诊断 评价

文献评价范例侵袭性真菌感染日益增多，在免疫缺陷的患者中，发病率高而且是导致死亡的重要因素，目前在临床的危重病人中曲霉菌感染已成为急需解决的严重问题，但迄今为止对侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis, IA)的诊断,国内外尚无公认的诊断标准，特别是早期诊断尚存在较大的困难。

为了要解决临床的重要问题，寻求循证医学证据，提供临床最好的诊断性试验，经检索近10年的文献，目前有3篇论著可供参考与评价。

第一篇二步法聚合酶链反应检测血液恶性肿瘤患者曲霉菌感染的研究刘俊青冯立民宋华孟海涛金洁钱文斌中华内科杂志 2005，44（10）：726-729【内容提要】目的目前曲霉菌感染已成为临床上亟待解决的严重问题，但迄今为止对侵袭性曲霉菌感染(IFI)的诊断,国内外尚无公认的诊断标准，特别是早期诊断尚存在较大的困难。

本文探讨二步法PCR检测曲霉菌的敏感性和特异性及其在血液肿瘤患者侵袭性曲霉菌感染(IFI)中的诊断价值。

纳入病例的选择标准:（1)化疗后WBC减少<1.0×109/L，(2)发热>38.5℃，(3)对广谱抗生素治疗无反应和(或)胸片有非特异性浸润。

符合标准者41例,均为白血病患者。

对照组12例其中健康志愿者6例,非感染患者6例。

方法二步法PCR检测有真菌感染高危因素的41例患者外周血中曲霉菌18S rRNA基因,临床结合CT检查、曲霉菌培养、患者骨髓抑制状况和抗真菌治疗效果,分析二步法PCR检测侵袭性曲霉菌的诊断价值。

结果经PCR产物测序结果与曲霉菌18S rRNA基因序列高度同源。

41例高危IFI病例中16例PCR阳性（敏感度39%）,有25例阴性（假阴性率61%）。

阳性组中8例有曲霉菌感染的影像学表现,各有1例从胸腔积液、鼻分泌物培养出曲霉菌,2例血培养阳性。

而12例对照者为PCR阴性（特异度100%）。

对PCR阳性者16例拟诊IFI,予以抗真菌治疗后,化疗相关早期死亡仅1例。

作者结论二步法PCR检测对曲霉菌诊断的敏感性和特异性较高,假阳性和假阴性率均较低,结合临床资料,对IFI的早期诊断以及指导临床选择抗真菌治疗有较好的价值。

【对文献的评价】一、诊断性试验的真实性1. 是否用盲法将诊断性试验与参考标准（金标准）作过独立的对比研究？诊断性试验的结果与参考标准做了对比，但并非盲法。

目前国内外均系依照临床症状和体征选择疑似病例，因此还不能成为金标准。

严格来讲应有曲霉菌培养或病理组织的阳性结果，才能确诊为侵袭性曲霉菌感染患者。

本试验阳性16例中，8例肺部影像学表现并非特异性改变，只有4例曲霉菌培养阳性，才能肯定是曲霉菌感染。

按此内容列表如下：敏感度=100%，特异度=75.5%，阳性似然2. 该诊断性试验是否包括了适当的病谱？目前的纳入标准均不够严格，实际上已经包括了很多疑似的病例。

作者将侵袭性曲霉菌感染简写为IFI，实际上IFI应系侵袭性真菌感染（invasive fungal infection）的简称。

3. 诊断性试验的检测结果，是否会影响到参考标准的应用？不可能，由于曲霉菌病的病原学的诊断不易获得，而且诊断性试验的结果，会有不少假阳性的病例，扩大了病例范围，反映了目前的参考标准尚待改进。

4. 如将该试验应用于另一组病例，是否也具有同样的真实性？是的，该文献报道PCR 所用的引物与有序列同源性，而与人类18S rRNA 基因或念珠菌的16S rRNA基因均无同源性，因此该试验用于其它组的病例，应具有同样的真实性。

可是，由于本文的确诊病例很少（4例），该结论还有待今后累积更多病例后才能确定（病例组样本量至少应在30例以上）。

二、诊断性试验的重要性5. 是否通过该项诊断性试验，能正确诊断或鉴别该患者有无特定的目标疾病? 目前还不能通过这项试验做正确诊断，阳性病例只能认为是疑似患者。

正确诊断的依据是真菌培养和组织病理学检查结果，但真菌培养不易得到阳性结果，而且培养时间较长（8-30天），如果又没有病理组织诊断，这就会给正确诊断带来较大的困难。

因此，进一步研究更好的诊断性试验甚为重要。

6. 是否作了分层似然比的计算？没有。

三、诊断性试验的实用性7. 该试验是否能在本单位开展并能进行正确的检测?本试验的原理方法叙述明确，但设备要求较高，在一般医疗单位不可能开展。

8. 我们在临床上是否能够合理估算病人的验前概率？病例选择标准没有特异性，因此验前概率估计的误差可能较大。

9. 检测后得到的验后概率是否有助于我们对病人的处理？假定验前概率为20%，阳性似然比= 4.1，计算验后概率=50.1%，已超过诊断阈值，但还需要做进一步的检查，同时可对患者进行相应的治疗。

【小结】本文虽然使用了多种曲霉18S基因为引物，但很难确定阳性病例均系侵袭性曲霉菌病感染的患者，且假阳性率较高（12/16=75%），而曲霉菌培养的时间又长，要诊断曲霉菌感染患者，还有待更好的诊断学方法。

目前本试验虽具有一定的真实性和实用性，但还不够理想。

第二篇血清半乳甘露聚糖检测血液病患者侵袭性曲霉菌病的价值谢莉萍刘霆孟文彤周静中华内科杂志 2006；45（12）：992–995【内容提要】目的侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillus IA)在血液病患者发病逐年增多,且伴随很高的病死率。

本研究旨在评价血清半乳甘露聚糖(GM)抗原检测作为早期诊断和评价IA疗效的价值。

方法81例中性粒细胞减少伴发热(T＞38.5℃),经广谱抗生素治疗无效的血液病患者被纳入研究。

每周采集患者血液标本2次,共测定标本302份。

GM检测采用双夹心酶联免疫吸附法, GM检测实验的阳性定义为连续2次不同时点检测,A 值＞1.5。

对GM检测实验阳性的患者，给予两性霉素B或伊曲康唑抢先抗曲霉菌治疗。

结果81例患者中27例GM检测为阳性(阳性率33.3 % ),其中11例临床确诊IA,GM试验7例阳性(敏感性63.6% )，14患者临床排除IA,GM试验阴性者8例，疑似病例33例GM试验阳性10例。

进行GM试验的结果显示比真菌培养结果要提前3～30天确定曲霉菌的感染。

结论研究提示:血清GM抗原检测用于早期诊断IA是一种有效的方法,在高危血液病患者以GM实验阳性为起点，抢先抗曲霉治疗可降低IA病死率,监测GM值的动态变化具有评价疗效的价值。

【对文献的评价】一、诊断性试验的真实性1. 是否用盲法将诊断性试验与参考标准（金标准）作过独立的对比研究？本文未用盲法对比，但采用的金标准（曲霉菌培养）是可靠的。

2. 该诊断性试验是否包括了适当的病谱？是的，病例既包括了曲霉菌感染患者，也包括了其他霉菌感染以及疑似霉菌感染的患者，应该是比较全面的。

3. 诊断性试验的检测结果，是否会影响到参考标准的应用？不会，本文采用严格的金标准，因此不论该试验的结果如何，都不会影响到正确的诊断。

4. 如将该试验应用于另一组病例，是否也具有同样的真实性？该试验用于其他病例组，半乳甘露聚糖检测应有同样的真实性。

但是，当白血病过低（WBC＜ 1.0×109）,中性粒细胞减少/ 缺乏时，抗原递呈功能和淋巴细胞功能受损,会使得部分血清试验，包括半乳甘露聚糖检测等,阳性率降低，使得诊断价值受到影响。

本文确诊病例较少（仅11例），正确结论还有待扩大检查病例后再确定。

二、诊断性试验的重要性5 是否通过该项诊断性试验，能正确诊断或鉴别该患者有无特定的目标疾病?是的，本验阳性时基本可以诊断曲霉菌的感染。

实际上本试验共纳入患者81例，“无病”患者，应该包括其他霉菌感染23例，疑似病例33例和14例排除IA的患者（共计70例），四格表应重新制作（如下），计算其敏感度=63.6%，特异度=71.4%（原文为Array85.7），阳性似然比=2.2，因此，单纯依靠该试验的结果对确定曲霉菌感染的诊断尚有一定难度。

6. 是否作了分层似然比的计算？未计算分层似然比。

三、诊断性试验的实用性7. 该试验是否能在本单位开展并能进行正确的检测?本试验的原理方法叙述明确，但生化检验及霉菌培养的设备要求较高，在一般医疗单位不可能开展。

8. 我们在临床上是否能够合理估算病人的验前概率？病例选择标准并无特异性，因此估计验前概率的误差可能较大。

9. 检测后得到的验后概率是否有助于我们对病人的处理？该试验对诊断曲霉菌感染有一定价值，但阳性似然比较低，假定：验前概率估计为20%，则验后概率为35%，虽然尚未超越诊断-治疗阈值，但已超过诊断阈值（25%），因此，检测结果阳性的病例，还需要作相关的检查，并给予相应的抗霉菌治疗。

为了提高侵袭性曲霉菌感染的确诊病例，如果能与前项检验做序列试验，则特异度可达93%，在很大程度上提高了确诊率。

【小结】该试验敏感度（64%）和特异度（71%）都不很高，对诊断侵袭性曲霉菌感染的临床价值受到一定限制，而且中性粒细胞缺乏时，中性粒细胞抗原递呈功能和淋巴细胞功能受损,会使得血清半乳甘露聚糖检测的阳性率降低。

但该试验仍然是具有真实性和实用性的诊断性试验。

为了提高侵袭性曲霉菌感染的确诊病例，如果能与前项试验（二步法PCR）做序列试验，则特异度可达93%，敏感度=64%，阳性似然比=9.1。

验前概率仍然是20%，按以上数据计算，验后概率=70%，已超过了诊断-治疗阈值（65%），在很大程度上提高了确诊率，此时即可开始的治疗，这对临床系统治疗侵袭性曲霉菌感染有很大的帮助。

第三篇：Development of Novel Real-Time PCR Assays forDetection and Differentiation of Eleven Medically Important Aspergillus and Candida Species in Clinical SpecimensClaudia Schabereiter-Gurtner, Brigitte Selitsch, Manfred L Rotter, Alexander M. Hirschl, Birgit Willinger。

J Clinic Microbiol 2007, 45（3）: 906–914 【SUMMARY】Objective：Invasive fungal infections（IFI）are increasingly recognized as a primary cause of morbidity and mortality, especially the increasing incidence of aspergillosis, a life-threatening infection in immunocompromised patients, the invasive aspergillosis (IA) is mainly caused by Aspergillus fumigatus. In the present study, novel real-time PCR assays targeting the fungal ITS2 region were developed for the detection and differentiation of medically important Aspergillus species and Candida species using a LightCycler instrument.MethodsThe combination of a group-specific and a universal primer with five Aspergillusor six Candida species-specific bi-probes in one reaction mixture facilitated rapid screening and species differentiation by the characteristic peak melting temperatures of the bi-probes. Both assays can be performed either as single assays or simultaneously in the same Light Cycler run. To assess the clinical applicability, 26 respiratory samples, 4 tissue samples from the maxillary sinus, and 1 blood sample were retrospectively tested and real-time PCR results were compared with results from culture, histology, or a galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay (GM-ELISA).ResultsTwenty samples (64.5%) were both culture positive and positive by real-time PCR. Six samples (19.4%) showed no growth of fungi but were positive by real-time PCR. However, all of the tissue samples were positive by both PCR and histology. The blood sample showed no growth of Aspergillus, but aspergillosis was confirmed by positive GM-ELISA, histology, and PCR results. The remaining five samples (16.1%) were culture and PCR negative; also, no other signs indicating fungal infection were observed.ConclusionOur data suggest that the Aspergillus and Candida assays may be appropriate for use in clinical laboratories as simple and rapid screening tests for the most frequently encountered Aspergillus and Candida species and might become an important tool in the early diagnosis of fungal infections in the future.【EVALUATION】A IS THE EVIDENCE ABOUT A DIAGNOSIS TEST VALID ?1. Was there an independent, blind comparison with a reference (“gold”)standard of diagnosis?The inclusion criteria was not a reference standard and the blind comparison has not been done. The only gold standard was aspergillus culture or histology findings.2. Was the diagnostic test evaluated in an appropriate spectrum of patients?Yes, The samples were taken in an appropriate spectrum patients, all of them were suspected invasive fungal infection. Most of the samples were bronchoalveolar lavage (19/31) and bronchial secretion(5/31).3.Was the reference standard applied regardless of the diagnostic test result?Of course, the gold standard was applied regardless of the test results. Since the gold standard was the fungal cultures.4. Was the test validated in a second, independent group of patients?If the same aspergillus-specific primer was used for other group of patients, also operated by the experienced technician the results would be same. Therefore, the test was validated.B. DOSE THIS(VALID) EVIDENCE DEMONSTRATE AN IMPORTANT ABILITY OF THIS TEST TO ACCURATELY DISTINGUISH PATIENTS WHO DO OR DON’T HAVE A SPECIFIC DISORDER ?1.Were the sensitivity, specificity, and likelihood ratios calculated?This article did not report sensitivity, specificity either positive likelihood ratio. According to the database, total number of samples were 31, number of positive test were 26, number of negative test and negative culture were 5.As the above four-cell table shows：sensitivity = 100%, specificity = 45.5%, positive likelihood ratio = 1.83. Because, the sample size of the real patients group was not quite enough, it needs further study.2. Multilevel likelihood ratios presented?Without any data of multilevel test resultsC. CAN I APPLY THIS VALID, IMPORTANT DIAGNOSTIC TEST TO A SPECIFIC PATIENTS?1. Is the diagnostic test available, affordable, accurate, and precise in our setting?The procedures of this diagnostic test was described clearly, including amino acid sequences of aspergillus-specific primers( Asp-F, IST-R ) and candida-specific primers( Cand-F, IST-R ) and so forth. This real-time PCR assay which allows the simultaneous detection and identification of various cadida and aspergillus species. The results had been quite promising, and the assay might be conducted in a research institute, because the procedures are complex and needs advanced technology.2.Can we generate a clinically sensible estimate of our patient’s pre-test probability?Not, in fact patients with invasive aspergillus sometimes are deteriorate and severe, therefore, the pre-test probability might be over estimate.3. Will the resulting post-test probability affect our management and help our patient?No, this result may not affect our management. For example: if we suppose a patient his pre-test probability is 20%, in this real-time PCR positive likelihood ratio =1.83, then, we can calculate post-test probability equals 32%. it does not over test-treatment threshold, then we still need another diagnostic test to help our patient. 【COMMENTS】This real-time PCR assay which allows the simultaneous detection and identification of various Candida and Aspergillus species. As the results shows a highest sensitivity, but there are many mis-diagnosed patients (false-positive), specificity of this test isn’t perfect--only 45.5%. When we evaluate the clinical impactof these assays should combination with other tests, such as the detection of GM-ELASA. We still need a large sample Real-time PCR study in the near future to confirm their results.总结通过上述文献的评价，无论是二步法PCR、半乳甘露聚糖试验或是实时PCR 技术，都有较高的敏感度，但是，敏感度很高就意味着存在假阳性的可能性很大，也就是使误诊病例增多。