腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

miR-1与miR-499调控心肌细胞增殖与凋亡机制研究

miR-1与miR-499调控心肌细胞增殖与凋亡机制研究
心肌细胞增殖与凋亡在心脏疾病的发展和治疗过程中起着重要作用。

miRNAs是一类长度约21-23个核苷酸的小RNA，在心脏疾病的发生和发展中起着关键调节作用。

miR-1与miR-499是两个在心肌细胞增殖与凋亡中具有重要作用的miRNAs。

近年来，研究发现
miR-1与miR-499在心肌细胞增殖与凋亡中发挥着重要的调节作用。

本文将对miR-1与miR-499在心肌细胞增殖与凋亡机制调节中的研究进展进行综述，以期为心脏疾病的治疗提供新的策略和思路。

miR-1是一种高度保守的miRNA，其在心脏疾病中的重要作用已被证实。

研究表明，miR-1不仅在心脏发育过程中发挥重要作用，而且在心肌细胞增殖与凋亡中也起着关键作用。

miR-1通过下调其靶基因的表达来抑制心肌细胞的增殖，例如miR-1可以通过抑制基因Cyclin D1的表达来抑制心肌细胞的增殖。

miR-1还可以通过抑制Nuclear Factor Kappa B (NF-κB) 信号通路来促进心肌细胞的凋亡。

这些研究结果表明，miR-1在心肌细胞增殖与凋亡中发挥着双重作用。

miR-1可能成为治疗心脏疾病的新靶点。

最近的研究发现，miR-1与miR-499之间存在相互作用，它们可以通过相互调控来共同调节心肌细胞的增殖与凋亡。

miR-1可以通过抑制miR-499的表达来促进心肌细胞的凋亡，而miR-499可以通过抑制miR-1的表达来促进心肌细胞的增殖。

这种相互作用可能在心脏疾病的发展和治疗过程中扮演着重要角色。

腺病毒介导的HIF-1α基因对人骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞的影响

重组腺病毒Ａｄ — ＬａｃＺ、Ａｄ — ＨＩＦ — ｌｔｏ “ ¨Ａｄ — ＨＩＦ — ｌｔｏ５Ａｄ — ＨＩＦ — ｌｔｏ５４０２及Ａｄ — ＨＩＦ — ｌｔｏ５８０３分别以最佳
经
转染复数转染体外５一氮胞苷（５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ，５－ａｚａ）诱导的ｈＭＳＣｓ，于诱导培养后第６周提取细胞浆蛋白，应用酶
± ０．００４）、Ａｄ — ＨＩＦ — ｌｔｏ５６４组（０．７４１ ± ０．００８）、Ａｄ — ＨＩＦ — ｌａ５４０２组（０．７６４￣０．００９）及Ａｄ — ＨＩＦ — ｌｔｏ５８０３组（０．８０４＿．０．０２１），
【摘要】目的用。方法
研究腺病毒介导的野生型及突变型低氧诱导因子ｌｏｔ（ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ－ｌｔ，ｏＨＩＦ－ｌｔ）基因对ｅ
体外诱导环境人骨髓间充质干细胞（ｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｈＭＳＣｓ）分化成心肌细胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）中的作
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０１８０，Ｃｈｉｎａ）

哺乳动物基因工程

5
SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，
6
便发生非同源整合而致癌。
7
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40的基因组DNA
t / T基因编码病毒的小抗原和大
SV40 DNA
ori
VP2
T
VP3
VP1
t
抗原与病毒的致癌作用密切相关
SV40在裂解宿主细胞前的晚期
SV40来源的启动子控制Neor 标记基因，以G418筛选重组子。
以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。
人牛痘病毒DNA
02
03
04
05
06
01
胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建
人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，能在宿主细
人牛痘病毒的生物学特性
组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体 DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。
量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重
人牛痘病毒DNA表达载体的构建外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大
DRE
MMTP
Ap r
E.coli ori
SV40 P
Neo r
删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的
基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成
穿梭载体，它不能整合，同时也不能
形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。
安装细胞色素P450 dioxin介导的增强
子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。
盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻

腺病毒介导突变体HIF-1α基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

２０４８１：ｏ一３．００，２（）２２
［］ＤＮＲＬＯＣＡＩｅｔｎｆｅ，ｄｘｇｎｕｄｅｄｇｎｕ９ＩＡＥＬ．ｎｉ，ｖｒｏｅｏｓｏｅｏｓｆｏｅａｅｃｎｎａｎｐｒｅ，ｍｎｅｔｈｖｃａｇｄＪ．ｎｏｘｅａｈｙｇｍ＿ｅｏｃｐｅｈｎｅ［］ＪｄｔｉＲｓｒ，ｅｅｓｃｓａＥｏｎｅｃ
ｅｔｌａｅｎｆｉｇｒｅｆｙｏｅ－ｒａｅｈｒｓｎｉｖｅ－ｓｐａｒａｏｉｒｎａｔｓｏｐｒｇｎ—ｔｅｔｄｔｅｍｏｅｓｔｅｎｕ－ｉ
ｒＢｉｐｏｔｔｏｈｐｔｌｕＦｏｂｉｓＪ．ｉｉＯＳｎｒｐｃｅｒｙｏａｍｓｒｒｂｔ］Ｌｅｃｅｉａｒｈａｍａ［ｎｉｆＳ —
［］ａｒ，９８３５６９）２１２４Ｊ．Ｎｔ１９，９（９：８ — ８．ｕｅ６［］ＭＯＩＡＥＫＥＧＬＭＤ，ＡＡＳｅａ．ｎａｍｔｙｒ５ＮＣ，ＮＢＯＳＨ，ｔ１Ｉｆｍａｒｅｌｏ — ｓｎ：ａｗｙｃｓｈｌｄｂａｒｅ［］Ｎｔ，０１ｏｅｐｓｐｔａａｒｓｅｏｒｎｂｒｒＪ．ａｒ２０，ｈｏｂｏｉａｉｕｅ
ｐｏｔｇｎｉ（ＰｅｅｔｇｎｓｎＣｌｏｙｔｍｅａｒｎｒｓｌｄｎＥ）ｒｃｐｏａｏｉｓｏＯｅｂｄｅｐｒｔｅｉａａｒｔｕ
［］ＯＡＴＯＡＫＳＡＭＬ，ｔ１ｅｔｎｈＰ１８Ｋ，Ｋ，ＣＭＥＬＴＥｅａ．ＲｌｏｓｉｏＥ（ａｉｐＦ

腺病毒介导白细胞介素-10基因转染抑制血管平滑肌细胞的增殖及机制

不同感染复数（ｌｐｉｔｆｉｅｔｎｍｕｔｌｉｏｆｉ，ＭＯ）Ｉ－ｉｃｙｎｃｏＩ的Ｉ１．０重组腺病毒（ｄＩ０转染原代培养的人脐带动脉平滑肌细胞Ａ／Ｌ１）（ＵＡＭＣ）用酶联免疫吸附试验检测培养上清中Ｉ１ＨＳｓ，０的表达，唑蓝法测定吸光度值（Ｅ７噻ＯＢ０值）绘制细胞生长曲，线，式细胞术分析细胞周期、流细胞凋亡，时荧光定量聚合酶链反应检测ｐ１的表达。结果：Ｉ（时培养上清中实２ＭＯ一１姗
（ＨＵＡＳＭｓ）ｗｅｅｉ－ｉｏｃｌｒｔ１９ｍｅｉｍｎａｎｎｐｄｒｌｒｗｔａｔｒＥｒｖｔｕｔｅｗｉＭ９ｄｕｃｔｉｇｅｉｅｍａｏｈｆｃｏ（ＧＦ）ｏ０ｎ／ｎｏｃｎｒ— ｎｒｕｄｈｏｉｇｆｇｍｌｄｃｎｅｔａ４ｅ
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巾国临床压亏２００６年１第１０月３卷第５期
Ｃｉｃｌｄｃｌｏｒａｏｈｎ，０６Ｖ１３Ｎ．ｌｉｉｕｎｌｆｉ２０．ｏ．，ｏ５ｎａＭｅａＪＣａ１
ＣｌｎｔＭｅｈｎｓＷｅｌａｄＩｃａｉｍＡＮＧｈｎｙ ’ ＮＧｕｉＦＵＷｅｇｏ，ｔ１１ｓｓＳｅｇｉＹｑｉｕｅａ．．ＤｅａｔｎｆＧｎｒｐｒｍｅｔｅｅ— ｏ

ａＳｒｅｙ，ｈｉｔｆｌｔｓｉｌｆＡｈｉｄｃｌｎｖｒｉＨｅｅ２０２；．ｅａｔｅｔｌｕｇｒＴｅｒｉａｅＨｏｐｔｎｕＭｅｉｉｅｓｙ，ｆｉ３０２２ＤｐｒｎＦｓＡｆｉｄａｏａＵｔｍ

腺病毒转染细胞步骤及方法

腺病毒转染细胞步骤及方法腺病毒(Adenovirus，ADV)是一种线性双链DNA 病毒。

腺病毒不仅可以作为哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al., 1998a,b）。

迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述表明：重组腺病毒在科学研究和治疗应用领域都具有很大的潜力，同时作为基因转移工具相对于其他病毒载体有多方面的优势。

运用了去除5' ITR、包装信号和E1 序列的全新的腺病毒骨架基因，无需进行细菌体内的同源重组步骤，无需使用多蚀斑分离方法分离目的重组腺病毒的步骤，因此较其他系统生长更快，并且大大降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险；无E1a，不产生复制型腺病毒，因此更为安全。

二、腺病毒载体优势1)可感染的细胞种类多，宿主范围广，几乎可以感染所有类型的细胞；2)感染效率高，重组腺病毒被广泛应用于使用脂质体转染效率较低细胞的基因转导和蛋白表达；3)包装外源基因的片段大，高达8kb；4)腺病毒载体构建及包装容易操作，易于制备出滴度高的大量病毒；5)当腺病毒感染细胞后，病毒基因组存在于细胞染色体外，不整合到细胞染色体中，避免了因整合引起的基因突变及激活致癌基因，生物安全性高。

三、流程描述制备腺病毒颗粒的穿梭质粒及其骨架质粒，上述质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂RNAi-Mate 进行共转染293A 细胞，转3染6小时后更换为完全培养基，培养7-15 天，每3天左右补充一次新鲜培养基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融三次，4000 rpm 离心10 分钟，取上清即为病毒液初代原液。

连续三代反复扩增收集病毒后，腺病毒的大量扩增，而后对其纯化和浓缩后得到高滴度的腺病毒浓缩液，在293A 细胞中测定并标定病毒滴度。

在一定滴度范围内的腺病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。

四、具体步骤细胞培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/ml （一般稀释倍数为100 倍），在0.1 ml 的细胞悬液中加入0.1 ml 的0.4%的台盼蓝溶液。

沉默FOXO1_基因对人主动脉血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

第 50 卷第 2 期2024年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.2Mar.2024DOI：10.13481/j.1671‐587X.20240216沉默FOXO1基因对人主动脉血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响王琳茹, 张晶, 赵冬婵, 王晋军, 胡文贤（青岛大学附属青岛市海慈医院青岛市中医医院血管外科，山东青岛266000）［摘要］目的目的：探讨叉头框转录因子O1（FOXO1）基因对腹主动脉瘤（AAA）血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响，阐明其可能的作用机制。

方法方法：收集19例AAA患者动脉瘤组织（AAA组）及邻近正常主动脉组织（对照组），采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平，透射电镜观察2组研究对象动脉瘤组织中自噬溶酶体形成情况；Western blotting法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1及自噬相关蛋白卷曲螺旋肌球蛋白样B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）结合蛋白（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3 α（LC3）和P62蛋白表达水平。

体外培养人主动脉血管平滑肌细胞（hVSMCs），并采用FOXO1 siRNA（si-FOXO1）及其阴性对照（si-NC）慢病毒感染hVSMCs，10 μmol·L－1血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）联合自噬激活剂雷帕霉素（Rap）进行干预，将细胞分为空白对照组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+si-NC组、Ang Ⅱ+si-FOXO1组、Ang Ⅱ+si-NC+ Rap组和Ang Ⅱ+si-FOXO1+Rap组。

CCK-8法检测各组细胞增殖活性，流式细胞术检测各组细胞凋亡水平，ELISA法检测各组细胞上清中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）水平，RT-qPCR法检测各组细胞中FOXO1 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中FOXO1、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase-3）、Beclin1、LC3和P62蛋白表达水平。

重组腺病毒载体敲减ApoE--小鼠血管平滑肌细胞Orai1基因模型的构建

DOI：10.3969/j.issn.l007-5062.2021.03.015•基础研究•重组腺病毒载体敲减ApoE-/-小鼠血管平滑肌细胞Orai1基因模型的构建费舒扬葛长江［摘要］目的：为探讨Orai1基因在动脉粥样硬化进展中的作用，通过重组腺病毒载体建立ApoE"小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Orai1基因的敲低模型,为深入相关研究奠定基础。

方法：构建针对小鼠Orai1基因的重组腺病毒载体。

高脂饲养ApoE，小鼠至16周龄后处死。

取胸主动脉原代VSMCs改为体外培养，细胞分为三组,分别为shOrai1组、shNC组和对照组。

转染后通过实时定量聚合酶链式反应(qPCR),Western blot检测Orai1表达水平，同时对转染模型进行验证。

结果：qPCR示，重组腺病毒在ApoE"小鼠VSMCs中Orai1基因的干扰效率达57%,Western blot结果示,Ad-GFP-Orial-shRNA转染组Orai1蛋白表达水平显著降低。

结论：通过成功建立ApoE"-小鼠VSMCs中Orai1基因敲低模型，从而为阐明钙库操纵性钙通道在动脉粥样硬化进程中的作用，尤其关于斑块延展和不稳定的相关性研究奠定了基础。

［关键词］Orai1基因；动脉粥样硬化;核糖核酸干扰;血管平滑肌细胞［中图分类号］R54［文献标志码］A［文章编号］1007-5062(2021)03-281-06Establishment of Orail gene knock down model in ApoE""mouse vascular smooth mucsle cells with adenovirus interference vector FEI Shuyang,GE Changjiang Department of Cardiology,Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University,Beijing Institute of Heart,Lung and Blood Vessel Diseases,Beijing100029,China［Abstract］Objective:To further investigate the role of calcium release-activated calcium channelmodulator1(Orai1)in the process of Atherosclerosis,the recombinant adenovirus vector was used to establishthe ApoE--mouse vascular smooth mucsle cells(VSMCs)Orai1gene knock down model for further relatedstudies.Methods:A recombinant adenovirus vector(Ad-GFP-Orial-shRNA)targeting the Orai1gene in micewas constructed.ApoE--mouse fed with high-fat diet were sacrificed at16weeks of age.VSMCs extracted fromthe thoracic aorta were cultured in vitro.The cells were randomly divided into3groups for Ad-GFP-Orial-shRNA infection,Ad-GFP-NC-shRNA infection and control group.Orai1expression was tested by qPCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)and Western blot to validated the model.Results：qPCRshowed that the Orai1mRNA in VSMCs decreased by57%,Western blot showed that Orai1protein expressionlevel was significantly reduced.Conclusions:The ApoE--mouse VSMCs Orai1gene knock down model wassuccessfully established,building a foundation to further study the mechanism of SOCC participate in theprocess of atherosclerosis and its impact on plaques'extension and instability.［Keywords］Orai1；RNA intereference；Atherosclerosis；Vascular smooth mucsle cells钙库操纵性钙通道(stored operated calcium内流的重要离子通道，参与调节血管平滑肌细胞channel,SOCC)是非兴奋细胞所介导胞质外钙离子(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖、迁移基金项目：2020年北京自然科学基金（7202039）作者单位：100029首都医科大学2018级临床心血管专业硕士研究生（费舒扬）；首都医科大学附属北京安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所心内科（葛长江）通信作者：葛长江,教授,研究生导师，博士，研究方向：冠心病的药物和介入治疗。

腺病毒介导的转自杀基因抑制移植静脉内膜增生的实验探究

腺病毒介导的转自杀基因抑制移植静脉内膜增生的实验研究中文摘要目的动脉粥样硬化常导致心血管和肢体血管狭窄或闭塞，有较高的致死、致残率，严重威胁患者的健康。

自体静脉移植，重建动脉循环通路，是经典的治疗手段，可以有效地减轻症状、延长生命。

但是静脉移植物在术后易形成新生内膜，使其在术后１０年约有４０％“０％发生狭窄和堵塞。

提高移植静脉术后通畅率成为血管外科亟待解决的问题。

目前研究表明，移植静脉狭窄的主要原因是移植静脉内膜增生，内膜增生是血管平滑肌细胞增生迁移的结果。

抑制平滑肌细胞增生成为防治移植静脉狭窄的焦点。

药物治疗移植静脉狭窄很不理想，往往因为系统给药毒副作用大而在临床上受到限制。

现在随着基因技术的发展，基因治疗成为解决这一难题的希望。

自杀基因系统最早应用在肿瘤的治疗中，取得了较好的效果。

在动脉损伤再狭窄的研究中，转染自杀基因ＴＫ可显著地抑制平滑肌细胞增生，减轻新生内膜造成的血管腔狭窄，但纵观文献，自杀基因的在静脉系统中的作用如何，尚未见报导。

针对细胞增生为特点的病理改变，本实验拟采用自杀基因系统抑制移植静脉内膜增生。

方法本实验采用大隐静脉培养和大鼠静脉移植作为实验模型，模拟内膜增生病理变化。

实验中首先应用腺病毒载体携带标记基因ＬａｃＺ，研究大隐静脉和大鼠移植静脉中转基因的效率、靶细胞和表达时效。

然后以ＴＫ基因为治疗基因，以腺病毒为载体转染人及大鼠的静脉，在培养液或大鼠体内注人丙氧鸟苷，观察静脉内膜是否受到显著的抑制。

体外转基因：将静脉剖开，内膜暴露，自然浸入病毒载体溶液中。

然后将静脉横断成０．５ｃｍ的片断，随机分到各组，将静脉片置于培养皿中培养，隔日换培养液，培养至取材。

为提高中膜平滑肌细胞的转染率，本实验探讨了机械牵拉、静脉腔内灌注转基因的方法。

在体转基因：Ｗｉｓｔｅｒ大鼠经腹腔麻醉后，取颈部中线切ｉ］，暴露颈静脉及其分枝。

用显微血管夹钳夹颈静脉的两端，微量注射器从静脉侧枝的横断切口插入。

静脉管腔用ＲＰＭｌｌ６４０的肝素水轻轻冲洗去残留血。

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 6.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactop yranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

METTL3通过mRNA_m6A甲基化促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移及分泌炎症因子

网络出版时间：２０２４－０４－１２１３：５３：２６　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０６５．Ｒ．２０２４０４１０．１００９．０１０ＭＥＴＴＬ３通过ｍＲＮＡｍ６Ａ甲基化促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移及分泌炎症因子李　娟，蒋扬青，沈瑞明，李国铨，王　敏，徐逢皇２０２４－０３－０１接收基金项目：海南省自然科学基金青年基金项目（编号：８２０ＱＮ４００）作者单位：海南医学院第一附属医院风湿免疫科，海口　５７０１０２作者简介：李　娟，女，博士，副主任医师，责任作者，Ｅｍａｉｌ：ｃｙｈａｎ８７＠１６３．ｃｏｍ摘要　目的　探讨甲基转移酶样３（ＭＥＴＴＬ３）对类风湿关节炎（ＲＡ）滑膜成纤维细胞增殖、迁移及分泌炎症因子的作用及机制。

方法　本研究纳入类风湿关节炎及骨关节炎患者各２５例，留取滑膜组织，分别用ＲＴｑＰＣＲ及免疫组化法检测ＭＥＴＴＬ３表达水平，ＥＬＩＳＡ检测ＲＮＡｍ６Ａ浓度；分离培养ＲＡ滑膜成纤维细胞，分为ＮＣ组、ｈｉＭＥＴＴＬ３（过表达ＭＥＴＴＬ３）组、ｓｉＭＥＴＴＬ３（敲低ＭＥＴＴＬ３）组、ＳＴＭ２４５７（ＭＥＴＴＬ３抑制剂）干预组，用ＣＣＫ８法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡、ＥＬＩＳＡ检测细胞培养上清液白介素６（ＩＬ６）、白介素１７Ａ（ＩＬ１７Ａ）、肿瘤坏死因子 κＢ活化受体配体（ＲＡＮＫＬ）、骨保护素（ＯＰＧ）的浓度。

结果　与骨关节炎滑膜组织相比，ＲＡ滑膜组织ＲＮＡｍ６Ａ表达显著增高（Ｐ＜００５），ＭＥＴＴＬ３的表达显著增高（Ｐ＜００５）。

过表达ＭＥＴＴＬ３后，滑膜成纤维细胞ｍ６Ａ表达增加，细胞增殖、迁移能力显著提高，凋亡无明显变化，分泌细胞因子ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ显著增加，ＯＰＧ显著减少（Ｐ＜００５）。

干扰ＭＥＴＴＬ３表达后，滑膜成纤维细胞ｍ６Ａ表达减少，细胞增殖、迁移显著减低，分泌细胞因子ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ显著降低，ＯＰＧ显著增高（Ｐ＜００５）；使用ＭＥＴＴＬ３抑制剂ＳＴＭ２４５７干预后，滑膜成纤维细胞增殖、迁移显著减低，分泌细胞因子ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ显著降低，ＯＰＧ显著增高（Ｐ＜００５）；各组表达ＩＬ１７Ａ无显著差异。

腺病毒介导p27基因转染对离体血管平滑肌细胞增殖的影响

ＡｂｔａｔＯｂｅｔｖＴｏｉｖｓｉａｅｔｅｅｆｃｆｔａｓｅｉｇａｄｅｐｅｓｏｆｐ７ｇｎｎｃｌｕｅａｃｌｒｓｏｈｍｕｃｅｓｒｃ：ｊｃｉｅｎｅｔｔｈｆｅｔｏｒｎｆｒｎｎｘｒｓｉｎｏ２ｅｅｏｕｔｒｄｖｓｕａｍｏｔｓｌｇ
Ｅｆｅｔｏｈｒｎｓｅｎｄｅｐｒｓｉｎｏ７ｇｎｅｏｎｔｏｌｆｒｔｏｎｏａａｃｌｒｆｃｆｔｅｔａｆｒａｘｅｓｏｆｐ２ｅｈｅｐｒｉｅａｉｆｒｔｖｓｕａ
ｓｏｈｍｕｃｅｃｌｓｍｅａｅｙｒｃｍｏｔｓｌｅｌｄｉｔｄｂｅｏｍｂｎｎｔａｅｏｒｓｖｃｏｉａｄｎｖｉｕｅｔｒ
刺激引起的Ｇ。Ｇｌ期细胞减少和。Ｔｄ掺入量的增加（～Ｈ— ＲＰ＜００）；．５可抑制ＰＤＧＦ— Ｂ刺激引起的ＣＤＫ２、ＢＰＣＮＡ和Ｃｘ３蛋白４
表达阳性率的升高（Ｐ＜００）并使ｐ７蛋白表达阳性率由ＰＧ－Ｂ刺激后的４２％上升至３．１（．５；２ＤＦＢ．３３９Ｐ＜００）．１。结论
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重庆医学２０年２月第３０８７卷第４期
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论
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腺病毒介导ｐ７基因转染对离体血管平滑肌细胞增殖的影响２
冉擘力，国祥，何王耿，治远，茂琴宋舒（三军医大学西南医院心内科，庆４０３）第重００８

腺相关病毒介导基因组来源的基因转移与整合

early chick embryo s and esti matio n of t heir c o n t ent . 1971 , 27 ( 7) : 817～819Experientia , D i stribut i on of F ert i l i zed E ggs. D NA an d RNA in the Yol k of L E I Hai 2Xin , YU L e i , SU N Li 2 3Bruce L , Emanuelsso n H. Analysis of DNA isolat ed f ro m int rocellular yol k granul es in t he early chick bl asto der m. Exp Cell Res , 1975 , 92 ( 2) : 462～466 李玉安 , 李莱 , 潘宗耀等. 鸡胚细胞核和胚下卵黄颗粒染色质的电子显微镜观察. 中国科学 B 辑 , 1982 , ( 11 ) : 1007 ～1010Li Y A , Li L , Pan Z Y , et al . Science in China B , 1982 , ( 11) :1007～1010李玉安 , 李莱 , 潘宗耀等. 鸡胚细胞核和胚下卵黄颗粒 DNA 分子的电子显微镜观察. 中国科学 B 辑 , 1982 , ( 12 ) : 1089～1091Li Y A , Li L , Pan Z Y , et al . Science in China B , 1982 , ( 12) : 1089～1091Sun L J , Y u L , Chen C C. Presence , isolatio n and charact eriza 2 tio n of yol k DNA f ro m chi cken eggs. Science in China ( Series C ) , 1998 , 41 ( 3) : 251～257L abarca C , Paigen K. A s i mple , rapid , and sensitive DNA assay p rocedure . 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Prog Biochem Biop hys , 1997 , 24 ( 1) : 82～85J un , CH EN Chu 2Chu ( I ns t i t u t e of B i op h ysics , T h e Chi n ese A ca de m y of S c iences , B ei j i n g 100101 , China ) .Abstract By t he investigati o n o n different regi o ns oft he yolk of fertilized eggs , it was discovered t hatDNA and RNA were widely dist ributed in t he yolk .DNA and RNA in t he yolk were quanti fied by t hemet ho d of f luo rescence spect rop hoto met ry wit h t h e reagent s Hooechst 33258 and Ribo G reen respectively.The result s indicated t h at DNA was unifo r mly dist r ibuted in t h e w h ole yolk (abo u t 6517μg/ L ) andit was m o st p ro bably t hat t he DNA was co ntained int he yolk granules ; w hile t he dist ributi o n of RNA in t he yolk showed anot her pat ter n : t he a m o unt of RNAin t h e superficial yolk beneat h blasto d er m was abo u t 0143 mg/ L , w h ich was much less t h an t h at of lateralyolk ( 2187 mg/ L ) and vegetative pole ( 3163 mg/L ) . The signi ficance of t he e xistance of yolk DNA and t he unique dist ributi o n of yolk RNA re mains tobe elabo r ated.K ey w ords fertilized egg , yolk , DNA dist r ibuti o n , Ribo Green4567 8910 腺相关病毒介导基因组来源的基因转移与整合 3李斌刘德培1) 王晶董文吉郭志晨夏薇梁植权(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所 , 医学分子生物学国家重点实验室 , 北京 100005)摘要构建一个带β2珠蛋白基因组序列的腺相关病毒载体 AV53 H S2Δβ2Neo . 经包装成重组腺相关病毒后 , 转导红系细胞 . DNA 印迹证实包含红系增强子、β2珠蛋白基因和筛选标志基因的前病毒基因组完整整合于红系细胞基因组中 . 结果说明腺相关病毒载体能介导基因组序列来源的目的基因稳定整合于受体细胞基因组中 . 关键词腺相关病毒载体 , 基因组 , 目的基因 , 基因转移 , 整合学科分类号 Q785腺相关病毒 ( a deno 2associated virus , AAV ) 载体是新近发展的基因转移载体 , AA V 属细小 DNA 病毒 , 基因组全长 4 700 bp . 构建 AAV 载体时 , 以外源基因的表达序列盒代替 AAV 的编码序列( rep / cap 基因) , 只保留其基因组两端长 145 bp 负责病毒获救、复制、包装与整合的顺式元件 ———倒转重复序列 ( I T R ) . 当 AA V 载体与携带 AA V 编码序列 ( rep / cap ) 的辅助质粒共转染辅助病毒(腺病毒) 感染的 293 细胞时 , 即能获救、复制并3 863 计划项目资助.1)通讯联系人.Tel : ( 010) 65296415 , E 2mail : liudp @p ublic . east . cn . net收稿日期 : 1999202205 , 修回日期 : 1999208216包装成重组AA V 病毒颗粒1 . AA V 感染谱宽且能感染并稳定整合于非分裂细胞基因组中. 某些基因治疗的目的基因在受体细胞中呈组织特异性的有效表达需要内含子及近端顺式元件的参与, 因此, 采用基因组来源的DNA 序列作目的基因. 但在反转录病毒载体中经常发生缺失, 影响其整合稳定性和表达水平. 为了建立能介导这一类型的目的基因稳定整合于受体细胞基因组的基因转移方法, 我们以AAV 为载体, 以β2珠蛋白基因为靶基因, 新霉素抗性基因( N eo )为筛选标志, 构建了AA V 重于24 孔或96 孔板中, 10～14 d 后, 将抗性克隆分离后单克隆扩增, 或合并后扩增.11214 细胞基因组DNA 提取与DNA 印迹: 均按Sa mbroo k方法进行.结果2211 β2珠蛋白基因腺相关病毒载体构建与包装为适应AAV 载体容量, 先删除了对表达没有影响的β2珠蛋白基因部分第二内含子部分序列及3′增强子序列, 获得210 kbβ2珠蛋白基因Δβ2 . Δβ2( M EL ), 组体. 经病毒转导红系细胞整合状态.分析了它的基因5′端与341 bp 红系增强子片段HS2 相连, 3′端与新霉素抗性基因( N eo )相连, 插入AA V 载体pAV53 得到重组体AV53 HS2Δβ2Neo . 红系增强子HS2 片段使β2珠蛋白基因呈红系组织特异性表达, 载体中I TR 保证AA V 载体获救、复制、包装成重组AAV 病毒(图1 和图2) . 瞬时包装得到重组病毒滴度为104～105 CFU / ml .材料与方法1111 主要材料AAV 载体( p AV53 ) 与辅助质粒( p AAV/ A d) 由美国南卡大学董剑云博士赠送. 其他质粒、探针、宿主菌和细胞由本室提供.限制性内切酶、修饰酶、T4 连接酶购自Pro mega 公司, DM EM 培养基购自GIBCO 公司, 放射性核素(α232 PdC T P)购自亚辉公司.112 主要方法11211 β2珠蛋白基因腺相关病毒载体构建DNA 酶切、回收、连接、转化均按Sa mbroo k 等的方法进行2 .11212 病毒重组体包装与病毒滴度测定接种于10 cm 培养皿的293 细胞长至80 %融合(co n fluence) 后, 于转染前4 h , 用感染指数为10 的腺病毒(A d5) 感染293 细胞. 取10 μg AA V 载体和10 μg pAAV/ A d 辅助质粒经磷酸钙共沉淀转染293 细胞. 8 h 后, 换新鲜DM EM 培养液. 培养40 h 后, 收获细胞. 经反复3 次冻融, 56 ℃灭活A d5 病毒30 min .离心取出上清, 分装, - 20 ℃保存.病毒原液按1 ∶10 稀释接种于5 ×105 HeL a细胞.感染过夜后, 1 ∶10 传细胞. 24 h 后, 加入含500 mg/ L G418 的DM EM 培养液, 筛选10～14 d 后, 计数抗性克隆, 按公式: 滴度/ CFU ·ml- 1 = G418 抗性克隆数×病毒稀释倍数×细胞传代倍数, 算出重组AAV 病毒滴度.11213 重组病毒转导M EL 细胞取含1 ×104 CFU / ml 的重组病毒500μl 与2 ×105 M EL 细胞共培养24 h , 洗涤后, 用含1 g/ L G418 的DM EM 培养液悬浮, 按每孔2 ×103 接种图1 腺相关病毒重组体AV53 H S2Δβ2 N eo 与辅助载体pAAV/ Ad 示意图图2 AV53 H S2Δβ2 N eo 重组体的酶切图谱1 : 分子质量标记λ/ Bst E Ⅱ;2 : X b a Ⅰ酶切;3 : Eco R Ⅰ酶切; 4 : B a m H Ⅰ酶切; 5 : X h o Ⅰ酶切.212 β2珠蛋白基因病毒重组体在M E L 细胞中整合用DNA 印迹检测A V53 HS2Δβ2Neo 的整合状态.首先, 用X h o Ⅰ酶切病毒转导细胞基因组DNA , 以Δβ2 基因的第二内含子作探针进行杂交.检测到214 kb 长与相同酶切的质粒对照一致的杂交带, 说明HS2 和Δβ2 片段已完整整合于M EL 细胞. 用B a m H Ⅰ酶切, 以HS2 和Δβ2 的第二内含子序列作探针进行杂交, 结果显示: 转导细胞出现两条长分别为215 kb 和110 kb 的杂交带, 与质粒对照一致. 进一步证实经AAV 病毒转导, 包含红系增强子、β2珠蛋白基因及筛选标志基因已经稳定转移至M EL 细胞( 图1 , 图3 和图4) . 为确定重组病毒已整合于M EL 细胞的基因组中, 用重组病毒基因组中存在单个酶切位点的内切酶X ba Ⅰ酶切不同的病毒转导细胞克隆的基因组DNA , 以Δβ2的第二内含子序列作探针, 进行DNA 印迹实验.理论上, 被检测的X ba Ⅰ单酶切的重组病毒DNA片段若完整合于细胞基因组的不同位点上时,DNA 杂交带长度不应小于314 kb ( 图1) . 我们的结果发现四个病毒转导细胞克隆出现长度不同但均大于314 kb 的杂交带, 证实A V53 HS2Δβ2Ne o 病毒重组体经病毒转导已稳定整合于靶细胞中( 图1和图5) .图5 AV53 H S2Δβ2 N eo 重组体整合的D NA 印迹分析1 : E co R Ⅰ酶切的人基因组DNA ;2 : X b a Ⅰ酶切的M E LX b a Ⅰ酶切的AV53 H S2Δβ2Neo细胞基因组DNA ; 3～6 :# #整合的1 ～4 M E L 细胞克隆的基因组DNA.讨论3一些基因治疗的靶基因呈组织特异性的高水平表达需要内含子及近端序列的参与, 如β2珠蛋白基因等. β2珠蛋白基因组序列带有隐含的拼接信号和转录中止信号, 插入反转录病毒载体后, 严重干扰RV 生命周期, 导致重组RV 病毒产生缺失、重排3. 而AA V 载体由于其生命周期在DNA 水平上完成, β2珠蛋白基因插入, 不会出现象在RV 载体上那样由于病毒RNA 错误拼接、转录中止而产生的缺失、重排. 我们的结果证实了经AAV 病毒转导后, β2珠蛋白基因能稳定整合于红系细胞中并表达出一定水平β2珠蛋白mRNA .同时, 构建的反转录病毒载体却在部分转导细胞中发生了缺失重排, 整合完整率仅为6617 % ( 数据未显示) . 因此, 对于易在RV 载体中缺失的基因组来源的目的基因, AA V 载体为其稳定转移提供了一个较好的基因转移系统. 已有实验结果证实AA V 载体介导多种目的基因在体内多种组织中长期稳定表达达到治疗水平的基因产物, 展示了良好的应用前景4 .参考文献图3 AV53 H S2Δβ2 N eo 重组体整合的D NA 印迹分析1 : B a m H Ⅰ/ X b a Ⅰ酶切的人基因组DNA ;2 : B a m H Ⅰ酶切的AV 5 3 HS 2Δβ2 Neo 质粒; 3 : B a m H Ⅰ酶切的AV53 H S2Δβ2Neo 整合的细胞基因组DNA.1 Muzyczka N . U se of adeno2associat ed virus as a general t ransduc2tio n vecto r f o r mammalian cells. Curr Top Micro b iol Immunol ,1992 , 158 ( 1) : 97～129Sambroo k J , Frit sch E F , Maniatis T. Molecular Clo ning : AL abo rato ry Manual . 2nd. New Y o r k : Cold Sp ring Harbo rL abo rato ry Press , 1989 . 474～489L e bo ulch P , Huang G M , Hump hries R K , et al . Mut agenesis ofret r oviral vecto rs t ransducing humanβ2 glo bin gene andβ2 glo bin 图4 AV53 H S2Δβ2 N eo 重组体整合的D NA 印迹分析1 : B a m H Ⅰ/ X b a Ⅰ酶切的人基因组DNA ;2 : X h o Ⅰ酶切的AV 5 3 HS 2 Δβ 2 Neo 质粒3 ; 3 : X h o Ⅰ酶切的AV53 H S2Δβ2Neo 整合的细胞基因组DNA.23locus c o nt rol regio n derivatives result s in st able t ransmissio n of an active t ranscriptio nal st ruct ure .EMBO J , 1994 , 13 ( 13 ) : 3065 ～30764 Nakai H , H erz og R W , H agst ro m J N , et al . Adeno2associat edviral vecto r2mediat ed gene t r ansfer of human bloo d c oagul atio n facto r Ⅸinto mo use liver . Bloo d , 1998 , 91 ( 12) : 4600～4607 M e dical S c ience s & Peki n g U n ion M e dical Col l ege , B e i j i n g100005 , China) .Abstract A n adeno2associated viral vecto r co ntaining eryt h roid enhancer ( HS2 ), geno m ic β2gl o b in gene and neo mycin resistance gene was co nst ructed , t hen packaged into reco mbinant AA V viri o ns. So ut her n analyses showed t hat reco mbinant p rovirus geno me steadily integrated into eryt hroid cells via virus t rans2 ducti o n. It was suggested t hat an adeno2associated virus co uld mediate stable integrati o n of geno mic gene of interest in ma mmalian cells.K ey w ords adeno2associated virus vecto r , geno m e , gene of interest , gene t r ansfer , integrat i o nSta ble I ntegrat i on of G enomic G ene of I nterest inMa mm al i an Cell s F ollo wing Ad eno2a s soc i ated VirusV ector Mediated G ene T ransf e r. L I Bin , L IU De2Pei , WAN G J ing , DON G Wen2J i , GU O Zhi2Chen ,Chich2Chuan N at i on al(XIA Wei , L IAN GL aborat ory of M e dical M olecul a r B iol o gy , I nst i t u teo f B asic M e dical S c iences , Chi n ese A ca de m y of细菌32脱氧葡糖醛酮代谢酶的纯化及性质研究3梁智群粟桂娇李湘萍莫柏立梁静娟( 广西大学工业测试实验中心, 南宁530004)摘要细菌B a cil l u s sp12 粗酶液通过( N H4 ) 2 S O4 分级分离、Q S ep h aro se F F、Sep h adex G2100 ( Ⅰ) 、Hydro x yap atit e 和S ep h adex G2100 ( Ⅱ) 柱层析分离, 纯化了一种以NAD P H为辅酶的32脱氧葡糖醛酮(32D G) 代谢酶, 定性为22羰基醛还原酶.纯化酶的比活力为63175 U/ mg , 在S DS2聚丙烯酰胺凝胶上显示一条蛋白质带.该酶分子质量约为32 ku , 酶反应最适p H 约为612 , 在p H 5 ～8 , 温度25 ～30 ℃之间酶保持稳定; 该酶对32D G 的K m 为213 mmol/ L .添加适量的ED T A 、巯基乙醇或二硫苏糖醇能明显提高酶的活性; 而碘乙酸、N2乙基顺丁烯二酰亚胺抑制酶的活性.关键词美拉德反应, 32脱氧葡糖醛酮, 细菌, 还原酶, 纯化, 性质学科分类号Q5541232脱氧葡糖醛酮( 简称32D G) 是美拉德反应的主要中间产物之一, 其代谢酶中的22羰基醛还原酶已被证实在体外能抑制美拉德反应的高级阶品, 考马斯亮蓝R2250 为Fluka 进口分装产品, A rc 、Bis 、SDS 、( N H4 ) 2 SO3 为华美公司进口分装产品, 低分子质量标准蛋白为上海丽珠东风生物技术有限公司产品, 牛血清白蛋白(电泳单点纯) 为上海长阳生化制药厂产品.其余均为国产分析纯试剂.L C210A T 液相层析系统为岛津公司产品.112 方法11211 酶活力测定: 酶活力测定参考文献 3 . 1活力单位( U )定义为此测定条件下每分钟减少1 μm ol NAD P H所需的酶量.11212 蛋白质测定: 用280 nm 下的吸光值跟踪柱层析流出的蛋白质峰.蛋白质的浓度参考Low r y段1. 国外已有报道, 动植物体内存在抑制美拉德反应的代谢酶, Kato 等1 ～3 在猪肝、鸡肝和欧芹中找到了对32D G 具有还原作用的酶, 但在微生物方面, 国内外均未见报道. 我们已从细菌中筛选到对32D G 有强还原活性的菌株B aci l l u s sp12 4 , 现进一步把其中主要的32D G 代谢酶分离纯化出来, 鉴定其生化特性.1材料和方法111 材料菌株B aci l l u s sp12 由本课题组筛选而得.法5测定, 以牛血清白蛋白为标准制作标准曲线.32 11213 分子质量的测定: 采用电泳法和分子筛两种方法进行测定. SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳参考D G 按日本Kato 等的方法制备.NAD P H 为Sigma公司产品, Q Sep h aro s e F F为Phara macia 原装柱, Sep h adex G2100 为Pharamacia 产品, Hydro xy2 apatite 为B I O2RA D 产品, T EM ED 为S ERVA产3 国家自然科学基金( 29466012) 和广西科学基金资助项目. Tel : ( 0771) 3233258 , E2mail : xiangp @gxu. edu. cn收稿日期: 1999202205 , 修回日期: 1999208216。

腺相关病毒不同转染策略应用于心脏光遗传学的研究

心血管病学进展２０２３年１２月第４４卷第１２期　ＡｄｖＣａｒｄｉｏｖａｓｃＤｉｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２３，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１２腺相关病毒不同转染策略应用于心脏光遗传学的研究樊哲儒１　王龙１　王２　周芳１（１．武汉大学人民医院麻醉科，湖北武汉４３００６０；２．武汉大学人民医院心内科武汉大学心血管病研究所心血管病湖北省重点实验室，湖北武汉４３００６０）【摘要】目的　探究腺相关病毒不同转染策略构建大鼠心脏光遗传学模型的可行性与有效性。

方法　２０只ＳＤ大鼠，随机分为４组：心肌注射组、心包注射组、心外膜滴涂组、正常对照组，每组５只，分别心肌注射、心包注射、心外膜滴涂ｒＡＡＶ９ＣＡＧｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）ｅＹＦＰ，正常对照组只开胸。

造模４周后，超声测量４组大鼠左室射血分数及左室短轴缩短率；记录体表心电图，测量ＲＲ间期、ＰＲ间期和ＱＲＳ时限。

开胸进行４７３ｎｍ波长蓝光照明实验，根据光输出信号与心电图判断心脏节律是否被光脉冲夺获。

对心脏组织石蜡切片进行ＨＥ染色和荧光观察。

结果　心肌注射组、心包注射组、心外膜滴涂组大鼠与正常对照组大鼠相比，心电参数无显著差异（Ｐ＞０．０５），左室射血分数及左室短轴缩短率无显著差异（Ｐ＞０．０５）。

用一定频率和功率的４７３ｎｍ蓝光照射心肌注射部位或心脏，能夺获心肌注射组和心包注射组心脏的节律，但不能夺获心外膜滴涂组。

ＨＥ染色显示心肌注射组注射部位心肌纤维排列紊乱、炎症细胞浸润。

荧光显示心肌注射组、心包注射组、心包滴涂组心室切片均有ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）转染。

结论　心包注射途径能有效构建大鼠心脏光遗传学模型。

【关键词】光遗传学；腺相关病毒；光敏蛋白质；光起搏；心包注射【ＤＯＩ】１０１６８０６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ．１００４３９３４２０２３１２０２０ＤｉｆｆｅｒｅｎｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｏｆＡｄｅｎｏＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＡｐｐｌｉｅｄｔｏＣａｒｄｉａｃＯｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓＦＡＮＺｈｅｒｕ１，ＷＡＮＧＬｏｎｇ１，ＷＡＮＧＸｉ２，ＺＨＯＵＦａｎｇ１（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，ＲｅｎｍｉｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００６０，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＲｅｎｍｉｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨｕｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００６０，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｏｆａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｒａｔｃａｒｄｉａｃｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｍｏｄｅｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｔｏｔａｌｏｆ２０ＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｐｕｒｃｈａｓｅｄａｎｄｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓ：ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，ｅｐｉｃａｒｄｉａｌｄｒｉｐｃｏａｔｉｎｇｇｒｏｕｐａｎｄｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒａｔｓ（ｎ＝５）ｗｅｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈｒＡＡＶ９ＣＡＧｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）ｅＹＦＰｂｙｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｐｉｃａｒｄｉａｌｄｒｉｐｃｏａｔｉｎｇｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＡｆｔｅｒＦｏｕｒｗｅｅｋｓ，ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｅｊｅｃｔｉｏｎｆｒａｃｔｉｏｎｓ（ＬＶＥＦ）ａｎｄｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｆｒａｃｔｉｏｎａｌｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ（ＬＶＦＳ）ｏｆａｌｌｒａｔｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ；ｒｅｃｏｒｄｔｈｅｂｏｄｙｓｕｒｆａｃｅＥＣＧｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅＲＲｉｎｔｅｒｖａｌ，ＰＲｉｎｔｅｒｖａｌａｎｄＱＲＳｗａｖｅｔｉｍｅｆｒａｍｅ．Ｏｐｅｎｃｈｅｓｔｌｉｇｈｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈ４７３ｎｍｂｌｕｅｌｉｇｈｔｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｈｅａｒｔｒｈｙｔｈｍｗａｓｃａｐｔｕｒｅｄｂｙｔｈｅｌｉｇｈｔｐｕｌｓｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｌｉｇｈｔｏｕｔｐｕｔｓｉｇｎａｌａｎｄｔｈｅｂｏｄｙｓｕｒｆａｃｅＥＣＧ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｒａｔｓｉｎｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐａｎｄｅｐｉｃａｒｄｉａｌｄｒｉｐｃｏａｔｉｎｇｇｒｏｕｐ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒａｔｓｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎＥＣＧｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｐ＞０．０５）ａｎｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎＬＶＥＦａｎｄＬＶＦＳ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅｒｈｙｔｈｍｏｆｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐｓｃｏｕｌｄｂｅｃａｐｔｕｒｅｄｂｙｉｒｒａｄｉａｔｉｎｇｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｉｔｅｏｒｈｅａｒｔｗｉｔｈ４７３ｎｍｂｌｕｅｌｉｇｈｔｏｆｃｅｒｔａｉｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙａｎｄｐｏｗｅｒ，ｂｕｔｎｏｔｔｈｅｅｐｉｃａｒｄｉａｌｄｒｉｐｃｏａｔｉｎｇｇｒｏｕｐ．ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｆｉｂｅｒａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｔｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｉｔｅｉｎｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ．ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｈｏｗｅｄＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｉｎｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，ａｎｄｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｄｒｉｐｃｏａｔｉｎｇｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｃａｒｄｉａｃｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓｍｏｄｅｌ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ；Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ；Ｏｐｔｉｃａｌｐａｃｉｎｇ；Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ基金项目：国家自然科学基金面上项目（８１７７２０４４）；湖北省重点实验室开放项目（２０２１ＫＦＹ０３５）通信作者：王龙，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｌｏｎｇｗｈｕ＠１６３．ｃｏｍ光遗传学是利用遗传技术，将光敏感元件导入细胞或组织，与光学技术结合［１］，对生物特定功能进行研究。

人类腺病毒分子生物学研究进展及病毒治疗

人类腺病毒分子生物学研究进展及病毒治疗人类腺病毒是一种常见的呼吸系统病毒，它可以引起婴儿和幼儿的上呼吸道感染。

尽管腺病毒感染通常不会导致严重的健康问题，但仍然有一些人会出现严重症状，例如肺炎、支气管炎等。

为了防止儿童患上腺病毒感染，人们经常会接种腺病毒疫苗。

然而，由于该病毒有多种变异株，目前的疫苗并不能涵盖所有的变异株。

因此，对人类腺病毒分子生物学的研究至关重要，这将帮助科学家更好地理解该病毒的特性，从而开发更有效的治疗方法。

一、人类腺病毒的分子生物学研究进展人类腺病毒属于腺病毒科，是一种非常小的病毒，其大小大约为20-30纳米。

尽管它的尺寸很小，但该病毒的体内基因组却非常大，其基因组长约30kb。

根据研究，人类腺病毒的基因组中含有31个基因，其中28个是编码蛋白质的基因，剩下的3个则是非编码RNA基因。

在分子生物学研究中，科学家发现，人类腺病毒的核心部分由四种结构蛋白组成，这四种蛋白分别是：VP1、VP2、VP3和VP4。

其中，VP1、VP2和VP3蛋白对于病毒的抗原性非常重要，病毒的一些变异也是由于这三种蛋白的突变引起的。

此外，人类腺病毒的分子生物学研究还揭示了该病毒的复制机制。

具体来说，人类腺病毒需要依赖于细胞内的一些分子才能够进行复制。

首先，它必须将其基因组导入宿主细胞内，使其与细胞核融合。

然后，病毒基因组中的mRNA会通过转录和翻译被转化为蛋白质。

最终，这些蛋白质会合成新的病毒颗粒，进而释放入细胞外界。

二、病毒治疗的发展除了研究人类腺病毒的分子生物学特性外，科学家还在尝试开发针对该病毒的病毒治疗方法。

病毒治疗是一种利用病毒技术来治疗疾病的方法，与传统的药物治疗相比，它具有更准确的作用、更低的毒副作用等优点。

下面将介绍一些目前正在研究的腺病毒病毒治疗方法。

1.利用基因工程技术改良病毒近年来，随着基因工程技术的发展，科学家开始研究利用该技术来改造人类腺病毒的基因组，以使其成为更为安全和有效的病毒疫苗。

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM 操作手册目录第一章简介 1 3.2AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 3第二章应用重组腺病毒的长处 2 第四章主要流程 4第三章 AdEasyTM 技术 3 4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 43.1 技术概略 3缩写英文全称中文全称AdAdenovirus 腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB 培育基Ad5Adenovirusserotype5 血清 5 型腺病毒MCSMultipleCloningSite 多克隆位点AdVAdenoviralVector 腺病毒载体MinMinute 分钟AmpAmpicillin 氨苄青霉素MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) 感染复数β-Gal β-Galactosidase - 半β乳糖苷酶mRNAMessengerRNA 信使 RNAbpBasePair 碱基对MWCOMOIecularWeightCut-offBSABovineSerumAlbumin 小牛血清白蛋白PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis 聚丙烯凝胶电泳cDNAComplementaryDNA 互补 DNA PBSPhosphateBufferedSaline 磷酸盐缓冲液cccDNAClosedCircularCoiledDNA 闭环螺旋 DNA PFUPlaqueFormingUnit 空斑形成单位CPECytopathicEffect 细胞病理效应piPostInfection 感染后CsClCesiumChloride 氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus 增殖性腺病毒DMEMDulbecco’ sModifiedEagleMediumDMEM 培育基RITRRightInvertedTerminalRepeat 右边反向尾端重复DMSODimethylSulfoxide 二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate 十二烷基硫酸钠DTTDithiothreitol 二硫苏糖醇TBETrisBorate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid 乙二胺四乙酸乙酸EtBrEthidiumBromide 溴化乙锭TCID50TissueCultureInfectiousDose5050% 组织培育感染剂FBSFetalBovineSerum 胎牛血清量HrHour 小时TCPTotalCellularProtein 细胞总蛋白ITRInvertedTerminalRepeat 反向尾端重复TETris/EDTATE 溶液KanKanamycin 卡那霉素wtWildType 野生型kbKilobases 千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5- 溴KDaKiloDaltons 千道尔顿-4-氯 -3-吲哚 -β-D- 半乳糖苷第一章简介此刻基因输送技术的发展日益复杂，一些治疗药物（生长激素、扰乱素、抗病毒和抗癌复合物）和诊疗性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。