外植体预处理对胡桃楸成熟胚不定芽的诱导

外植体预处理对胡桃楸成熟胚不定芽的诱导
张建瑛;殷东生;葛文志;田新华;李京;祁永会
【摘要】以胡桃楸成熟胚为外植体,研究了外植体消毒及培养预处理(低温、暗培养)对胡桃楸不定芽诱导的影响.结果表明:外植体消毒处理中以紫外线直射5 min+0.1％HgCl28 min处理效果好于其他处理,染菌率为13.45％,褐化率为22.78％.培养预
处理中暗培养随着时间延长愈伤组织诱导率增加.低温处理是随着时间延长呈现抛
物线形式,先升后降,低温14 d的愈伤组织诱导率最高,为42.71％.经过预处理后,在低温处理14 d的不定芽诱导率最高,为42.8％.随着种子贮存年限的延长,胡桃楸发芽率、愈伤组织诱导率、不定芽诱导率越低.
【期刊名称】《东北林业大学学报》
【年(卷),期】2019(047)002
【总页数】4页(P21-24)
【关键词】胡桃楸;外植体预处理;成熟胚;不定芽
【作者】张建瑛;殷东生;葛文志;田新华;李京;祁永会
【作者单位】黑龙江省林业科学研究所,哈尔滨,150081;黑龙江省林业科学研究所,
哈尔滨,150081;黑龙江省林业科学研究所,哈尔滨,150081;黑龙江省林业科学研究所,哈尔滨,150081;黑龙江省林业科学研究所,哈尔滨,150081;黑龙江省林业科学研
究所,哈尔滨,150081
【正文语种】中文
【中图分类】S718.3
胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)，为胡桃科胡桃属落叶乔木[1-2]，是我国北方地区珍贵的用材林和经济林树种，木材材性优良，利用价值高；果实营养丰富，食用价值高；树体(根、茎、叶等)化学成分丰富，药用价值高。

被列为国家Ⅱ级珍稀树种和中国珍稀濒危树种的三级保护植物[3]。

近些年，随着人们对胡桃楸制作
的家具、果实外表皮青衣的药用、果仁营养的重视，人工栽植面积开始不断增加。

胡桃楸育苗的传统生产模式还是以播种繁殖为主，由于胡桃楸属于深休眠种子，存在着休眠处理方法、出苗率、变异性等多种问题。

尤其是多年来筛选出的优良性状靠种子无法得到持续的保持，为此无性繁殖无论从繁殖系数的扩增还是性状的保持都表现出超高的优越性。

到目前为止，胡桃楸的无性繁殖主要以扦插和组织培养为主，在扦插方面大量学者展开诱导生根及影响因素、机理等研究[4-7]，发现胡桃楸扦插生根率低、插条要
求和时间要求高、移栽成活研究不系统等问题；在组织培养方面同样也进行了很多研究[8-12]，并取得了一定的进展。

植物组织培养具有不受时间限制、占地空间小、扩繁系数大等优点，与其他方式相比利用此途径来解决苗木短缺、培育良种等具有超高的性价比。

为此，笔者以胡桃楸成熟合子胚为外植体，就外植体的预处理对胡桃楸如何诱导出不定芽的影响因子进行了研究，以期为建立高效的不定芽诱导植株再生体系奠定基础，为胡桃楸育种改良、生物技术研发等提供丰富的材料与基础。

1 材料与方法
材料为2015年、2016年、2017年的9月份黑龙江省尚志市东北林业大学帽儿
山林场内采集的胡桃楸种子。

采集后，晾晒、去除外表皮，放置于温度20～25 ℃条件下干燥、通风处备用。

接种前，用锤子将外壳打碎，取胡桃楸种子尖部那端带少量子叶的合子胚为诱导不定芽的外植体。

外植体消毒预处理：取2017年种子内的合子胚，用70%酒精表面消毒30 s后采
用7种不同消毒方法进行消毒。

①0.1% HgCl2 6 min；②0.1% HgCl2 8 min；
③0.1% HgCl2 12 min；④2% NaClO 5 min+0.1% HgCl2 6 min；⑤2% NaClO 5 min+0.1% HgCl2 8 min；⑥紫外线直射5 min+0.1% HgCl2 6 min；
⑦紫外线直射5 min+0.1% HgCl2 8 min。

进行完以上消毒后，再用无菌水冲洗4～5遍。

将外植体接种在DKW空白培养基上(附加蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L，pH=5.8)，每处理10个外植体，重复3次。

半个月后，统计污染率、死亡率、褐化率。

外植体培养预处理：外植体消毒后，将2015年、2016年、2017年的合子胚进行暗培养(3、7、14、21 d)、低温处理(3、7、14、21 d)，共8个处理，每个处理接种10瓶，每瓶3个合子胚，培养基均为DKW(改良)+6-BA2.0 mg·L-
1+IBA0.01 mg·L-1，蔗糖30 g·L-1，琼脂6 g·L-1，pH值为5.8。

将预处理过的外植体转入DKW(改良)培养基中，附加6-BA质量浓度2.5 mg·L-1和IBA质量浓度0.02 mg·L-1进行培养。

每个处理接种10瓶，每瓶3个，附加AD 10 mg·L-1、CH 500 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1，琼脂6 g·L-1，pH值为5.8，温度(25±2)℃，光照强度2 000 lx，光照时间14 h/d。

数据分析：利用Excel 2003软件、SPSS17.0软件记录和统计数据，采用Duncan多重比较法进行差异显著性分析。

愈伤组织诱导率=(诱导出愈伤的外植体数/接种的外植体总数)×100%；
不定芽诱导率=(诱导出不定芽的外植体数/接种的外植总体数)×100%。

2 结果与分析
2.1 消毒方法对胡桃楸外植体消毒的影响
外植体消毒处理的好坏对植物组织培养有一定的影响。

以胡桃楸成熟胚为外植体进行消毒，7个不同处理结果也不一致(表1)。

在不添加其他辅助处理时，随着HgCl2消毒时间的延长染菌率下降，从67.29%到44.58%，降低22.71%，但是
外植体褐化率增加了26.28%。

这主要是因为消毒时间的延长导致外植体内部组织的受伤，醌类物质的释放形成了褐化。

添加了2% NaClO、紫外线直射显著降低
了染菌率，处理⑦(紫外线直射+0.1% HgCl2)染菌率最低为13.45%，低于处理
①(0.1% HgCl2 6 min)53.84%。

从褐化率看，添加2% NaClO的处理
④(55.00%)、处理⑤(54.94%)之间的褐化率差异不显著，处理⑥、处理⑦显著好
于其他处理，以处理⑦最好(22.78%)。

这说明短暂的紫外线照射可以减低染菌率
的同时也不至于褐化率过高。

表1 不同消毒方法对外植体的影响处理消毒方法消毒时间/min染菌率/%褐化率/%10.1% HgCl2667.29a37.85e20.1% HgCl2846.16bc49.51d30.1%
HgCl21244.58d64.13a42% NaClO+0.1% HgCl21146.29b55.00b52%
NaClO+0.1% HgCl21344.84de54.94bc6紫外线直射+0.1%
HgCl21127.14f25.00f7紫外线直射+0.1% HgCl21313.45g22.78g
注：“染菌率”、“褐化率”项，同列不同小写字母表示差异显著(p=0.05)。

2.2 预处理对胡桃楸愈伤组织的影响
将胡桃楸成熟胚接种后按不同的预处理方式培养，产生的结果也不相同(见表2)。

暗培养中，随着时间的延长在成熟胚的胚根端(基部)开始产生愈伤组织，愈伤组织也随着时间延长由开始淡黄色松散的转变成褐色致密的愈伤组织。

愈伤组织的诱导率随着培养时间加长体现出上升的趋势，尽管培养21 d比14 d诱导率高，达30.6%，但是14 d和21 d之间差异不显著；只是在状态上，21 d产生的愈伤组
织增加，表面也开始变得致密。

低温处理下的外植体产生愈伤组织的诱导率差异显著，低温处理14 d效果好于其他外植体胚轴处变红，少量愈伤组织出现(如图1)，为42.71%；当处理达到21 d时，外植体开始大部分表面大部分褐化。

可见，8
个预处理下，低温培养14 d愈伤诱导率最高。

图1 低温预处理21 d外植体的状态表2 不同预处理对外植体愈伤诱导的影响
处理暗培养时间/d低温处理时间/d愈伤诱导率/%状态00f 外植体无反应130f 外植体无反应273.13e外植体基部开始膨大,个别产生愈伤组织31428.94bc外植体基部出现淡黄色、松软愈伤组织42130.60b愈伤组织开始变得致密530f 外植体无反应670f 外植体仅有少量基部开始膨大71442.71a外植体胚轴处变红,少量愈伤组织出现82120.65d产生愈伤组织的外植体褐化、死亡
注：“愈伤诱导率”项，同列不同小写字母表示差异显著(p=0.05)。

2.3 不同预处理对胡桃楸不定芽诱导的影响
将经过预处理后的外植体移至光下观察不定芽发生情况，培养30 d后，结果见表3。

表3 不同预处理对外植体不定芽诱导的影响处理暗培养时间/d低温处理时间/d不定芽诱导率/%状态CK5.8e个别形成单独小苗,无不定芽出现131.7fg外植体表面膨大、变绿271.9f个别形成单独小苗,无不定芽出现31437.3b外植体愈伤中胚芽伸张,基部变粗形成不定芽42113.3c形成致密的绿色愈伤团,少量不定芽出现531.7fg外植体表面膨大、变绿672.0f个别形成单独小苗,无不定芽出现71442.8a外植体胚轴粗大,胚芽伸展,形成大量不定芽82112.5cd产生愈伤组织的外植体褐化、死亡
注：“不定芽诱导率”项，同列不同小写字母表示差异显著(p=0.05)。

无论暗培养还是低温预处理下，0、3 d预处理的外植体移至光下，外植体表面膨大、变绿，最后个别形成单独小苗，无不定芽诱导出。

在对不定芽诱导时观察到，带愈伤外植体在培养7 d左右时从愈伤中合子胚胚芽伸展出来(图2)，之后愈伤颜色逐渐褐化胚芽变绿、变粗(图3)。

在培养了20 d左右外植体的褐色愈伤中胚芽基部开始长出不定芽(图4)，30 d外植体形成了多个不定芽(图5)，最后形成小苗(图6)，有的外植体基部出现大量褐化现象(图7)。

在暗培养中有致密愈伤形成后移至光下也不再发生不定芽，只是形成致密的绿色愈伤团。

低温培养14 d不定芽
诱导率最高，为42.8%，显著高于其他预处理，可见低温预处理对不定芽诱导起
很大作用。

图2 经过预处理后移至光下7 d不定芽
图3 经过预处理后移至光下14 d不定芽
图4 经过预处理后移至光下21 d不定芽
图5 经过预处理后移至光下30 d不定芽
图6 不定芽形成的小苗
图7 分化的不定芽
2.4 种子年限对胡桃楸不定芽诱导的影响
种子年限对外植体预处理也有影响(表4)。

随着种子存放时间的延长，种子自身的
发芽率也随着降低，2015年最低，为60.0%；2017年最高，达83.0%，高出2015年13%。

经过预处理后等到的愈伤诱导率与不定芽诱导率也呈现相同的趋势，随着种子年限的延长而差异显著递减。

2017年采集的当年的种子经过处理不定芽诱导率最高为42.8%。

表4 不同年限对外植体不定芽诱导的影响采种年份种子发芽率/%愈伤诱导率/%不定芽诱导率
/%201560.0c6.93c9.5c201675.0b10.36b39.7b201783.0a12.71a42.8a
注：同列不同小写字母表示差异显著(p=0.05)。

3 结论与讨论
外植体预处理对植物的离体培养存在着影响，这在很多植物中都有体现，如非洲菊[14]、大枣[15]、花楸[16]等，预处理的方式有暗环境、低温处理、切割外植体(创伤)[17]、改变渗透压[18]等。

对于胡桃楸来说，低温预处理14 d效果好于其他达42.71%，外植体基部形成少量愈伤组织，胚轴处发红，这可能因为胡桃楸属于休
眠性种子，低温处理作为信息传递的作用形成一种逆境迫使细胞改变正常的发育方
向而转向脱分化的发育[19]111-136。

同时发现经过预处理后低温预处理14 d诱
导出不定芽诱导率也是最高的，为42.8%。

这可能与低温对种子萌发有促进作用，能够加快不定芽诱导速度。

另外，外植体的消毒处理是众多学者研究植物组织培养的提前基础。

通过不同处理，紫外线直射5 min+0.1% HgCl2 8 min效果好于其他，说明短暂的紫外线照射可以减低染菌率，这与赵丽蒙研究中发现紫外线照射降低染菌率结论一致[20]。

采种的时间对植物不定芽诱导也有着一定影响[21]。

随着发芽率的降低而降低，这是由于自身内含物质活性的降低而诱导不定芽的潜力丧失。

同时，胡桃楸在组织培养的过程中因自身醌类物质含量高容易褐化，通过研究发现胡桃楸不定芽的诱导中伴随着褐化情况的产生，不定芽发生在带有褐化的愈伤外植体上，其原因与生理相关研究还没有报道，可进一步开展研究。

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