人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植双荧光模型的建立重点

Ｐｒｏｊｅｃｔｓ ｏｆＸｉａｍｅｎ（２０１３Ｓ０００１）
万方数据
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脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的、预后较差 的原发性恶性肿瘤，占颅内肿瘤的５０％～６０％，即使 给予传统的手术联合放、化疗的综合治疗，低级别 胶质瘤患者的平均存活时间仅为３～５年，而高级别 胶质瘤为１～２年【”。因此，成熟可靠的动物模型，对 研究胶质瘤的发生发展以及有效的治疗，具有十分 重要的意义。目前国内外学者已经建立了多种胶质 瘤的动物模型［２－４］。其中裸鼠胶质瘤模型是发展较
ｇｌｉｏｍａｓ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｇｌｉｏｍａ；Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ
Ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；／ｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ；Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；
Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公
司），倒置相差显微镜（ＧＸ７１型，日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司），胎牛血清（德国ＰＡＮ公司），１００ ｇ／Ｌ多聚甲醛固 定液５
Ｌ。
万方数据
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剑
Ａ：）Ｉ【：＝镜ｒ：Ｂ：’尖圯”１：＆镜ｌ、；ＥＲＦＰ：增强型红笆芡）ｔ点¨ 图１体外培养５ ｄ的ＥＫＦＰ－Ｕ８７细胞（ｘ４００）
ａｓ
ｗｅｅｋ ａｆｔｅｒ ＥＲＦＰ・Ｕ８７ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｔｉｍｅ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ．ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｅｐ ｄｙｅｄ ｗｉｔｈ ｂｉｇ ｎｕｃｌｅｕｓ；ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ ｗｅｒｅ ａｔ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｐｈａｓｅ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌｓ
结果 表达ＥＧＦＰ 的裸鼠在活体成像系统下可见全身组织器官均带有绿色荧光。接种ＥＲＦＰ．Ｕ８７细胞后ｌ周于移植 部位可见红色荧光，且随时间的增加而增强。ＨＥ染色移植瘤组织显示肿瘤细胞较正常细胞深染，核
大，可见分裂相及多核：荧光显微镜下观察可见肿瘤组织与宿主基质分别呈现红、绿色荧光，肿瘤组 织与鼠脑组织界限不清，可见肿瘤发生血管，正常内皮细胞形成血管，部分管壁有肿瘤细胞包绕，肿 瘤组织中呈现绿色荧光。 结论双色荧光胶质瘤动物模型可作为胶质瘤基础研究的理想模型。 原位移植模型； 活体成像； 绿色荧光蛋白；红色荧光蛋白
【关键词】神经胶质瘤；
基金项目：厦门市科技惠民计划项目（２０１３Ｓ０００１） 【中图分类号１
Ｒ７３０．２６４
【文献标志码】Ａ
【文章编号】
１６７１—８９２５（２０１６）０６—０５５４—０４
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｂｙ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ
ｍＬ／ｌＯ
早、技术较成熟、可靠的一种。但是传统的裸鼠胶质
瘤模型无论Байду номын сангаас在研究胶质瘤的发生发展，或者观察
ｇ）
药物的治疗作用的过程中，都需要处死荷瘤小鼠，
耗费了大量的人力物力。另外，由于裸鼠的个体差 异，很难准确地反映肿瘤的生长情况。而一般的磁 共振（ＭＲｊ）显像研究也无法将实体瘤中的细胞、间 质和血管在活体中显现出来。近年来，随着动物荧 光成像技术的发展，动态观察胶质瘤生长情况的设 想成为了可能。因此，本研究在培育全身带有增强 型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）的裸鼠的基础上，把转染增 强型红色荧光蛋白ｆＥＲＦＰ）的人Ｕ８７细胞原位注射 到裸小鼠脑内，建立双荧光的胶质瘤裸鼠模型；并 且通过荧光成像技术，动态地观察胶质瘤在活体内 的发生发展，并在细胞水平上进一步分析肿瘤细胞 与宿主基质细胞间的关系，以期为探讨胶质瘤在体 内侵袭性生长的机制研究提供新的思路。 材料与方法 一、实验细胞和动物 表达ＥＲＦＰ的人Ｕ８７胶质瘤细胞（ＥＲＦＰ．Ｕ８７） 由厦门大学生命科学学院提供。雄性ＢＡＬＢ／ｃ
Ｙｕ
ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ
Ｍ够Ｌｉ
Ｚｈａｎｇｙｕ，Ｇａｏ Ｘｉｎ，Ｇｕｏ
Ｊｉａｎｆｅｎｇ，Ｃｈｅｎ Ｓｉｆａｎｇ，Ｚｈｕ
Ｈｏｎｇｗｅｉ，Ｙｅ Ｙｏｎｇｚａｏ，Ｔａｎ Ｇｕｏｗｅｉ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＸｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ａｕｔｈｏｒ：Ｔａｎ Ｇｕｏｗｅｉ，Ｅｍａｉｌ：ｇｗｔａｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｈｕｍａｎ Ｕ８７ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＲＦＰ）ａｎｄ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ｔｈｅｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｃａｕｄａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ．
Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
３６１００３，Ｃｈｉｎａ
ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ
ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌｉｏｍａｓ．
ｅｎｊｏｙｅｄ
ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｏｕｎｄａｒｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗａｓ ｎｏｔ ｃｌｅａｒ，ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｖｅｓｓｅｌｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗａｌｌｓ ｈａｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
・５５４・
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堡塾也！盟！坠翌里！鱼：！塑１ ２Ｑ！亟ｙＱ！：！！：堕Ｑ：鱼
・神经胶质瘤・
人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植 双荧光模型的建立
于宁 李张昱 高鑫 郭剑锋
陈四方
朱宏伟
叶永造
谭国伟
３６１００３厦门，厦门大学附属第一医院神经外科
通信作者：谭国伟，Ｅｍａｉｌ：ｇｗｔａｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
Ｌｉｆｅ
ｈ后，石蜡包埋、切片，行ＨＥ染色，在显微镜下观
察肿瘤的组织病理学特征。置荧光显微镜下观察肿 瘤细胞与宿主基质细胞的关系。 结
果
一、稳定表达ＥＲＦＰ细胞株的建立 ＥＲＦＰ—Ｕ８７细胞生长良好。在荧光显微镜下能 够观察到较强且均匀分布的荧光信号，传代培养后 ＥＲＦＰ—Ｕ８７细胞的荧光强度并不衰减（图１）。 二、ＥＧＦＰ裸鼠的产生和鉴定 带有ＥＧＦＰ的裸鼠全身组织器官均带有肉眼可 见的绿色荧光．在活体成像系统和荧光显微镜下也 可看到绿色荧光。 三、活体成像结果
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１—８９２５．２０１６．０６．００３
【摘要】
目的
建立裸鼠的人脑胶质瘤细胞原位移植双色荧光模型。
方法
体外培养转染
有增强型红色荧光蛋白（ＥＲＦＰ）的人Ｕ８７细胞（ＥＲＦＰ—Ｕ８７），制成细胞悬液后接种于表达增强型绿色 荧光蛋白（ＥＧＦＰ）Ｉ拘裸小鼠脑部右侧尾状核区域，活体成像系统上动态观察肿瘤的生长，４周后ＨＥ 染色移植瘤组织切片，荧光显微镜下观察肿瘤细胞与宿主基质细胞的关系。
ｎｕ／ｎｕ
麻醉小鼠后，将其固定于立体定向头架上，７５％乙醇 消毒后．在头顶双侧眼裂连线处横向切开头皮，暴露 前囟颅骨标志．前囟中点前１ ｎｌｍ、矢状缝旁开２
ｍｌＴｌ
处用牙科钻钻一骨孔，以１０斗Ｌ的微量注射器抽取 细胞悬液５¨Ｌ后固定于立体定向仪，经骨孑Ｌ垂直进 针至颅骨下３．７ ｍｉ／１．回退２ ＩＴＩＩＴＩ，于２０ ｍｉｎ内将细 胞悬液注射完，注射完毕后留针５ ｍｉｎ，缓慢退针，用 骨蜡封闭骨孔，１号丝线缝合皮肤切口，观察至麻醉 苏醒。 五、活体荧光成像动态观察肿瘤的生长情况 将移植术后的裸鼠饲养４周，自由饮食。成像时 用异氟烷持续吸入麻醉裸鼠。俯卧位放于活体成像 仪配备的黑色胶垫上，在ＬｕｍｉｎａｌＩ成像系统下行活 体荧光成像。图像以ＩＶＩＳ软件（美国 ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ公司）分析，在Ｒａｄｉａｎｃｅ模式下测 量荧光强度。连续照射２周，观察瘤体的变化及转移 情况。 六、大体观察和荧光显微镜观察 ４周后处死裸鼠，用生理盐水经心脏行器官灌 注后断头取脑。观察肿瘤的大体生长情况和转移情 况。将瘤组织置于１００ ｇ／Ｌ的多聚甲醛固定液中固定
ａｓ
ｓｅｅｎ；ｎｏｒｍａｌ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ
ｆｏｒｍｅｄ
ｔｈｅ ｖｅｓｓｅｌｓ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｔｕｂｅ
ｃａｎ
Ｉｎ ｔｈｅｓｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ，ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ
ｏｎ
ｂｅ ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ
ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ｔｈｕｓ，ｔｈｅｙ ｍａｙ ｓｅｒｖｅ
ｉｄｅａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ
三、细胞培养 ＥＲＦＰ．Ｕ８７细胞复苏后分装于底面直径为１０ ｃｍ的培养皿中，加入适量含１０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ培养液，置于３７ ｏＣ、５％ＣＯ：的恒温恒湿培养 箱中培养。在细胞处于对数生长期大约８０％时，以 ２．５∥Ｌ的胰酶消化，收集消化液后离心并除去上清 液．以不含血清的ＤＭＥＭ液吹打后以ＤＭＥＭ液制 成浓度为１０ｓ个／ｍＬ的细胞悬液。置于碎冰上备用。 四、动物模型的制作 用１００ ｇ／Ｌ的水合氯醛腹腔注射（０．０４
Ｆｉｇ．１
图３ Ｆｉｇ．３
◆
ａ
Ｃｈｉｎ Ｊ
Ｎｅｕｒｏｍ鲤，！旦堕；三旦堕，Ｖ０１．１５，Ｎｏ．６
ＨＥ染色移植瘤组织切片（ｘ４００）
ｌｉｇｈｔ
Ｔｕｍｏｒ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ
ＥＲＦＰ・Ｕ８７ ｃｅｌｌｓ ５ ｄ ａｆｌｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｕｔｕｒｅ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ．ｘ４００
ｓｅｅｎ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ
ｉｎ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＥＧＦＰ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ
ｏｎｅ
ｉｍａｇｉｎｇ．Ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｎｏｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｇｒａｆｔ ｓｉｔｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ
２４
裸小鼠和雌性Ｃ５７／１７６一ＧＦＰ转基因小鼠均由厦门 大学实验动物中心提供，均按照ＳＰＦ级管理。按照 文献［５－６］的方法，在雄性ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ裸小鼠和 雌性Ｃ５７／１７６．ＧＦＰ转基因小鼠交配后，在其子代中 选择表达ＥＧＦＰ的有毛雌鼠和无毛雄鼠继续交配， 并且以兄妹交配或回交的近交系模式育种。肿瘤移 植实验所用的裸鼠为体质量（２０±２）ｇ、５～６周龄的 ＥＧＦＰ裸／Ｊ、鼠。 二、主要仪器和试剂 裸小鼠头颅立体定向仪（安徽淮北振华公司）， 自制牙科钻，１０¨Ｌ微量注射器（上海高鸽公司），电 子天平（上海精天电子仪器有限公司），生物发光成 像系统ｆＬｕｍｉｎａｌｌ型，美国Ｃａｌｉｐｅｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）．Ｄｙｎａｍｉｃ
ｏｎ
ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ
ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ４ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ；ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｇｒｅｅｎ
ａｎｄ ｈｏｓｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．