免疫学及免疫学检验
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①性质活泼、易制备标记物 ②对被标记物的免疫活性影响小 ③测量方法简便、已推广 ④半衰期较长、核素丰度高
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免疫学及免疫学检验
标记方法
125I的标记 原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基
及组胺残基上的氢原子 方法： 直接标记法
氯胺T法和乳过氧化物酶法
间接标记法 联接标记法
示踪物及 标记技术
放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光技术 金免疫技术
⋯⋯⋯
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免疫学及免疫学检验
第八章 放射免疫技术
类型：
放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric
assay,IRMA）
特异性
其程度可直接影响结果的准确性
滴度
最大稀释度。在本技术方法中是指结合50％标记抗原时的
抗血清的稀释度。
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免疫学及免疫学检验
放射免疫分析（ RIA ）
基本原理
采用定量的标记抗原（Ag＋）和非 标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异 性抗体（Ab）的反应。
标记免疫技术
医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO四年三月
免疫学及免疫学检验
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
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免疫学及免疫学检验
标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
免疫学及免疫学检验
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免疫学及免疫学检验
IRMA与RIA的异同点
标记物 在RIA中 核素标记抗原，抗原有不同种类，根
据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在 IRMA中 核素标记抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标记， 不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了 分析的灵敏度。
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免疫学及免疫学检验
免疫放射分析（IRMA）
基本原理
单位点IRMA： 利用过量标记抗体与 待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合 物，反应平衡后，用固相抗原结合反应 液中剩余的未结合标记抗体并将其分离， 测定上清液的放射量。
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免疫学及免疫学检验
适用分子 原理
特点
缺点
直接标记 肽类、蛋 存在酪氨 操作简便、不适于活
白质、酶 酸、组胺 易标记、 性功能区
残基等基 比放射性 的残基标
团
高
记
间接标记
甾类化合 不存在酪 可避免氧
物、核苷 氨酸、组 化／还原
酸等小分 胺残基等 剂对被标
反应速率 反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中
标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所 以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要 用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单 克隆体也能得到满意的结果。
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50
40 30
20
10
0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 5.6 来自wwwA.3g7(2库n2.gc下n/中m载国l)最大的资料
免疫学及免疫学检验
测定方法与步骤
1.抗原抗体反应：平衡法或非平衡法 2.分离结合与游离标记物
沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、 聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻 底，迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作 简便，重复性好且经济。 3.放射性测定及数据处理 晶体闪烁计数仪(γ射线)或液体闪烁计数仪( β射线) 绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。
免疫学及免疫学检验
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免疫学及免疫学检验
双位点IRMA 先用固相抗体与抗原 反应结合,然后再用过量的标记抗体 与已结合于固相抗原的另一抗原决 定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记 抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标 记抗体,测定固相上的放射性。
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比放射性↑ 方法更灵敏；过高 免疫活性影响大，储存稳定性差 。
辐射自损伤大，对标记物
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免疫学及免疫学检验
抗血清鉴定
多克隆抗体的抗血清是放射免疫分
析的主要试剂之一，其质量直接影响方 法的特异性和灵敏度。
亲合力
选用亲和常数K值大(109~1012 L//mol)抗血清
免疫学及免疫学检验
标记物鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
放射化学纯度 单位标记物中结合在被标记物上的放射性
占总放射性的百分率。一般要求大于95％。
免疫活性
标记过程中，被标记物活性损伤程度。B/T％>80％，
B/T％ ↑ 抗原损伤↓。
比放射性
单位化学量标记物中所含的放射性强度. 常用Ci/g、
mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。
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免疫学及免疫学检验
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免疫学及免疫学检验
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免疫学及免疫学检验
以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F 与Ag的量变存在着函数关系。
B/F 60 (％)
广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结 合分析（使用配体研究受体）。
特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、 重复性好等 来自中国最大的资料
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免疫学及免疫学检验
标记物:
常用的核素有两大类 γ射线： 131I、125I、57Cr和60Co β射线：14C、3H和32P。 使用最广泛的是：125I
子化合物 基团,需 记物活性
添加
的损伤等
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添加基团 可能影响 被标记物 活性
免疫学及免疫学检验
标记物纯化
对游离的125I等试剂与标记物 进行分离
方法：分子筛凝胶过滤；离子 交换层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）；高效液相色谱（HPLC）
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标记方法
125I的标记 原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基
及组胺残基上的氢原子 方法： 直接标记法
氯胺T法和乳过氧化物酶法
间接标记法 联接标记法
示踪物及 标记技术
放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光技术 金免疫技术
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免疫学及免疫学检验
第八章 放射免疫技术
类型：
放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric
assay,IRMA）
特异性
其程度可直接影响结果的准确性
滴度
最大稀释度。在本技术方法中是指结合50％标记抗原时的
抗血清的稀释度。
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放射免疫分析（ RIA ）
基本原理
采用定量的标记抗原（Ag＋）和非 标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异 性抗体（Ab）的反应。
标记免疫技术
医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO四年三月
免疫学及免疫学检验
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
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标记免 疫技术
免疫组 化技术
免疫测 定技术
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IRMA与RIA的异同点
标记物 在RIA中 核素标记抗原，抗原有不同种类，根
据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。在 IRMA中 核素标记抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标记， 不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了 分析的灵敏度。
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免疫放射分析（IRMA）
基本原理
单位点IRMA： 利用过量标记抗体与 待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合 物，反应平衡后，用固相抗原结合反应 液中剩余的未结合标记抗体并将其分离， 测定上清液的放射量。
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适用分子 原理
特点
缺点
直接标记 肽类、蛋 存在酪氨 操作简便、不适于活
白质、酶 酸、组胺 易标记、 性功能区
残基等基 比放射性 的残基标
团
高
记
间接标记
甾类化合 不存在酪 可避免氧
物、核苷 氨酸、组 化／还原
酸等小分 胺残基等 剂对被标
反应速率 反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中
标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所 以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要 用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单 克隆体也能得到满意的结果。
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0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 5.6 来自wwwA.3g7(2库n2.gc下n/中m载国l)最大的资料
免疫学及免疫学检验
测定方法与步骤
1.抗原抗体反应：平衡法或非平衡法 2.分离结合与游离标记物
沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、 聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻 底，迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作 简便，重复性好且经济。 3.放射性测定及数据处理 晶体闪烁计数仪(γ射线)或液体闪烁计数仪( β射线) 绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。
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双位点IRMA 先用固相抗体与抗原 反应结合,然后再用过量的标记抗体 与已结合于固相抗原的另一抗原决 定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记 抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标 记抗体,测定固相上的放射性。
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辐射自损伤大，对标记物
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抗血清鉴定
多克隆抗体的抗血清是放射免疫分
析的主要试剂之一，其质量直接影响方 法的特异性和灵敏度。
亲合力
选用亲和常数K值大(109~1012 L//mol)抗血清
免疫学及免疫学检验
标记物鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
放射化学纯度 单位标记物中结合在被标记物上的放射性
占总放射性的百分率。一般要求大于95％。
免疫活性
标记过程中，被标记物活性损伤程度。B/T％>80％，
B/T％ ↑ 抗原损伤↓。
比放射性
单位化学量标记物中所含的放射性强度. 常用Ci/g、
mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。
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免疫学及免疫学检验
以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F 与Ag的量变存在着函数关系。
B/F 60 (％)
广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结 合分析（使用配体研究受体）。
特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、 重复性好等 来自中国最大的资料
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标记物:
常用的核素有两大类 γ射线： 131I、125I、57Cr和60Co β射线：14C、3H和32P。 使用最广泛的是：125I
子化合物 基团,需 记物活性
添加
的损伤等
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添加基团 可能影响 被标记物 活性
免疫学及免疫学检验
标记物纯化
对游离的125I等试剂与标记物 进行分离
方法：分子筛凝胶过滤；离子 交换层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）；高效液相色谱（HPLC）
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