小孢子培养步骤

小麦小孢子培养方法步骤
1、取材时期
当花粉发育时期处于单核中期到晚期，其外部表型表现为麦芒刚完全露出到穗子抽出旗叶2/3左右，当穗子抽出一半时最佳。

2、冷处理
剪穗子时将整个分蘖从茎基部3cm左右剪下，去除其余叶片只留旗叶。

把穗子放在装有水的瓶子中然后再套上塑料袋以保湿，放在4℃，弱光保存2周（只多不少）。

3、取花药、饥饿处理
低温处理2周后，挑选合适的穗子开始取花药，选穗子的标准为：穗子麦芒刚露出旗叶至穗子露出旗叶一半（并选取颜色比较浅的穗子）。

剪去麦芒，剪下穗子，用2%NaClO+2滴Tween-20，放在摇床上处理20min进行表面消毒，然后再在超净台中用灭菌水冲洗3次。

在每个小培养皿（直径约3cm）中加5ml0.3M甘露醇，再加入头孢噻肟（cefotuxime）(工作浓度为200mg/l)。

左手拿镊子夹住穗子，右手拿一把小弯头镊子取花药。

首先用小镊子去除颖壳和外稃，再夹住3枚花药取出放入培养液中，注意:1、不能伤害花药、夹断花药；2、不能将子房放入培养液中；3、弯头镊子不能碰到培养基。

每个培养皿放2个穗子的花药，然后封上封口膜，放到32℃暗培养3天。

4、收集小孢子
暗培养3天后开始收集小孢子，收集小孢子时用到的滤网最好是40um或者80um，但是这种滤网在用玻璃棒清理花药上的小孢子时容易堵网眼，所以一般用200um的滤网进行过滤收集。

收集方法：右手拿培养皿同一水平面上晃几下，是为了重悬沉在下面的小孢子，然后快速倒到套有滤网的杯子中，再用0.3M甘露醇冲洗也倒入杯子中（大约用3ml）。

最后用玻璃棒清理滤网上花药附着的小孢子，水平向下推玻璃棒使残留的液体透过滤网下去，然后再往花药上加2ml左右的0.3M甘露醇，重复以上动作4到5次。

然后去掉滤网把混有小孢子的培养基分到离心管中，可以向杯子里加些许0.3M甘露醇冲洗以获得更多的小孢子，800rpm离心6min。

离心后小孢子在管底，去除上清液，然后加几滴0.3M甘露醇用手轻轻摇晃离心管使小孢子悬浮起来，然后把所有的小孢子悬浮液集中到一个离心管中，然后再平均分到事先加了4ml21%（0.58M）麦芽糖，600rpm离心12min。

这一步的注意事项：1、离心前要配平；2、把小孢子悬浮液加到盛有麦芽糖的管中时为了不使两种糖混合，左手拿盛有麦芽糖的离心管基本成水平，右手拿转移管，管口距离麦芽糖液面一定距离一滴一滴的加小孢子悬浮液；3、这一步离心停止降速的时候要选择soft，因为离心后有活性的小孢子处在两种糖的交界处，如果降速太快会破坏液面。

离心之后，用转移管小心的将有活性的小孢子吸出放到一个干净的离心管中，然后再加入一定量的0.3M甘露醇，不超过离心管的最大承受量，然后配平离心，600rpm离心6min。

离心后去除上清，立即加入一定量的诱愈培养基（加入量按小孢子的量计算能够分x份，一般按照(1.6-1.7)ml*x），然后加入头孢噻肟（工作浓度200mg/l），然后在每个小培养皿中加1.5ml，有剩余的就逐滴分配到每个培养皿中。

然后每个培养皿加入10个子房，要选择尽可能老的穗子但是子房还没有授粉，按照取花药时
处理穗子的方法处理然后取出子房，不要伤害子房。

然后放置28℃暗培养。

小孢子培养的诱愈培养基是过滤灭菌。

5、再生及生根
28℃暗培养大约2周就能看见胚型愈伤，当大小在0.5mm左右时转移到再生培养基上，大约1周后就能看见绿体出现，等叶片长到2-3cm时转移到生根培养基中。

如果已经在再生培养基中生根就用刀把根割断。

在生根培养基中大约4周，根长到足够长（绕管2圈以上）就可以移栽到温室。

移栽之后先用塑料保湿3-4天，然后等苗长壮后可以放在室外炼苗，之后再移栽到大田。