牛黄参含药血清对肝干细胞WB_F344增殖和凋亡的影响_陈利锋

【基金项目】　国家自然科学基金项目（３０９７３７０５）【作者单位】　４３００６５　湖北武汉，湖北中医药大学［陈利锋（现在广州军区武汉总医院中西医结合科）、赵映前、李　鸣］；广州军区武汉总医院医学实验科（陈　芳），神经外科（杨　李）【通讯作者】　赵映前，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｙｉｎｇｑｉａｎ２０００＠１６３．ｃｏｍ牛黄参含药血清对肝干细胞ＷＢ－Ｆ３４４增殖和凋亡的影响陈利锋，赵映前，李　鸣，陈　芳，杨　李 【摘要】　目的　研究牛黄参含药血清对大鼠肝干细胞ＷＢ－Ｆ３４４增殖及凋亡的影响，探讨益气解毒法诱导肝干细胞的作用机制。

方法　采用中药血清药理学方法，以不同浓度的牛黄参含药血清（５％、１０％、２０％）作用于ＷＢ－Ｆ３４４，以正常大鼠血清（５％、１０％、２０％）处理的ＷＢ－Ｆ３４４为空白对照组，以单纯培养体系处理的ＷＢ－Ｆ３４４为正常对照组；四甲基偶氮唑盐（ｍｅｔｈｙｌ　ｔｈｉａｚｏｌｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＭＴＴ）比色法检测细胞的增殖，取药物血清的最佳增殖浓度，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

结果　经牛黄参含药血清干预后，ＭＴＴ检测结果显示１０％、２０％浓度的牛黄参含药血清均能促进ＷＢ－Ｆ３４４的增殖（Ｐ＜０．０１），且１０％为增殖的最佳浓度梯度；１０％牛黄参含药血清作用的ＷＢ－Ｆ３４４细胞凋亡率与空白、正常对照组相比显著下降（Ｐ＜０．０１），且以１０％牛黄参含药血清成分组效果最佳。

结论　牛黄参含药血清可在一定程度上促进ＷＢ－Ｆ３４４细胞的增殖，抑制其凋亡，这可能是益气解毒法作用于肝干细胞的机制之一。

【关　键　词】　益气解毒法；ＷＢ－Ｆ３４４；细胞增殖；细胞凋亡【中图分类号】　Ｒ５１２．６２ 【文献标识码】　ＡＥｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＮＨＳ　ｏｎ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｒａｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｌｉｎｅ　ＷＢ－Ｆ３４４ＣＨＥＮ　Ｌｉ－ｆｅｎｇ，ＺＨＡＯ　Ｙｉｎｇ－ｑｉａｎ，ＬＩ　Ｍｉｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｆａｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｌｉ．Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄ－ｉｃｉｎｅ，Ｗｕｈａｎ　Ｈｕｂｅｉ　４３００６５，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡＯ　Ｙｉｎｇ－ｑｉａｎ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｙｉｎｇｑｉａｎ２０００＠１６３．ｃｏｍ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＮＨＳ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　ｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅ　ＷＢ－Ｆ３４４　ａｎｄ　ｄｉｓｃｕｓｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｉｑｉｊｉｅｄｕ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｕｓｉｎｇ　ｔｒａｄｉ－ｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄ，ＷＢ－Ｆ３４４　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｅｒｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎ－ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＮＨＳ（５％，１０％，２０％），ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ（５％，１０％，２０％）ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｒａｔｓ（ｂｌａｎｋ　ｃｏｎ－ｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ），ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ（ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ）．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｔｈｉａｚｏｌｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＴ）ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆｄｒｕｇ　ｓｅｒｕｍ　ｆｏｒ　ｂｅｓｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｓｅｒｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１０％ａｎｄ　２０％ＮＨＳ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＷＢ－Ｆ３４４（Ｐ＜０．０１），１０％ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ．Ｔｈｅ　ＷＢ－Ｆ３４４　ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｅｄ　ｂｙ　１０％ＮＨＳ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅ－ｃｒｅａｓｅｄ，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂｌａｎｋ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０１），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０％ＮＨＳ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｓｅｒｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＮＨＳ　ｃａｎ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆＷＢ－Ｆ３４４　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｅｘｔｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ　ｍａｙ　ｂｅ　ｏｎｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｉｑｉｊｉｅｄｕ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｙｉｑｉｊｉｅｄｕ　ｍｅｔｈｏｄ；ＷＢ－Ｆ３４４；Ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 现在全世界大约有３．５亿人感染乙型肝炎病毒、６０００万人感染丙型肝炎病毒［１］。

病毒感染导致肝病的慢性化。

由于缺乏有效清除病毒的药物和方法，在病程迁延和某些特殊因素的作用下，肝脏受损，引起重症肝炎、肝硬化、肝癌而危及生命。

近年来干细胞研究为肝脏疾病治疗提供了新的契机。

肝干细胞向肝细胞的转化应用，为药物引起的肝损伤提供了理想来源，同时也为肝移植、肝衰竭甚至肝癌治疗带来新的希望［２－９］。

课题组前期的相关研究，发现“疏肝健脾法”能够促进肝干细胞的增殖、分化，并具有抑制肝干细胞凋亡的作用［３］。

为进一步研究盖气解毒法在肝病辨证论治中的作用，课题组以肝干细胞为切入点，选用临床广泛应用的西洋参、牛黄配伍（简称牛黄参），益气养阴、清热解毒，观察其对大鼠肝干细胞系ＷＢ－Ｆ３４４增殖及凋亡的影响，探索其治疗慢性肝病的作用机理。

１　材料与方法１．１　实验动物４８只ＳＰＦ级雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体质量１８０～·６０１·华南国防医学杂志２０１２年４月２８日第２６卷第２期　Ｍｉｌ　Ｍｅｄ　Ｊ　Ｓ　Ｃｈｉｎ，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２，Ａｐｒｉｌ　２８，２０１２２００　ｇ，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号ＳＣＸＫ（鄂）２００８－０００５。

１．２　药品与试剂体外培育牛黄、西洋参、牛黄参胶囊均由武汉健民大鹏药业有限公司提供。

ＤＭＥＭ高糖液体培养基（ＨｙＣｌｏｎｅ），１０％灭活的特优级胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），无菌磷酸盐缓冲液（ｐｈａｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）（武汉博士德），青霉素、链霉素双抗（西化仪北京科技有限公司）。

胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐（ｍｅｔｈｙｌ　ｔｈｉａｚｏｌｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＭＴＴ）、二甲基亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）均为美国Ｇｉｂｃｏ公司分装。

Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ细胞凋亡试剂盒（珠海健康元生物医药有限公司），转化因子－β（美国派普泰克公司），ＥＤＴＡ（武汉洁洋盛生物科技有限公司）。

１．３　方法１．３．１　含药血清的制备　体外培育牛黄、西洋参配伍组采用传统水煎法灌胃动物制作含药血清（简称水煎组）；依据现代药理药效研究，提取西洋参、牛黄中的有效成分制成牛黄参胶囊，胶囊取粉稀释使用灌胃动物制作含药血清（简称成分组）。

水煎组与成分组互为对照组。

将大鼠分为空白组、水煎组、成分组，每组各１６只。

各组给相应的药物连续灌胃７天（１／ｄ），给药浓度为：含牛黄生药浓度３．６　ｇ／Ｌ，含西洋参生药浓度２１．６　ｇ／Ｌ，大鼠按体质量１００　ｇ灌胃１　ｍｌ剂量给药，空白组灌胃等量的生理盐水，连续一周，末次给药后２　ｈ进行大鼠颈动脉取血，将采集的血液在室温中静置４　ｈ，３０００ｒ／ｍｉｎ，离心１５　ｍｉｎ，将收集的血清在５６℃水浴３０　ｍｉｎ进行灭活，而后过滤除菌，分装成小瓶于－２０℃保存备用，需要时用培养液配制成不同浓度的含药血清。

１．３．２　细胞的培养　５０　ｍｌ的培养瓶，将ＷＢ－Ｆ３４４接种于含１０％胎牛血清、２　ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、１００　Ｕ／ｍｌ青霉素及链霉素高糖ＤＭＥＭ培养基中，细胞浓度为２×１０４／ｍｌ，置于５％ＣＯ２、３７℃的培养箱中培养。

细胞换液时间为２～３天，３～５天传代，０．２５％胰蛋白酶消化后１∶２传代。

１．３．３　ＭＴＴ法检测细胞的增殖　取对数生长期ＷＢ－Ｆ３４４细胞用胰酶消化，调密度为１×１０５／ｍｌ，按每孔１００μｌ接种９６孔细胞培养板。

于３７℃５％ＣＯ２条件下，用含１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养基培养２４　ｈ后，分别加入浓度为５％、１０％、２０％的成分组与水煎组药物血清，空白对照组加入相同浓度的正常大鼠血清，以上每种浓度设立６个平行对照孔，正常对照组则加入等量的培养液，用正常培养基培养，作用２４　ｈ，每孔再加入５　ｍｇ／ｍｌ　ＭＴＴ２５μｌ，４　ｈ后弃上清液，加入ＤＭＳＯ１２５μｌ／孔，振荡５　ｍｉｎ左右，置于酶标仪４９０　ｎｍ波长处测定吸光度（ＯＤ）值。

１．３．４　流式细胞仪检测细胞的凋亡　调整１×１０６细胞置于培养板，３７℃６　ｈ，细胞贴壁后加入４０　ｎｇ／ｍｌ浓度ＴＧＦ－β，同时分别加入１０％成分组和水煎组的牛黄参含药血清，空白对照组加入相同浓度的正常大鼠血清，正常对照组加入等量的培养液，每组设６个平行对照孔。

作用２４　ｈ后，消化收集制成单细胞悬液，用４℃预冷的ＰＢＳ液洗两次，用染色缓冲液重悬细胞密度为１×１０５／ｍｌ，每１００μｌ细胞悬液加ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ５μｌ和ＰＩ　１０μｌ混匀；室温避光孵育５～１５　ｍｉｎ；孵育结束上述体系再加入染色缓冲液４００μｌ混匀，３００目尼龙网过滤，流式细胞仪检测和分析数据。

１．３．５　统计学处理　数据采用均数±标准差（珚ｘ±ｓ）表示，用ＳＰＳＳ１３．０软件进行分析，多组均数间比较行完全随机设计的方差分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２　结果２．１　牛黄参含药血清对ＷＢ－Ｆ３４４细胞增殖的影响表１中各组ＭＴＴ检测结果表明，１０％、２０％浓度的牛黄参含药血清成分组和水煎组均能刺激ＷＢ－Ｆ３４４细胞的增殖，与空白、正常对照组相比ＯＤ值显著升高（Ｐ＜０．０１），且１０％为细胞增殖的最佳浓度梯度；各组含药血清对ＷＢ－Ｆ３４４细胞作用２４　ｈ后，镜下观察各组细胞生长良好，未表现出对细胞的毒性作用。