DIG标记+原位杂交 实验流程-化-2015.5.11

地高辛标记的CRNA探针合成实验流程
1.CDNA文库的构建
2.PCR扩增目的基因
3.二次PCR扩增带T7启动子的目的基因
4.体外转录合成地高辛标记CRNA探针
1.CDNA文库的构建
1.MRNA的分离纯化（使用无RNase物品）
i.取两个1ml玻璃匀浆器，分别加入1ml RNAiso Plus（通风橱操作）。

快速取
出鼠脑，冰上操作。

新鲜的脑组织一半，分别加入两个1ml玻璃匀浆器中，
分别加入，放入玻璃匀浆器，冰浴匀浆。

ii.将匀浆液转移至离心管中，室温（15-30℃）静置5 分钟。

iii.12,000 g 4℃离心5 分钟。

iv.小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。

v.EP管中加入氯仿200ul（RNAiso Plus 的1/5 体积量），盖紧离心管盖，剧
裂震荡，混合至溶液乳化呈乳白色。

vi.室温静置5 分钟。

vii.12,000 g 4℃离心15 分钟。

从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为
三层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）
及带有颜色的下层有机相。

viii.吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。

ix.向上清中加入0.5-1 倍RNAiso Plus 体积的异丙醇500ul，上下颠倒，轻柔
操作，离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。

x.4℃12,000 g离心10 分钟。

一般在离心后，试管底部会出现RNA 沉淀。

小心弃去上清, 切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。

xi.加入与RNAiso Plus 等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁;
xii.7,500×g ，4℃，离心5 分钟，小心弃去上清，切勿触及沉淀。

xiii.通风橱中干燥3—5min；切不可加热干燥；
xiv.加入20—30ul的DEPC处理的ddH20，静置2min，吹打均匀，每管分装5ul，
-80度冰箱保存。

总RNA的鉴定：
一、1%的琼脂糖凝胶电泳
二、紫外分光光度计，测在260nm/280nm，计算RNA的浓度和纯度
OD260/280在1，7----2.0之间即可。

浓度一般应在200ng/ul以上。

2.RT-PCR逆转录为CDNA
1）在PCR管中进行，PCR仪设定程序
a.Oliga （dT）15 1ul （TAKARA，code3805；LOT T801BA）
b.RNA （1ng—5ng）根据提取的RNA的浓度来计算加入量
c.10nM DNTP Mix 1ul （天根）
d.DEPC H2O 补足12ul
65℃5min后，立即冰浴，轻甩。

2）依次加入
a.5x first-strand buffer 4ul （invitrogen，lot NO 991492）
b.0.1M DTT 3ul （invitrogen，1305658）
c.RNsin（RNase inhibitor）1ul （Thermo，40U/ul，lot，00177417）
混匀后，37度2min
3）加入
1ul M-MLV（200U/ul，invitrogen，40，000U，lot NO 1620180）混匀
37℃50min 70℃15min，-20℃保存。

PCR程序：
程序一：65℃2min//65℃5min//4度
程序二：37℃1min//37度2min
程序三：37度5min//37度5min 37度40min//70度15min//4度hold
3. PCR 扩增目的基因
a. 稀释引物。

先将引物离心12000g 5min ； 按照10uM 的浓度稀释，加入相应的ddH2O ；静置5min
后，混匀；12000g ，离心5min 。

b.
C ．PCR 扩增程序：
（根据PCR 产物大小，条带特异性，调整吐火温度和延伸时间）
D ．琼脂糖凝胶电泳：
1%的gel 0.3g 琼脂糖 30ml 1X TAE 缓冲液
微波炉加热1min ，溶解后，加入3ul EB （有毒，带一次性手套操作），混匀后倒入胶板中，
梳子提前插入20—30min 后，完全凝固后，取出梳子，带着底板移入电泳槽中，上样孔侧在黑色负极端，上样（5ulpcr 产物+1ul loading buffer ），130mv 电泳20min ，观察结果，拍照。

94℃ 3min
94℃ 30sec 55℃/58℃ 30sec
72℃ 30sec 35cycles
72℃ 10min 4℃ hold
ddH2O
20 7 Primer F （10uM ）
2 1 Primer R （10uM ） 2 1 Taq MIX （康为试剂） 25 10 每管 49ul 19ul
CDNA
1ul
0.5ul
E．琼脂糖凝胶DNA产物回收：
1%的琼脂糖凝胶电泳
130mv 电泳20min，10ul的枪头上样，减少回吸
在凝胶观察箱体中切胶回收
准备高压过1.5ML EP管，做好标记，将胶切下放入ep管中每管加入450ul溶胶液buffer B2，55℃ 干浴15min，间断混匀，至完全溶解加入1/3体积的异丙醇（小于500bp，大于500bp无需此步骤）150ul，混匀后离心
混合液吸入吸附柱，静置5min，尽量吸附多的DNA产物，8000g，离心30sec，可将离心液重新移入吸附柱，重复一次，8000g，30sec离心
加入溶胶液buffer B2 300ul 9000g 30sec，冲去多余的胶
Wash solution 500ul 9000g 30sec 重复一次，弃离心液
将空吸附柱离心，去掉多余乙醇，9000g 1min
55℃ 开盖烘5min，或者室温风干30min
用DEPC处理的ddH2O溶解，加样到吸附柱的白色滤芯上，每管20-25ul，55℃干浴箱，盖上盖10min，充分溶解后，13000g 2min 离心
将产物-20℃保存，备用，或者做体外转录
4.二次PCR扩增带T7启动子的目的基因，8个50ul体系，然后胶回收PCR产物，
测浓度后进行体外转录。

A：Forward primer
B：Rerverse primer
C：保护碱基+T7启动子序列+Rerverse primer
T7 Promotor 序列：TAATACGACTCACTATAGGGAGA
保护碱基序列：CAGTGAATTG
一般浓度在400—900ug/ul，OD260/280在1.7—2.0之间。

NOTE：
A+B primer从CDNA中扩增出所需序列
A+C Primer以PCR产物胶回收产物为模版扩增出带T7启动子的序列。

4体外转录合成地高辛标记CRNA探针
（使用无RNase物品）
一/在1.5ML EP管中进行 RNASE-free
a.5x buffer 2ul
b.0.1M DTT 1ul
c.DIG-labeling MIX 1ul （ROCHE）
d.RNasin 0.25ul
e.T7 Polymerase 0.5ul （Promega）
f.PCR扩增产物 5.25ul
10ul 体系，混匀后，37℃水浴，2h
二/ 加入1 ul DNase I（PROMEGA，1U/UL），37度5min
三/ 加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀2h以上，-20℃沉淀，可沉淀过夜。

四/ 4℃12000x g 5min 离心后可见RNA沉淀
五/ 现用现配75%的乙醇洗，冲洗沉淀，7500g 4℃5min
六/ 弃上清，保留沉淀，通风橱中干燥5min，不可加热。

七/ 根据沉淀大小，加入20—30ul DEPC H2O 溶解，静置2min，吹打均匀。

八/ 检测探针大小和浓度，然后放-80℃保存。

（1）紫外分光光度计测浓度。

a.开机，选择RNA
b.冲洗比色皿，用depc H20 冲洗干净，加入98ul DEPC-H20，RNA—BLANK
c.加入RNA 样品2ul，混匀后，点击按键‚dilution‛，点击‚2‛‚ENTER‛‚98‛‘ENTER’
d.点击按键‚sample‛，显示浓度？ng/ul ，记录OD260/280和样品浓度。

（2）琼脂糖凝胶电泳观察条带大小。

鼠脑片原位杂交+免疫荧光实验流程：
第一天：（需要使用无RNAse的物品）
1.切片。

振动切片40um。

鼠脑后固定在DEPC-PBS 4% PFA 4℃冰箱过夜后振动切片，将脑片放入24孔板中。

2.4%PFA（DEPC PBS配）室温固定10min。

3.1X DEPC-PBS 洗3次，每次5分钟。

4.蛋白酶K（2ug/ml）室温消化20min
Pk buffer：1M TRIS-HCL PH 8.0 5ML
0.5M EDTA 1ML
DEPC H2O 定容到100ml
5.4% PFA 固定室温10min
6.1X DEPC-PBS 洗3次，每次5分钟
7.乙酰化处理室温10min，震荡。

乙酰化试剂按照顺序加入：
DEPC H2O 197ML 19.7ml 1.97ml
三乙醇胺 2.66ml 266ul 26.6ul
浓盐酸350ul 35ul 3.5ul
乙酸酐500ul 50ul 5ul
总体积200ml 20ml 2ml
（现用现配）
8.PBT（PBS+1% Triton）室温30min
9.DEPC-PBS 3次x 5min
10.预杂交（保存-20度取出）,先润洗每管200ul，预杂交每管300ul，杂交温度根据探针而异。

（50
度——65度），预杂交1-3h。

1/ 甲酰胺25ml
2/ 20XSSC 12.5ml
3/ 20%Tween20 250ul
4/ DEPC-H20 定容到50ml
11.杂交，温度根据探针而已，50℃~65℃，杂交时间16-20h。

一般使用60℃。

12.（探针使用之前先80度变性10min，立即冰浴5min，离心后加入每管200-300ul）A）甲酰胺12.5ml
B）20XSSC 5ML
C）20%Tween20 100ul
D）肝素钠100mg/ml 10ul
E）酵母TRNA 10mg
F）DEPC-H20 定容20ML
第二天：（探针回收后，就无需用无RNASE的物品）
1.回收探针，-20℃保存，可重复使用5~6次；
2.5x SSCT / 50%甲酰胺润洗一次；
3.2x SSCT / 50% 甲酰胺杂交温度水域1h；
4.2x SSCT 室温10min x 2次
5.RNASE buffer 室温10min
5M NaCL 5ml
1M Tris-Hcl（ph8.0）500ul
20%Tween20 250ul
DDH2O 定容到50ml
6.RNase solution 室温30min
RNase buffer 10ml
RNase A 10ul
7.2x SSCT 室温10min；
8.2x SSCT / 50% 甲酰胺杂交温度水浴1h；
9.2x SSCT 杂交温度水浴15min ；
10.0.2x SSCT 杂交温度水浴15min ；
11.1x PBST 室温5min
12.封闭1-2h；（封闭液：0.1g BSA 1ML 血清PBST定容到50ml -20℃保存）
13.Anti-Dig + AP Fab（1：500）封闭液稀释后，加入，4℃过夜。

第三天：
1.1X PBST 洗3次，每次30min，可增加次数和时间；转移到24孔板显色。

2.AP buffer 3次x 5min；
AP buffer：1M Tris-Hcl（PH 9.5）5ml 1ml 2ml
2M Mgcl2 1.25ml 250ul 500ul
5M NaCl 1ml 200ul 400ul
20%Tween20 250ul 50ul 100ul
0．4M 左旋咪唑125ul 25ul 50ul
DdH20 定容到50ml 10ml 20ml
3.NBT/BCIP（roche罗氏试剂）1：200稀释后室温避光显色，需要1h~8h，一个小时后，半个小时观
察一次。

4.显色结束，PBS/EDTA终止显色，2次x 3min。

0.5M EDTA 2ML 1ML
PBS 100ML 50ML
5.4% PFA 室温固定10min
6.1X PBS 3次x 5min；
7.免疫荧光封闭液封闭1-2h；
8.一抗4℃孵育过夜；
第四天：
1.一抗回收-20℃冻存；
2.1XPBS 5次x 5min；
3.荧光二抗室温90min；
4.1XPBS 5次x 5min；
5.DAPI封片（碧云天1：8000）
6.LSM710 成像。