基于非靶向代谢组学的平菇子实体发育过程中菌丝体差异代谢物分析

基于非靶向代谢组学的平菇子实体发育过程中菌丝体差异代谢物分析
作者：刘芹黄保胡素娟牛森园吴杰周奥硕孔维丽
来源：《中国瓜菜》2024年第01期
摘要：為了解平菇生长发育过程中子实体形成的代谢物基础，采用超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱（UPLC-ESI-MS/MS）技术结合多变量统计分析方法对发菌完成期（MM）、原基期（MP）及子实体分化期（MF）的平菇菌丝体进行代谢组学分析。

结果表明，主成分（PCA）模型分析结果显示3个时期平菇菌丝体中的代谢产物具有明显差异。

通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS‐DA），以VIP（varible importance in the projection）>1和差异倍数值（fold change）≥ 2或≤ 0.5为条件对MM vs MP、MM vs MF和MP vs MF中的差异代谢物进行比较分析，分别获得139个、147个和67个差异代谢物，变化倍数最大的物质包括氨基酸及其衍生物、脂质、生物碱、有机酸等，说明这些差异代谢物对平菇子实体发育具有重要影响。

KEGG分析表明，苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢等20条代谢通路表现活跃。

在子实体发育过程中，脂质、有机酸、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物之间明显相关。

以上研究结果为平菇子实体发育机制和标准化栽培提供了理论依据。

关键词：平菇；代谢组学；菌丝体；差异代谢物；子实体发育
中图分类号：S646.1+4 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）01-045-11
Analysis of differential metabolites during fruiting body development of Pleurotus ostreatus based on untargeted metabolomics
LIU Qin1，HUANG Bao1，HU Sujuan1，NIU Senyuan2，WU Jie3，ZHOU Aoshuo4，KONG Weili1
（1. Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Germplasm Resources of Edible Fungi in Huang-Huai-Hai Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Institute of Edible Fungi，Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003，Henan， China; 3. College of Life Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002，Henan， China; 4. Zhengzhou Financial School， Zhengzhou 450007， Henan， China）
Abstract： In order to understand the metabolite basis of fruiting body formation during the growth and development of Pleurotus ostreatus， ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization （UPLC-ESI-MS/MS） combined with multivariate statistical methods was used to analyze the differences of intracellular metabolites in mycelia of P. ostreatus at the spawning completion stage， primordium stage and fruiting body differentiation stage. The results showed that principal component （PCA） model revealed significant differences （p<0.05） among metabolites in mycelia of P. ostreatus at the three periods. Through orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS‐DA）， 139， 147 and 67 differential metabolites were screened and identified in MM vs MP， MM vs MF and MP vs MF under the conditions of VIP （varible importance in the projection）> 1 and fold change ≥ 2 or ≤ 0.5.
Amino acids and derivatives， lipids， alkaloids and organic acids were substances with the maximum fold change values， which indicated that these differential metabolites played important roles in the fruiting body development. KEGG analysis showed that phenylalanine metabolism，tryptophan metabolism， purine metabolism and other metabolic pathways were active. During the growth and development of P. ostreatus， the contents of lipids， organic acids， nucleotides and their derivatives， and amino acids and their derivatives were significantly correlated. The results of this study provided theoretical basis for the mechanism of fruiting body development and standardized cultivation of P. ostreatus.
Key words： Pleurotus ostreatus; Metabonomics; Mycelia; Differential metabolites; Fruiting body development
食用菌因具有丰富的营养、独特的风味以及广泛的生物学活性而被认定为“新一代食
物”[1]。

食用菌具有热量低、膳食纤维和蛋白质含量高的优点，并且还含有各年龄段人群所需要的氨基酸、矿物质和维生素等，而这些通常是植物来源食品中所缺乏的[2]。

此外，食用菌还具有调节免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等功能[3]。

因此，食用菌常被用作营养丰富的食品、补充剂、保健品以及医药制品等的原料[4]。

中国是食用菌生产大国。

目前，我国可栽培食用菌大约有967种，几乎占世界可栽培食用菌种类的50%，其中已实现商业化栽培的有60多种[5]。

2021年我国食用菌年产量达到4 133.94万t，比2020年增长了1.79%，总产值达到3 475.63亿元，比2020年增长0.29%[6]。

食用菌已经是我国继粮、菜、果、油之后的第五大农作物[5]。

食用菌子实体的形成与自身发育的分子机制密切相关，对食用菌的产量和品质有重要影响[7]。

食用菌在生长发育过程中，菌丝通过分解培养料中的木质纤维素、蛋白质、多糖等高分子物质，产生大量的低分子代谢物以满足子实体所需[8]。

据报道，有10万多种特有代谢物如多糖、黄酮、脂质、萜类、酚类等广泛存在于各种食用菌菌丝体中，作为食用菌营养来源或生长发育调控物质[9]。

研究表明，谷氨酸在亚洲兰茂牛肝菌原基发育中起重要调控作用[10]。

羊肚菌营养生长过程中，脂肪酰基类物质在羊肚菌菌丝体内的主要功能为能量贮存，胺类物质参与羊肚菌生长发育、子实体成熟，吡啶类物质可提高羊肚菌的抗病能力[9]。

L-精氨酸可能参与牛樟芝的解毒、保肝作用[11]。

因而，有必要对食用菌菌丝生长发育过程中的代谢产物进行深入研究。

平菇是我国第三大食用菌栽培种类，具有经济价值高、栽培技术简单、栽培原料来源广泛的优点[12]。

目前我国平菇栽培主要是以玉米芯、棉籽壳、秸秆等为主料制成的栽培袋对平菇生长进行营养供应[8]。

栽培袋营养供应不足会导致平菇出菇率低、子实体发育受限；营养供应过剩可能会导致资源浪费或增加其他杂菌的污染概率。

因此，明确平菇菌丝生长对养分的需求规律，了解各个代谢物在平菇生长发育中的作用，有助于精准化控制平菇所需栽培料，为找到平菇适宜栽培代料或混配配方提供理论依据。

代谢组学是对一个生物系统的所有代谢物进行定性和定量的全面分析，并能揭示生物系统的一门科学[9]。

代谢组学的出现使人们更好地理解作物在受到刺激或生长发育过程中代谢过程的变化，通过标志性代谢的挖掘与验证，可以从代谢物角度找到调节作物生长发育的重要调控剂[13-14]。

因此，笔者通过非靶向代谢组学对发菌完成期、原基期及子实体分化期的平菇菌丝体进行代谢组学分析，以明确平菇生长发育过程中子实体形成的代谢物基础，探索平菇子实体发育机制，为平菇栽培提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试菌株
豫黑平16（品种权号：CNA20191002079），保藏于河南省食用菌种质资源库。

1.2 样品收集
平菇栽培试验于2022年2－5月在河南现代农业试验示范基地进行。

栽培配方为棉籽壳88%、10%麸皮、石灰2%。

参考Du等[13]的方法，收集培养30 d（发菌完成期，MM）、40 d （原基期，MP）和42 d（子实体分化期，MF）的菌丝体（图1），每9个栽培袋收集的样品置于1个无菌离心管中，作为1个试验重复，共设置3次重复。

样品用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.3 样品处理
将冷冻干燥的样品置于2 mL研磨管中，加入2颗钢珠，研磨机（MM-400，Retsch，德国）30 Hz研磨1.5 min。

称取100 mg冻干粉加入1.2 mL 70%甲醇（-20 ℃预冷，色谱级），涡旋振荡，样本置于4 ℃冰箱过夜。

离心（4 ℃，12 000 r‧min-1，10 min）收集上清液，经0.22 μm膜过滤后用于UPLC-ESI-MS/MS分析。

1.4 UPLC分析
采用装备有电喷雾离子源3重4极杆线性离子阱（electrospray ionization-triple quadrupole-linear ion trap，ESI-Q TRAP）（Nexera X2，Shimazdu，日本）的超高效液相色谱-电喷雾离子源串联质谱仪（ultra performance liquid chromatography‐electrospray ionization-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）对样品进行分析。

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）（安捷伦科技有限公司，美国），柱温40 ℃，进样量4 μL。

流动相为0.1%甲酸的水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）。

流动相梯度：0～9.0 min，95%～5% A；9.0～10.1 min，5% A；10.1～11.1 min，5%～95% A；11.1～14.0 min，95% A，流速0.3 mL·min-1。

1.5 ESI-Q TRAP-MS/MS分析
AB4500 Q TRAP UPLC-MS/MS系统与ESI Turbo离子喷雾接口耦合，在负离子和正离子模式下由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex）控制。

电喷雾离子源，涡轮喷雾温度550 ℃，离子喷雾电压为-4500 V（负离子模式）和5500 V（正离子模式）。

离子源气体I、II（GSI、GSII）和幕氣（curtain gas，CUR）的压力分别为50、60和6.9 kPa（25 psi）；碰撞激活解离（collision-activated dissociation，CAD）设置为高。

以氮气为中间碰撞气体，采用多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）进行3重4极扫描试验。

对单个多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）跃迁进行了进一步的聚类势（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）优化。

根据各时期代谢物的洗脱情况，检测出一组特定的MRM离子对。

Key words： Pleurotus ostreatus; Metabonomics; Mycelia; Differential metabolites; Fruiting body development
食用菌因具有丰富的营养、独特的风味以及广泛的生物学活性而被认定为“新一代食
物”[1]。

食用菌具有热量低、膳食纤维和蛋白质含量高的优点，并且还含有各年龄段人群所需要的氨基酸、矿物质和维生素等，而这些通常是植物来源食品中所缺乏的[2]。

此外，食用菌还具有调节免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等功能[3]。

因此，食用菌常被用作营养丰富的食品、补充剂、保健品以及医药制品等的原料[4]。

中国是食用菌生产大国。

目前，我国可栽培食用菌大约有967种，几乎占世界可栽培食用菌种类的50%，其中已实现商业化栽培的有60多种[5]。

2021年我国食用菌年产量达到4 133.94万t，比2020年增长了1.79%，总产值达到3 475.63亿元，比2020年增长0.29%[6]。

食用菌已经是我国继粮、菜、果、油之后的第五大农作物[5]。

食用菌子实体的形成与自身发育的分子机制密切相关，对食用菌的产量和品质有重要影响[7]。

食用菌在生长发育过程中，菌丝通过分解培养料中的木质纤维素、蛋白质、多糖等高分子物质，产生大量的低分子代谢物以满足子实体所需[8]。

据报道，有10万多种特有代谢物如多糖、黄酮、脂质、萜类、酚类等广泛存在于各种食用菌菌丝体中，作为食用菌营养来源或生长发育调控物质[9]。

研究表明，谷氨酸在亚洲兰茂牛肝菌原基发育中起重要调控作用[10]。

羊肚菌营养生长过程中，脂肪酰基类物质在羊肚菌菌丝体内的主要功能为能量贮存，胺类物质参与羊肚菌生长发育、子实体成熟，吡啶类物质可提高羊肚菌的抗病能力[9]。

L-精氨酸可能参与牛樟芝的解毒、保肝作用[11]。

因而，有必要對食用菌菌丝生长发育过程中的代谢产物进行深入研究。

平菇是我国第三大食用菌栽培种类，具有经济价值高、栽培技术简单、栽培原料来源广泛的优点[12]。

目前我国平菇栽培主要是以玉米芯、棉籽壳、秸秆等为主料制成的栽培袋对平菇生长进行营养供应[8]。

栽培袋营养供应不足会导致平菇出菇率低、子实体发育受限；营养供应过剩可能会导致资源浪费或增加其他杂菌的污染概率。

因此，明确平菇菌丝生长对养分的需
求规律，了解各个代谢物在平菇生长发育中的作用，有助于精准化控制平菇所需栽培料，为找到平菇适宜栽培代料或混配配方提供理论依据。

代谢组学是对一个生物系统的所有代谢物进行定性和定量的全面分析，并能揭示生物系统的一门科学[9]。

代谢组学的出现使人们更好地理解作物在受到刺激或生长发育过程中代谢过程的变化，通过标志性代谢的挖掘与验证，可以从代谢物角度找到调节作物生长发育的重要调控剂[13-14]。

因此，笔者通过非靶向代谢组学对发菌完成期、原基期及子实体分化期的平菇菌丝体进行代谢组学分析，以明确平菇生长发育过程中子实体形成的代谢物基础，探索平菇子实体发育机制，为平菇栽培提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试菌株
豫黑平16（品种权号：CNA20191002079），保藏于河南省食用菌种质资源库。

1.2 样品收集
平菇栽培试验于2022年2－5月在河南现代农业试验示范基地进行。

栽培配方为棉籽壳88%、10%麸皮、石灰2%。

参考Du等[13]的方法，收集培养30 d（发菌完成期，MM）、40 d （原基期，MP）和42 d（子实体分化期，MF）的菌丝体（图1），每9个栽培袋收集的样品置于1个无菌离心管中，作为1个试验重复，共设置3次重复。

样品用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.3 样品处理
将冷冻干燥的样品置于2 mL研磨管中，加入2颗钢珠，研磨机（MM-400，Retsch，德国）30 Hz研磨1.5 min。

称取100 mg冻干粉加入1.2 mL 70%甲醇（-20 ℃预冷，色谱级），涡旋振荡，样本置于4 ℃冰箱过夜。

离心（4 ℃，12 000 r‧min-1，10 min）收集上清液，经0.22 μm膜过滤后用于UPLC-ESI-MS/MS分析。

1.4 UPLC分析
采用装备有电喷雾离子源3重4极杆线性离子阱（electrospray ionization-triple quadrupole-linear ion trap，ESI-Q TRAP）（Nexera X2，Shimazdu，日本）的超高效液相色谱-电喷雾离子源串联质谱仪（ultra performance liquid chromatography‐electrospray ionization-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）对样品进行分析。

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）（安捷伦科技有限公司，美国），柱温40 ℃，进样量4 μL。

流动相为0.1%甲酸的水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）。

流动相梯度：0～9.0 min，
95%～5% A；9.0～10.1 min，5% A；10.1～11.1 min，5%～95% A；11.1～14.0 min，95% A，流速0.3 mL·min-1。

1.5 ESI-Q TRAP-MS/MS分析
AB4500 Q TRAP UPLC-MS/MS系统与ESI Turbo离子喷雾接口耦合，在负离子和正离子模式下由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex）控制。

电喷雾离子源，涡轮喷雾温度550 ℃，离子喷雾电压为-4500 V（负离子模式）和5500 V（正离子模式）。

离子源气体I、II（GSI、GSII）和幕气（curtain gas，CUR）的压力分别为50、60和6.9 kPa（25 psi）；碰撞激活解离（collision-activated dissociation，CAD）设置为高。

以氮气为中间碰撞气体，采用多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）进行3重4极扫描试验。

对单个多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）跃迁进行了进一步的聚类势（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）优化。

根据各时期代谢物的洗脱情况，检测出一组特定的MRM离子对。

Key words： Pleurotus ostreatus; Metabonomics; Mycelia; Differential metabolites; Fruiting body development
食用菌因具有丰富的营养、独特的风味以及广泛的生物学活性而被认定为“新一代食
物”[1]。

食用菌具有热量低、膳食纤维和蛋白质含量高的优点，并且还含有各年龄段人群所需要的氨基酸、矿物质和维生素等，而这些通常是植物来源食品中所缺乏的[2]。

此外，食用菌还具有调节免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等功能[3]。

因此，食用菌常被用作营养丰富的食品、补充剂、保健品以及医药制品等的原料[4]。

中国是食用菌生产大国。

目前，我国可栽培食用菌大约有967种，几乎占世界可栽培食用菌种类的50%，其中已实现商业化栽培的有60多种[5]。

2021年我国食用菌年产量达到4 133.94万t，比2020年增长了1.79%，总产值达到3 475.63亿元，比2020年增长0.29%[6]。

食用菌已经是我国继粮、菜、果、油之后的第五大农作物[5]。

食用菌子实体的形成与自身发育的分子机制密切相关，对食用菌的产量和品质有重要影响[7]。

食用菌在生长发育过程中，菌丝通过分解培养料中的木质纤维素、蛋白质、多糖等高分子物质，产生大量的低分子代谢物以满足子实体所需[8]。

据报道，有10万多种特有代谢物如多糖、黄酮、脂质、萜类、酚类等广泛存在于各种食用菌菌丝体中，作为食用菌营养来源或生长发育调控物质[9]。

研究表明，谷氨酸在亚洲兰茂牛肝菌原基发育中起重要调控作用[10]。

羊肚菌营养生长过程中，脂肪酰基类物质在羊肚菌菌丝体内的主要功能为能量贮存，胺类物质参与羊肚菌生长发育、子实体成熟，吡啶类物质可提高羊肚菌的抗病能力[9]。

L-精氨酸可能参与牛樟芝的解毒、保肝作用[11]。

因而，有必要对食用菌菌丝生长发育过程中的代谢产物进行深入研究。

平菇是我国第三大食用菌栽培种类，具有经济价值高、栽培技术简单、栽培原料来源广泛的优点[12]。

目前我国平菇栽培主要是以玉米芯、棉籽壳、秸秆等为主料制成的栽培袋对平菇生长进行营养供应[8]。

栽培袋营养供应不足会导致平菇出菇率低、子实体发育受限；营养供应过剩可能会导致资源浪费或增加其他杂菌的污染概率。

因此，明确平菇菌丝生长对养分的需求规律，了解各个代谢物在平菇生长发育中的作用，有助于精准化控制平菇所需栽培料，为找到平菇适宜栽培代料或混配配方提供理论依据。

代谢组学是对一个生物系统的所有代谢物进行定性和定量的全面分析，并能揭示生物系统的一门科学[9]。

代谢组学的出现使人们更好地理解作物在受到刺激或生长发育过程中代谢过程的变化，通过标志性代谢的挖掘与验证，可以从代谢物角度找到调节作物生长发育的重要调控剂[13-14]。

因此，笔者通过非靶向代谢组学对发菌完成期、原基期及子实体分化期的平菇菌丝体进行代谢组学分析，以明确平菇生长发育过程中子实体形成的代谢物基础，探索平菇子实体发育机制，为平菇栽培提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试菌株
豫黑平16（品种权号：CNA20191002079），保藏于河南省食用菌种质资源库。

1.2 样品收集
平菇栽培试验于2022年2－5月在河南现代农业试验示范基地进行。

栽培配方为棉籽壳88%、10%麸皮、石灰2%。

参考Du等[13]的方法，收集培养30 d（发菌完成期，MM）、40 d （原基期，MP）和42 d（子实体分化期，MF）的菌丝体（图1），每9个栽培袋收集的样品置于1个无菌离心管中，作为1个试验重复，共设置3次重复。

样品用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.3 样品处理
将冷冻干燥的样品置于2 mL研磨管中，加入2颗钢珠，研磨机（MM-400，Retsch，德国）30 Hz研磨1.5 min。

称取100 mg冻干粉加入1.2 mL 70%甲醇（-20 ℃预冷，色谱级），涡旋振荡，样本置于4 ℃冰箱过夜。

离心（4 ℃，12 000 r‧min-1，10 min）收集上清液，经0.22 μm膜过滤后用于UPLC-ESI-MS/MS分析。

1.4 UPLC分析
采用装备有电喷雾离子源3重4极杆线性离子阱（electrospray ionization-triple quadrupole-linear ion trap，ESI-Q TRAP）（Nexera X2，Shimazdu，日本）的超高效液相色谱-电喷雾离子
源串联质谱仪（ultra performance liquid chromatography‐electrospray ionization-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）对样品进行分析。

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）（安捷伦科技有限公司，美国），柱温40 ℃，进样量4 μL。

流动相为0.1%甲酸的水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）。

流动相梯度：0～9.0 min，95%～5% A；9.0～10.1 min，5% A；10.1～11.1 min，5%～95% A；11.1～14.0 min，95% A，流速0.3 mL·min-1。

1.5 ESI-Q TRAP-MS/MS分析
AB4500 Q TRAP UPLC-MS/MS系統与ESI Turbo离子喷雾接口耦合，在负离子和正离子模式下由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex）控制。

电喷雾离子源，涡轮喷雾温度550 ℃，离子喷雾电压为-4500 V（负离子模式）和5500 V（正离子模式）。

离子源气体I、II（GSI、GSII）和幕气（curtain gas，CUR）的压力分别为50、60和6.9 kPa（25 psi）；碰撞激活解离（collision-activated dissociation，CAD）设置为高。

以氮气为中间碰撞气体，采用多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）进行3重4极扫描试验。

对单个多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）跃迁进行了进一步的聚类势（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）优化。

根据各时期代谢物的洗脱情况，检测出一组特定的MRM离子对。

Key words： Pleurotus ostreatus; Metabonomics; Mycelia; Differential metabolites; Fruiting body development
食用菌因具有丰富的营养、独特的风味以及广泛的生物学活性而被认定为“新一代食
物”[1]。

食用菌具有热量低、膳食纤维和蛋白质含量高的优点，并且还含有各年龄段人群所需要的氨基酸、矿物质和维生素等，而这些通常是植物来源食品中所缺乏的[2]。

此外，食用菌还具有调节免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等功能[3]。

因此，食用菌常被用作营养丰富的食品、补充剂、保健品以及医药制品等的原料[4]。

中国是食用菌生产大国。

目前，我国可栽培食用菌大约有967种，几乎占世界可栽培食用菌种类的50%，其中已实现商业化栽培的有60多种[5]。

2021年我国食用菌年产量达到4 133.94万t，比2020年增长了1.79%，总产值达到3 475.63亿元，比2020年增长0.29%[6]。

食用菌已经是我国继粮、菜、果、油之后的第五大农作物[5]。

食用菌子实体的形成与自身发育的分子机制密切相关，对食用菌的产量和品质有重要影响[7]。

食用菌在生长发育过程中，菌丝通过分解培养料中的木质纤维素、蛋白质、多糖等高分子物质，产生大量的低分子代谢物以满足子实体所需[8]。

据报道，有10万多种特有代谢物如多糖、黄酮、脂质、萜类、酚类等广泛存在于各種食用菌菌丝体中，作为食用菌营养来源或生长发育调控物质[9]。

研究表明，谷氨酸在亚洲兰茂牛肝菌原基发育中起重要调控作用[10]。

羊肚菌营养生长过程中，脂肪酰基类物质在羊肚菌菌丝体内的主要功能为能量贮存，胺类物质参与羊肚菌生长发育、子实体成熟，吡啶类物质可提高羊肚菌的抗病能力[9]。

L-精氨酸可能参与
牛樟芝的解毒、保肝作用[11]。

因而，有必要对食用菌菌丝生长发育过程中的代谢产物进行深入研究。

平菇是我国第三大食用菌栽培种类，具有经济价值高、栽培技术简单、栽培原料来源广泛的优点[12]。

目前我国平菇栽培主要是以玉米芯、棉籽壳、秸秆等为主料制成的栽培袋对平菇生长进行营养供应[8]。

栽培袋营养供应不足会导致平菇出菇率低、子实体发育受限；营养供应过剩可能会导致资源浪费或增加其他杂菌的污染概率。

因此，明确平菇菌丝生长对养分的需求规律，了解各个代谢物在平菇生长发育中的作用，有助于精准化控制平菇所需栽培料，为找到平菇适宜栽培代料或混配配方提供理论依据。

代谢组学是对一个生物系统的所有代谢物进行定性和定量的全面分析，并能揭示生物系统的一门科学[9]。

代谢组学的出现使人们更好地理解作物在受到刺激或生长发育过程中代谢过程的变化，通过标志性代谢的挖掘与验证，可以从代谢物角度找到调节作物生长发育的重要调控剂[13-14]。

因此，笔者通过非靶向代谢组学对发菌完成期、原基期及子实体分化期的平菇菌丝体进行代谢组学分析，以明确平菇生长发育过程中子实体形成的代谢物基础，探索平菇子实体发育机制，为平菇栽培提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试菌株
豫黑平16（品种权号：CNA20191002079），保藏于河南省食用菌种质资源库。

1.2 样品收集
平菇栽培试验于2022年2－5月在河南现代农业试验示范基地进行。

栽培配方为棉籽壳88%、10%麸皮、石灰2%。

参考Du等[13]的方法，收集培养30 d（发菌完成期，MM）、40 d （原基期，MP）和42 d（子实体分化期，MF）的菌丝体（图1），每9个栽培袋收集的样品置于1个无菌离心管中，作为1个试验重复，共设置3次重复。

样品用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.3 样品处理
将冷冻干燥的样品置于2 mL研磨管中，加入2颗钢珠，研磨机（MM-400，Retsch，德国）30 Hz研磨1.5 min。

称取100 mg冻干粉加入1.2 mL 70%甲醇（-20 ℃预冷，色谱级），涡旋振荡，样本置于4 ℃冰箱过夜。

离心（4 ℃，12 000 r‧min-1，10 min）收集上清液，经0.22 μm膜过滤后用于UPLC-ESI-MS/MS分析。

1.4 UPLC分析
采用装备有电喷雾离子源3重4极杆线性离子阱（electrospray ionization-triple quadrupole-linear ion trap，ESI-Q TRAP）（Nexera X2，Shimazdu，日本）的超高效液相色谱-电喷雾离子源串联质谱仪（ultra performance liquid chromatography‐electrospray ionization-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）对样品进行分析。

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）（安捷伦科技有限公司，美国），柱温40 ℃，进样量4 μL。

流动相为0.1%甲酸的水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）。

流动相梯度：0～9.0 min，95%～5% A；9.0～10.1 min，5% A；10.1～11.1 min，5%～95% A；11.1～14.0 min，95% A，流速0.3 mL·min-1。

1.5 ESI-Q TRAP-MS/MS分析
AB4500 Q TRAP UPLC-MS/MS系统与ESI Turbo离子喷雾接口耦合，在负离子和正离子模式下由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex）控制。

电喷雾离子源，涡轮喷雾温度550 ℃，离子喷雾电压为-4500 V（负离子模式）和5500 V（正离子模式）。

离子源气体I、II（GSI、GSII）和幕气（curtain gas，CUR）的压力分别为50、60和6.9 kPa（25 psi）；碰撞激活解离（collision-activated dissociation，CAD）设置为高。

以氮气为中间碰撞气体，采用多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）进行3重4极扫描试验。

对单个多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）跃迁进行了进一步的聚类势（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）优化。

根据各时期代谢物的洗脱情况，检测出一组特定的MRM离子对。