鱼腥草中总黄酮含量测定方法比较研究

化学
鱼腥草中总黄酮含量测定方法比较研究李夏冰*，江琴，崔长伟，李雅善，王天菊
（楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南楚雄675000）
摘
要：本研究以芦丁为对照品，比较了直接测定法、AlCl 3法、NaNO 2-Al （NO 3）3-NaOH 法测定鱼腥草中总黄酮的含
量，并通过精密度、重现性和加标回收实验进行评价。

结果表明：芦丁不适合作为直接测定鱼腥草总黄酮的对照品；Na-NO 2-Al （NO 3）3-NaOH 法对鱼腥草总黄酮含量的测定中不具备专一性，受到非黄酮类物质干扰，造成结果偏高。

AlCl 3法稳定性、专一性强，可作鱼腥草总黄酮含量的测定方法，其中，AlCl 3法测定波长为412nm ，精密度、稳定性、重复性的RSD 值分别为：1.47％、0.84％、2.03％，加标回收率为94.14±0.28％。

关键词：鱼腥草；总黄酮；分光光度法中图分类号：Q949.732.2
文献标志码：A
文章编号：1671-7406（2020）03-0096-05
鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）又名折耳根，是三白草科蕺菜属植物蕺菜的全草，其性味辛、寒，具有清热解毒、消肿排脓、利尿涌淋的功效，是卫生部确定的药食同源的植物之一[1]。

现代药理学研究证明，鱼腥草具有丰富的生物活性，如抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等[1]，主要活性成分为黄酮类化合物、甾醇类、生物碱以及酚类等，其中黄酮类化合物表现出极为重要的作用[2-5]。

目前，总黄酮含量的测定主要采用紫外分光光度法和高效液相色谱（HPLC ）法
[6，7]。

分光光度法
主要有直接测定法[8]
、AlCl 3分光光度法和Al （NO 3）3分光光度法，其基本原理为黄酮类化合物进行络合显色，通过标准对照测定总黄酮的含量[9]。

分光光度法相对操作简单、设备便宜，普遍应用于总黄酮的测定，但该方法专一性较差，容易受到被测样品中其他成分的干扰从而使得测定结果偏高[9]。

HPLC 法具有分析速度快、灵敏度高、结果准确等特点，该法主要是采用标准品对照的方法，测定总黄酮含量，也可以通过水解后测定黄酮苷元含量，再通过转化系数求得总黄酮含量，但该方法样品属于精确检测，无法从整体上去评价样品的黄酮含量水平，且前处理复杂，仪器昂贵、使用成本高以及检测时间长等因素不能被广泛应用[6，7]。

因此，建立一种快速、准确的鱼腥草中总黄酮测定方法是必要的。

本研究通过比较直接测定法、三氯化铝比色法和硝酸铝比色法测定鱼腥草中总黄酮的可行性，目的是确定最适合鱼腥草中黄酮测定的方法，以期为鱼腥草中黄酮类物质提取和开发利用提供理论依据。

1材料与方法
1.1
材料和主要仪器
鱼腥草全草采自云南省
楚雄市，放置通风处自然阴干保存备用。

芦丁标准品，纯度＞95%（上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇、石油醚、三氯化铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝（分析纯，天津市优谱化学试剂有限公司）；KQ-250DE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；紫外/可见分光光度计（UV-5500型，上海元析仪器有限公司）；RE-5203旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2实验方法
1.2.1
鱼腥草总黄酮样品的制备
将干燥的鱼
腥草全草粉碎，过40目筛，并在低温下保存备用。

用电子天平称取质量为5.0g 的鱼腥草样品，放置在体积为250mL 的具塞锥形瓶中，向其中加入
收稿日期：2019－11－10
基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目资助（NO：2020J0764）。

*通讯作者：李夏冰（1987－），男，博士，楚雄师范学院化学与生命科学学院讲师，主要从事天然产物化学研究。

E-mail：lixi-******************
第35卷第3期2020年5月
Vol.35No.3
May ，2020
楚雄师范学院学报（自然科学）
JOURNAL OF CHUXIONG NORMAL UNIVERSITY （NATURAL SCIENCE ）
096
130mL70％的乙醇溶液，在温度为50-60度下超声提取60min，超声功率250W，重复3次，合并提取液，抽滤，浓缩至一定体积。

用3倍体积的石油醚萃取3次，脱脂，浓缩至近干，用70%乙醇复溶，待用。

1.2.2芦丁标准溶液的制备准确称取芦丁对照品0.0312g，加入适量70％的乙醇溶液，用超声波超声溶解置冷，再用70％的乙醇溶液定容至体积为100mL的棕色容量瓶中，摇匀，制得（浓度为
0.3120mg/mL）芦丁对照品溶液，备用。

1.2.3总黄酮的最大吸收波长及含量测定直接测定法：移取1mL鱼腥草黄酮样品，置于10mL 的比色管中，用70％的乙醇溶液定容至刻度，充分摇匀后静置10min，以试剂为空白，于200－600 nm波长范围扫描；AlCl3显色法：移取1mL鱼腥草黄酮样品，置于10mL比色管中，加4mL1％的Al-Cl3溶液，再用70％的乙醇溶液定容至刻度，充分摇匀后在40℃水浴下显色10min，以试剂为空白，于200－600nm波长范围扫描；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法：移取1mL鱼腥草黄酮样品，置于10 mL的比色管中，再向其中加入0.3mL5％的Na-NO2溶液，摇匀后静置5min，再加0.3mL10％的Al（N03）3溶液，充分摇匀后静置6min，加入4mL 4％的NaOH溶液，最后用70％的乙醇溶液定容，以试剂为空白，于200－600nm波长范围扫描。

分别以1mL芦丁对照品溶液代替样品，按照上述3种方法，以试剂为空白，在200－600nm 波长范围内扫描，所有实验均重复5次。

1.2.4标准曲线的制作AlCl3显色法：移取“1.2.2”的对照品溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0 mL、4.0mL、5.0mL，分别放置在体积为10mL的比色管中，先加4mL1％的AlCl3溶液，再用适量70％的乙醇溶液定容至刻度线。

以试剂做参比，在AlCl3显色法所选的最大波长处测定吸光度，并且以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制出标准曲线图。

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法：依次移取“1.2.2”配制标准液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL的芦丁对照品溶液，分别放置在体积为20mL的比色管中，加入5％的Na-NO2溶液0.6mL，摇匀后静置5min，加10％的Al （N03）3溶液0.6mL，充分摇匀后静置6min，加8 mL4％的NaOH溶液，最后用70％的乙醇溶液定容至刻度，以空白试剂做参比，在该显色法所选的最大波长处测定吸光度，并绘制出以吸光度A为
纵坐标，浓度C为横坐标的标准曲线图。

1.2.5两种显色法方法学验证稳定性测定：取3份1mL鱼腥草黄酮样品，并按AlCl3和NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法操作步骤显色后，置于室温下，分别于20、40、60min，测定样品溶液的吸光度值，并计算RSD。

精密度和重复性测定：取9份1mL鱼腥草黄酮样品，分成3组，按照种AlCl3和NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色方法操作后显色，测定其吸光度，每个样品测定5次。

加样回收率测定：分别移取已知含量的芦丁标准品，加入到鱼腥草黄酮样品中，5个平行，并按AlCl3和NaNO2-Al （NO3）3-NaOH显色法操作步骤显色后，测定添加芦丁标准品前后吸光度，再分别计算每种测定方法的加标回收率及RSD值。

2结果与分析
2.1芦丁对照品和样品在3种比色法下扫描光谱图芦丁和鱼腥草样品在3中比色法下的扫描光谱图如图1所示。

直接测定，未经显色的样品在200－600nm的波长范围内有一个最大吸收峰，为34
3.20nm；芦丁对照品的最大吸收峰在363.00nm处，两者相差较远（图1A）。

显然，芦丁不适合作为直接测定法测定鱼腥草样品中黄酮含量的对照品。

AlCl3法（图1B）下，芦丁与样品经显色后在紫外区的光谱图吻合度较高，最大吸波长分别为：411.80和406.60nm，暂定该法可以以芦丁对照品作为鱼腥草样品中黄酮含量的测定。

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法（图1C）下可以看出，鱼腥草黄酮样品和芦丁对照品两者吸收峰出现的位置最为相近，并且最大吸收峰分别为：503.60 nm和504.40nm，所以在此显色法下芦丁也是适合作为鱼腥草中黄酮样品测定的对照品的。

2.2标准曲线图2为在AlCl3和NaNO2-Al （NO3）3-NaOH两种显色方法下的芦丁标准曲线。

AlCl3法标准曲线（图2A）线性方程为y=24.590x+ 0.0113，在0～0.0624mg/mL范围内呈良好线性关系，相关系数R2=0.9996；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法标准曲线（图2B）线性方程为y=10.609x+ 0.0253，在0～0.1248mg/mL内呈良好线性关系，相关系数R2=0.9997。

2.3二种显色方法测定总黄酮含量及方法学验证结果鱼腥草样品经AlCl3和NaNO2-Al（NO3）3-
李夏冰，江琴，崔长伟，等鱼腥草中总黄酮含量测定方法比较研究
097
化学
化学
NaOH 两种方法显色后，静置，后分别于20，40，60min 时测定吸光度，结果如图3所示。

可见，在2种显色反应后，20－60分钟内，样品吸光度均稳定，因此，利用AlCl 3和NaNO 2-Al （NO 3）3-NaOH 两种显色方法，测定鱼腥草中总黄酮含量，可在显色后20－60min 内测定。

表1综合了2种显色方法下测定鱼腥草中总黄酮方法的精密度、重现性的RSD 值及加标回收率的数值分析。

AlCl 3显色法与NaNO 2-Al （NO 3）3-NaOH 显色法相比，两者的回收率都比较高，并且精密度、稳定性、重复性及加标回收率的RSD 值
都较为接近，并且在误差允许的范围内都小于了3％。

从方法学的验证来看，两种方法都可以满足鱼腥草中总黄酮含量的测定。

但是通过对比鱼腥草中总黄酮的提取率可以发现，AlCl 3显色法的测定得到的鱼腥草中总黄酮的提取率在0.45％（DW ）；而在NaNO 2-Al （NO 3）3-NaOH 显色法的提取率更高，为2.56％（DW ）。

3讨论
直接测定法、AlCl 3显色法、NaNO 2-Al （NO 3）3-
NaOH 显色法为紫外-可见光分光光度法中最为常
图13种比色方法芦丁和样品的紫外-可见光谱图，A ：直
接测定；B ：AlCl 3；C ：NaNO 2-Al （NO 3）3-NaOH
Fig.1Ultraviolet-Visible visible spectrum of rutin and sample under using 3colorimetric methods ，A ：direction ；B ：Al-Cl 3；C ：NaNO 2-Al （NO 3）3
-NaOH
图2
2种显色方法下芦丁的标准曲线，A ：AlCl 3；B ：Na⁃
NO 2-Al （NO 3）3-NaOH
Fig.2Standard curves of rutin for 2methods ，A ：AlCl 3；B ：NaNO 2-Al （NO 3）3
-NaOH
图3
两种显色法下稳定性试验结果Fig.3Stability test results of 2methods
楚雄师范学院学报2020年第3期
098
用的几种测定方法[9]。

在这三种测定方法中，最常用的测定方法为NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法，并且它的使用频率达到了70％，但是通过部分文献资源的分析和整理[10]，表明该显色方法在使用细节上存在着许多不足之处，并且郭亚健在“关于比色法测定总黄酮方法的探讨”中也报道出Na-NO2-Al（NO3）3-NaOH显色法对于槲皮素、山奈素等部分黄酮类物质不显色，而对绿原酸、3，4-二羟基苯甲酸等非黄酮类物质显色，从而对测定结果造成假性干扰；马陶陶在“三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨”中也进一步强调了以芦丁为对照品，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法不能排除与非黄酮类化合物的反应，从而降低了该显色方法的专属性[11]。

宗晓萍[12]的研究中则表明鱼腥草中主要黄酮类化合物为槲皮素、山奈酚、金丝桃苷，并且所占比重较大，除此之外，鱼腥草中还含有绿原酸、亚油酸和硬脂酸等有机酸和脂肪酸。

另外，在碱性条件下，鱼腥草黄酮样品中含有的天然色素也可能会影响实验测定结果，从而使测定结果产生偏差。

张群林等就选择了几种常见的黄酮类化合物和非黄酮类化合物，通过反应对比显色前后的吸收峰，以此来检测AlCl3显色法测定的适用性，表明了AlCl3显色法只对槲皮素、金丝桃苷、芦丁等部分黄酮类化合物显色，而不与3，4-二羟基苯甲酸、绿原酸等非黄酮类物质反应，从而降低了非黄酮类化合物对该显色法的干扰[11]，AlCl3显色法的反应特征是AlCl3只与黄酮类物质中含3位羟基及B环中具有邻二酚羟基的物质发生反应，而不与只存在5位羟基的非黄酮类物质反应。

综上，对于鱼腥草中总黄酮含量测定，AlCl3显色法测定的结果相对来说可能更与真值接近，在以后的研究工作中我们可以通过HPLC方法的比较研究或针对性地对NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色法进行干扰性实验的验证。

4结论
本实验比较了直接测定法、AlCl3显色法、Na-NO2-Al（NO3）3-NaOH显色法下芦丁和鱼腥草总黄酮的紫外-可见光谱图、提取率及方法学验证。

结果显示，直接测定法不能用芦丁作为对照品来测定鱼腥草中总黄酮；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法由于鱼腥草中某些非黄酮类物质干扰影响较大，造成测定结果偏高，也不适合作为测定鱼腥草中黄酮测定的方法。

AlCl3显色法操作简单，专一性强，精密度高，重复性好，平均加标回收率为94.14%，在20-60min内显色稳定，更适合作为鱼腥草中总黄酮研究的定量方法。

参考文献：
[1]孙谦，胡中海，孙志高，等.鱼腥草的生物活性及其机
理研究进展[J].食品科学，2014，35（23）：354－358.
Sun Q，Hu Z H，Sun Z G，et al.Advances in biologi-
cal activities and mechanisms of Houttuynia cordata
[J].Food Science，2014，35（23）：354－358.
[2]Fu R，Zhang Y T，Guo YR，et al.Determination of
phenolic contents and antioxidant activities of extracts
of Jatropha curcas L.seed shell，a by-product，a new
source of natural antioxidant[J].Industrial Crops and
Products，2014，58：265－270.
[3]Zhang X H，Liu L，Liu C W，et al.Isolation，structur-
al characterization and antioxidant activity of a neutral
polysaccharide from Sisal waste[J].Food Hydrocol-
loids，2014，39：10－18.
[4]蔡灏，吴翠萍，孙秀漫，等.5种紫珠属药材中总酚、
总黄酮与其抗氧化活性的相关性研究[J].中国实验
方剂学杂志，2013，19（20）：55－60.
Cai H，Wu C P，Sun X M，et al.Correlation of the
contents of total phenols and total flavonoids and anti-
oxidant activities of five Callicarpa Species[J].Chi-
nese Journal of Experimental Traditional Medical For-
mulae，2013，19（20）：55－60.
[5]徐贵华，张凤梅，叶兴乾.果蔬酚类物质抗氧化活性
表1两种显色法下方法学验证
Table1The Method validation of AlCl3，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH
方法
Method
AlCl3显色法NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法
提取率/%
Extract/%
0.45
2.56
精密度
RSD/%
Precision
1.47
0.76
重现性
RSD/%
Repeat
2.03
2.00
加标回收率/%
Recovery/%
94.14
97.79
加标回收率RSD/％
Recovery
0.28
1.52
李夏冰，江琴，崔长伟，等鱼腥草中总黄酮含量测定方法比较研究
099
化学
研究[J].食品研究与开发，2013，
（15）：18－21.
Xu G H，Zhang F M，Ye X Q.Antioxidant activity of
phenolic compounds in vegetables and fruits[J].Food
Research and Development，2013，（15）：18－21. [6]胡莉，靳可婷，仲伶俐，等.高效液相色谱法同时测
定粮食中6种大豆异黄酮[J].食品安全质量检测学
报，2017，
（11）：288－294.
Hu L，Jin K T，Zhong L L，et al.Determination of6
kinds of isoflavones in food crops by high performance
liquid chromatography[J].Journal of Food Safety and
Quality，2017，（11）：288－294.
[7]卢红梅，彭丽华，郭方遒，等.鱼腥草中黄酮类成分
的高效液相色谱指纹图谱分析[J].色谱，2010，28（10）：965－970.
Lu H M，Peng L H，Guo F Q，et al.High perfor-
mance liquid chromatographic fingerprint analysis of
flavonoids from houttuynia cordata thunb[J].Chinese
Journal of Chromatography，2010，28（10）：965－970.
[8]杨亚飞，胡烨敏，钱蔚，等.多种蜂胶中总黄酮检测
方法的适用性研究[J].食品安全质量检测学报，2015，（9）：3708－3712.
Yang Y F，Hu Y M，Qian W，et al.Applicability of
methods for detection of total flavone in multiple prop-
olis[J].Journal of Food Safety&Quality，2015，（9）：3708－3712.[9]郭慧玲，张亚军.紫外—可见分光光度法测定乌灵胶
囊总黄酮含量的方法研究[J].广州中医药大学学报，2019，36（7）：1074－1079.
Guo H L，Zhang Y J.Determination of total flavonoids
content in Wuling capsules by ultraviolet-visible spectro-
photometry[J].Journal of Guangzhou University of Tra-
ditional Chinese Medicine，2019，36（7）：1074－1079. [10]薛长晖，袁少明，王佩维，等.苦荞粉提取液中黄酮
类化合物含量测定方法的选择[J].理化检验（化学分
册），2006，42（1）：22－23.
Xue C H，Yuan S M，Wang P W，et al.On the selec-
tion of methods for the determination of flavonoids in
extracts of spring buckwheat powder[J].Physical
Testing and Chemical Analysis（PartB：Chemical
Analysis），2006，42（1）：22－23.
[11]马陶陶，张群林，李俊，等.三氯化铝比色法测定中
药总黄酮方法的探讨[J].时珍国医国药，2008，（1）：
54－56.
Ma T T，Zhang Q L，Li J，et al.AlCl3colorimetry for
determination of total flavonoid[J].Lishizhen Medi-
cine and Materia Medica Research，2008，（1）：54－56.
[12]宗晓萍.鱼腥草有效成分的研究[D].成都中医药大
学，2005.
Zong X P.Studies on effctive components of houttuyn-
ia[D].Chengdu university of TCM，2005.
Comparative Study on Assays for Determination of Flavonoids
in Houttuynia Cordata
LI Xiabing,JIANG Qin,CUI Changwei,LI Yashan&WANG Tianju
（School of Chemistry and Life Sciences,Chuxiong Normal University,Chuxiong,Yunnan Province675000）
Abstract：The accuracy of three spectrophotometric assays for the determination of flavonoids in Hout-tuynia cordata using direct colorimetry,AlCl3and NaNO2-Al(NO3)3-NaOH respectively was compared,and the selected method was evaluated by precision,stability,and recovery test.The results showed:1)rutin was not suitable as a standard reference substance for the direct determination of total flavonoids in Houttuynia cordata;and2)the total flavonoid content measured was higher using NaNO2-Al(NO3)3-NaOH method due to interference with certain non-flavonoids.For the AlCl3method,the measurement wavelength was412nm us-ing rutin as a reference substance,and AlCl3method was selected as the best method for the determination of total flavonoids in Houttuynia cordata.The precision,stability,reproducibility of AlCl3method were1.47%, 0.84%and2.03%respectively.The average recovery rate was94.14%±0.28%.
Key words：Houttuynia cordata;total flavonoids;spectrophotometry
（责任编辑：邱璐）楚雄师范学院学报2020年第3期100
化学。