2.1复制

生命科学与技术学院 15 分子生物学（胡凯） 2015-2-10
DNA聚合酶I ( 109kD)
功能：校读错误，填补空隙，切除引物
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DNA聚合酶Ⅲ
主要的合成酶 分子量约为140kD，是由10种亚基组 成的不对称二聚体。
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6. 反平行DNA链和不连续复制
前导链—在DNA复制时，合成方向与复制 叉移动的方向一致并连续合成的链。
随后链—在DNA复制时，合成方向与复制 叉移动的方向相反，形成许多不连续的 片段，最后再连成一条完整的DNA链。 半不连续复制—在DNA复制时，领头链是 连续合成的,而随后链的合成是不连续的， 这种复制方式称为半不连续复制。
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冈崎片段 在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只 能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续 的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。
冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的 DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当 于一个顺反子）。
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3. DNA复制的起始
基本概念： ●复制子：基因组能独立进行复制的单位。
● 起点：控制复制起始，是含有 100 ～ 200 个碱
基对的一段DNA。细胞内存在着能识别起点的 特殊蛋白质(大肠杆菌中称为Dna A蛋白)。
●原核生物：只有一个复制子 ● 真核生物：多个复制子，多个起点，形成多
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2. 复制要求高度缠绕的DNA解螺旋
环状DNA的复制引入缠绕
当两条子链的复制 沿 双 链 DNA 螺 旋 进 行 时，会引起分子的整 个非复制部分过度缠 绕，形成正超螺旋。 这种超螺旋必须被某 种机制克服。
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SSB
拓扑异构酶 oriC（245bp的DNA组分）
稳定解开的单链
理顺DNA链 E.coli的复制起始点
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① 互相缠绕的双链母本DNA，复制从特定的位置(复制原 点Ori or O)开始，该位置常是富含A、T区段。
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聚合酶活 性位点
模 板
引物
3 ′ → 5 ′外 切酶位点
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核酸外切酶活性
5´→3´外切酶活性： 切除引物 切除突变的片段
3´→5´外切酶活性： 切除错配的核苷酸
3'
5' 3'
C T T C A G G A
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原核生物的DNA聚合酶
1958年A.Kornberg在大肠杆菌中发现
DNA聚合酶I:校读错误，填补空隙， 切除引物。 DNA聚合酶II:在无polI及pol III的情 况下才起作用，其真正的功能也未完 全清楚。 DNA聚合酶III:主要的合成酶，多种亚 基组成的聚合体，作用同酶I。
2. 复制要求高度缠绕的DNA解螺旋
拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。 作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要 集中在活性转录区，同转录有关。
拓扑异构酶 Π ：使 DNA两条链发生断裂和再连 接。当引入负超螺旋时需要由 ATP提供能量， 同复制有关。
二者共同控制DNA的拓扑结构。
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• 引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一 段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实 质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有
切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，连接 酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。
DNA聚合酶Ⅲ ＞1（多亚基酶）
5’ 3’聚合活性
3‘ 5’外切活性
（保护DNA复制的 忠实性fidelity）
+ 中
+
+ 很低
+
+ 很高
+
5‘ 3’外切活性
+
-
-
主要是对DNA损伤的 修复；以及在DNA复 制时切除RNA引物并 填补其留下的空隙。
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修复紫外光引起 的DNA损伤
DNA 复制的主 要聚合酶，还 具有3’-5‘ 外切酶的校对 功能，提高DNA 复制的保真性
单链结合蛋白：稳定已被解开的 DNA单链，阻 止复性和保护单链不被核酸酶降解。
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5. 新合成链的延长
聚合反应与聚合酶
DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶。其特点为： （1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物； （2）反应需要有模板的指导； （3）反应需要有3-OH存在； （4）DNA链的合成方向为5 3 （5）DNA聚合酶的反应可以利用 DNA双链作为模板和引物，亦可以单链 DNA 作为模板和引物. （6）DNA的体外聚合必须加入少量的 DNA才能进行。DNA在提取过程中易形 成切口（nick）或缺口（gap）.则加入的DNA一条链作为模板而另一条链可作 为引物。
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主要内容 目 录
1
双链DNA的半保留复制 DNA复制的起始 复制的延长
5 6
完整的DNA复制系统
真核染色体的复制
2
3
7 未来实际的应用
4 反平行DNA链的不连续复制
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聚合反应机理：
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前导链
合成 可滑动的 夹持器亚基
后随链
合成
夹持 器装置
催化亚基
催化亚基
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亚基保持核心酶 的二聚体结构
3´→5´外切酶亚基
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DNA聚合酶Ⅰ 亚基数目 1（单体酶）
DNA聚合酶Ⅱ ＞1（多亚基酶 ）
5'
P 引物 P
5'
O G
3'
C 模 3'
5'
O A T
3'
板 链 5'
3'
OH
P
P
P
5' 5' O O 3' 3'
T T
A
OH OH
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1.双链DNA的半保留复制
• 半保留复制 DNA复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲 代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式 称半保留复制。
大肠杆菌DNA复制错配率约10-9~10-10。其 染色体中有4.5×106bp，平均每1 000～10 000 个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。
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小结－维持DNA复制准确性的因素： 内因: ① 按碱基配对原则 (错配率10-4~10-5) ② DNA聚合酶的作用 (错配率10-4~10-5) • 对碱基的识别作用----选择正确的碱基参 入到引物末端 • 对底物的识别作用----先识别引物最后 一个碱基是否正确, 后识别参入的dNTP是否正确 • 校正阅读---- 3′→ 5′外切酶的作用 ③ RNA引物最终被切除, 提高了复制准确性 ④复制完成后对错配碱基进行修复的酶系统 外因： • 四种dNTP要平衡； • Mn2+和Mg2+的比例、浓度（酶活）
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3. DNA复制的起始
从头起始与共价延伸： 1. 生物大多是在 DNA 分子特定的新的位置起 始，合成从RNA引物开始。
2. D- 环式复制方式（线粒体双链环状 DNA ： 两条链的复制起点不同位置，且复制不同步） 3.共价延伸起始也叫单向滚环式复制（噬菌体 X174DNA—单链环状），环状分子产生一个 多联体。
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半保留复制 实验依据
1958年 M.Messelson 等 用实验加以证实
双螺旋结构是 半保留复制的 分子基础
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半保留复制的意义
复制的这种 方式可保证亲代 的遗传特征完整 无误的传递给子 代，体现了遗传 的保守性。
G A A G T C C G G C G
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5'
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DNA聚合酶的“校对”(proofreading)作用 复制的保真性 ( fidelity ) 主要依赖 3 种机制：
• 聚合酶对碱基的选择； • 3′→ 5′方向的外切核酸酶活性起校正作用; • 复制后错配现象的特异性修复机制。