因表达水平。
根据实验需求，可以采用不同的统计方法和图表来分析和展示结果。
数据分析方法在双荧光素酶报告分析中，常用的数据分析方法包括以下几种：1.对照组和实验组比较：将实验组的荧光信号值与对照组进行比较，通过统计学方法（如t检验或方差分析）确定差异的显著性。
2.报告基因表达水平分析：比较不同实验条件下报告基因的表达水平，可以了解目标基因在不同条件下的变化趋势。
双萤(荧)光素酶检测研究方法及步骤
双萤(荧)光素酶检测研究方法及步骤产品简介萤（荧）光素（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。
在荧光素酶的催化下，荧光素底物可以高效的转变成氧萤光素，同时发出强烈的光。
鉴于此，研究者利用荧光素酶开发出一套极其灵敏且使用方便的基因报告系统。
目前这一系统被广泛用于转录因子结合位点与启动子活性分析、RNA降解、信号转导、药物筛选、动物活体成像等领域。
服务推荐●转录因子结合位点与启动子活性分析●miRNA靶基因验证●lncRNA吸附miRNA验证●circRNA吸附miRNA验证●专业的实验方案设计技术特点●强大的学术支持团队协助设计科学合理的实验方案●极简的HB-infusion无缝克隆策略极大缩减载体构建周期●高效的LipoFiter转染试剂和病毒转导系统，确保结果稳定和可重复性●详细的原始数据和实验结果分析，确保结论清晰可靠两种常用载体类型极其应用场景●pGL3-Basic---用于转录因子结合位点与启动子活性分析。
把待分析启动子区段构建到F-Luciferase上游，和转录因子共转染分析F-Luciferase活性即可反应启动子的活性高低。
该质粒通常需要结合持续性表达R-Luciferase的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率(参考案例一)。
●psiCHECK2---miRNA与其靶点相关分析,包括miRNA靶基因验证(参考案例二A和B)、lncRNA (参考案例三)与circRNA (参考案例四)吸附miRNA验证等。
需要把miRNA潜在结合靶点克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR区域，然后与待测miRNA共同转染细胞内测定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase （hLuc+）作为校正内参校正不同样品之间转染的转染效率。
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双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。
37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。