RNAi 技术原理ppt课件
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mRNA翻译蛋 白质
RNAi借用了 天然的 miRNA作用 途径
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5
RNAi 作用 机制
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6
RNAi实验 三大基本路线
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7
线路一：非哺乳动物细胞体系的 RNAi实验和选择
比如果蝇，线虫，拟南芥等低等生物和植 物，由于不涉及抗病毒免疫应答反应，通 过体外转录即可制备目标基因的dsRNA （200bp左右），直接用长双链RNA进行 RNAi实验。
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16
此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和 反义链的模板，正义与反义序列之间由一段环
(1oop)序列隔开。插入载体Pol Ⅲ启动子下游，然 后转入细胞，环序列可使转录出的RNA链折叠成 具发夹结构的小RNA分子（shRNA） ，这些小 RNA可被细胞内的Dicer切割为长21bp的siRNA。
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12
siRNA的转染
• 哺乳动物转染的常见方法有：磷酸 钙共沉淀、电穿孔法、机械法（例 如,显微注射和基因枪）、阳离子 脂质体试剂，其中阳离子脂质体试 剂转染法是目前最常用的转染方法。
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13
siRNA的转染
有些研究人员发现，携带siRNA的脂蛋 白纳米颗粒通过内吞作用进入细胞，一旦 纳米颗粒进入细胞，就会被捕获在小泡中， 这阻碍了大部分siRNA接近位于细胞质的目 标mRNA。甚至会在一小时内将其分解并排 出细胞。
RNAi的实验方法
细胞生物学 樊国达
2014.11.14
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1
目录
• miRNA的原理及机制 • RNAi的机制及与miRNA的关系 • RNAi实验的三大基本路线 • RNAi机制的缺陷
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2
miRNA的原理
MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中
发现的一类内源性的具有调控功能的非编
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17
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18
RNAi机制的缺陷
RNAi作为一种重要的基因转录后沉 默机制，广泛应用于基因功能研究，肿 瘤及病毒感染性疾病治疗的实验研究， 其核心内容是siRNA能够抑制同源基因 的表达。对于siRNA 而言，现在颇有争 议的地方在于它对靶基因的沉默特异性， 主要体现在两个方面： （1）脱靶效应。 （2）打破内源性miRNA的平衡。
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20
降低siRNA 脱靶效应
（1）要减少脱靶效应，可以将针对同一 mRNA的不同siRNA混合起来使用。这些 siRNA作用于同一个目标，每种siRNA的浓度 得以降低，稀释了各自的脱靶效应，但不 损害靶的特异性敲除。
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21
（2）对siRNA的化学修饰
siRNA的化学修饰主要有三类： 磷酸骨架修饰
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3
miRNA如何行使功能？
与mRNA的3‘端非编码区特定位点(其第2~8个 核苷酸)绑定：
>与mRNA完全互补时——会引发mRNA降 解； >不完全的与mRNA配对时，会引发转录 后的基因沉默（抑制靶基因的表达） 从而抑制或阻止相应的mRNA翻译过程。
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4
miRNA途径： miRNA可以 降解mRNA， 或者抑制
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15
线路三：shRNA 表达载体和病毒 载体
这类载体都包含有一个RNA聚合酶Ⅲ 启 动子和一个4～5个连续的T构成的转录终止 位点以及选择标记，选用Pol Ⅲ启动子是因 为此启动子总是在距其一定距离的位置起 始转录，而遇到4～5个连续的T就终止转录， 并且终止于转录终止位点第二个碱基处， 十分精确。
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14
siRNA的转染
研究显示，在纳米颗粒的再利用过程 中，蛋白NPC1 是一个主要因子。没有这一 蛋白，纳米颗粒就不会被细胞排出，让 siRNA有更多的时间去结合目标mRNA。 NPC1缺乏时会出现交通拥堵，这样siRNA就 有更多的时间逃逸出来，但也会影响细胞 的其他生理活动，所以现在大部分研究人 员都在通过改进脂蛋白纳米颗粒的结构， 来增强siRNA的转染效率。
（如硫代修饰，增强抵抗核酸酶的作用）; 核糖修饰
（如2′- O- 甲基化，延长基因沉默的时间） ; 碱基修饰
（ 如5- 溴- 尿嘧啶，增强碱基间的相互配对）。 这几种修饰主要是维持siRNA的稳定性。
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22
（3）优化siRNA设计
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Hale Waihona Puke 23谢谢！精选PPT课件
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8
（1）构建目的基因载体，选取目的基因的 特异性序列（约200bp~300bp），构建到T载 体上。 （2）使用5′端连接有T7启动子的引物PCR扩 增目的基因，得到两端均连接有T7启动子 序 列的目的基因片段。 （3）T7RNA聚合酶进行转录。dsRNA、 ssRNA、DNA模板。 （4）加入Rnase 和Dnase消除ssRNA和DNA模 板。 （5）离心纯化dsRNA。
码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟
的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系
列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装
进RNA诱导的沉默复合体（RISC），通过碱
基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互
补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA
或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明
miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、
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9
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10
siRNA导入细胞的方法
对于线虫 而言，
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11
线路二：哺乳动物细胞RNAi实验： siRNA的设计，合成
哺乳动物细胞导入30bp以上的长双链RNA （dsRNA），往往会诱发非预期的抗病毒应 答反应，所以不能用体外合成的dsRNA直接 导入细胞，常见的做法之一是直接制备19— 27bp左右的siRNA，然后再将siRNA转入哺乳 动物细胞。
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19
脱靶效应
即siRNA 对靶基因的沉默并不一定严格 按照序列特异性方式进行。 （1）对于21-23nt 的siRNA，只需少至7nt 的 序列与mRNA 同源，均可导致该基因的沉默。 （2）诱导机体或细胞产生天然或获得性免疫 应答，被一些蛋白酶降解，从而降低siRNA 对靶基因的特异性。
RNAi借用了 天然的 miRNA作用 途径
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RNAi 作用 机制
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RNAi实验 三大基本路线
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线路一：非哺乳动物细胞体系的 RNAi实验和选择
比如果蝇，线虫，拟南芥等低等生物和植 物，由于不涉及抗病毒免疫应答反应，通 过体外转录即可制备目标基因的dsRNA （200bp左右），直接用长双链RNA进行 RNAi实验。
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此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和 反义链的模板，正义与反义序列之间由一段环
(1oop)序列隔开。插入载体Pol Ⅲ启动子下游，然 后转入细胞，环序列可使转录出的RNA链折叠成 具发夹结构的小RNA分子（shRNA） ，这些小 RNA可被细胞内的Dicer切割为长21bp的siRNA。
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siRNA的转染
• 哺乳动物转染的常见方法有：磷酸 钙共沉淀、电穿孔法、机械法（例 如,显微注射和基因枪）、阳离子 脂质体试剂，其中阳离子脂质体试 剂转染法是目前最常用的转染方法。
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siRNA的转染
有些研究人员发现，携带siRNA的脂蛋 白纳米颗粒通过内吞作用进入细胞，一旦 纳米颗粒进入细胞，就会被捕获在小泡中， 这阻碍了大部分siRNA接近位于细胞质的目 标mRNA。甚至会在一小时内将其分解并排 出细胞。
RNAi的实验方法
细胞生物学 樊国达
2014.11.14
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1
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• miRNA的原理及机制 • RNAi的机制及与miRNA的关系 • RNAi实验的三大基本路线 • RNAi机制的缺陷
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miRNA的原理
MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中
发现的一类内源性的具有调控功能的非编
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RNAi机制的缺陷
RNAi作为一种重要的基因转录后沉 默机制，广泛应用于基因功能研究，肿 瘤及病毒感染性疾病治疗的实验研究， 其核心内容是siRNA能够抑制同源基因 的表达。对于siRNA 而言，现在颇有争 议的地方在于它对靶基因的沉默特异性， 主要体现在两个方面： （1）脱靶效应。 （2）打破内源性miRNA的平衡。
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20
降低siRNA 脱靶效应
（1）要减少脱靶效应，可以将针对同一 mRNA的不同siRNA混合起来使用。这些 siRNA作用于同一个目标，每种siRNA的浓度 得以降低，稀释了各自的脱靶效应，但不 损害靶的特异性敲除。
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（2）对siRNA的化学修饰
siRNA的化学修饰主要有三类： 磷酸骨架修饰
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miRNA如何行使功能？
与mRNA的3‘端非编码区特定位点(其第2~8个 核苷酸)绑定：
>与mRNA完全互补时——会引发mRNA降 解； >不完全的与mRNA配对时，会引发转录 后的基因沉默（抑制靶基因的表达） 从而抑制或阻止相应的mRNA翻译过程。
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miRNA途径： miRNA可以 降解mRNA， 或者抑制
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线路三：shRNA 表达载体和病毒 载体
这类载体都包含有一个RNA聚合酶Ⅲ 启 动子和一个4～5个连续的T构成的转录终止 位点以及选择标记，选用Pol Ⅲ启动子是因 为此启动子总是在距其一定距离的位置起 始转录，而遇到4～5个连续的T就终止转录， 并且终止于转录终止位点第二个碱基处， 十分精确。
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siRNA的转染
研究显示，在纳米颗粒的再利用过程 中，蛋白NPC1 是一个主要因子。没有这一 蛋白，纳米颗粒就不会被细胞排出，让 siRNA有更多的时间去结合目标mRNA。 NPC1缺乏时会出现交通拥堵，这样siRNA就 有更多的时间逃逸出来，但也会影响细胞 的其他生理活动，所以现在大部分研究人 员都在通过改进脂蛋白纳米颗粒的结构， 来增强siRNA的转染效率。
（如硫代修饰，增强抵抗核酸酶的作用）; 核糖修饰
（如2′- O- 甲基化，延长基因沉默的时间） ; 碱基修饰
（ 如5- 溴- 尿嘧啶，增强碱基间的相互配对）。 这几种修饰主要是维持siRNA的稳定性。
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（1）构建目的基因载体，选取目的基因的 特异性序列（约200bp~300bp），构建到T载 体上。 （2）使用5′端连接有T7启动子的引物PCR扩 增目的基因，得到两端均连接有T7启动子 序 列的目的基因片段。 （3）T7RNA聚合酶进行转录。dsRNA、 ssRNA、DNA模板。 （4）加入Rnase 和Dnase消除ssRNA和DNA模 板。 （5）离心纯化dsRNA。
码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟
的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系
列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装
进RNA诱导的沉默复合体（RISC），通过碱
基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互
补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA
或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明
miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、
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siRNA导入细胞的方法
对于线虫 而言，
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11
线路二：哺乳动物细胞RNAi实验： siRNA的设计，合成
哺乳动物细胞导入30bp以上的长双链RNA （dsRNA），往往会诱发非预期的抗病毒应 答反应，所以不能用体外合成的dsRNA直接 导入细胞，常见的做法之一是直接制备19— 27bp左右的siRNA，然后再将siRNA转入哺乳 动物细胞。
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19
脱靶效应
即siRNA 对靶基因的沉默并不一定严格 按照序列特异性方式进行。 （1）对于21-23nt 的siRNA，只需少至7nt 的 序列与mRNA 同源，均可导致该基因的沉默。 （2）诱导机体或细胞产生天然或获得性免疫 应答，被一些蛋白酶降解，从而降低siRNA 对靶基因的特异性。