鼠伤寒沙门菌BaeSR和AcrB双基因缺失株的构建及其耐药性分析

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鼠伤寒沙门菌!"#$% 和&'(! 双基因缺失株的 构建及其瑞良 赵!霞李!琳
药!N(,/8?)(^)2383/+*=2(AFU"现 象 日 趋 严 重(多 重耐药菌株的不断出现导致沙门菌感染形势十分严 峻 ) %$& 多重耐药外排泵!AFU2--,(\M(NM"和 双 组 分信号 转 导 系 统 !/1'D='NM'*2*/3:3/2N(aT<"是 人们研究耐药机理的重点%ID!&)有研 究 表 明(在 沙 门
()*+,%-##$",1+/#,,"75<4016(061 '4=)V2--,(\M(NM'^2*2L*'=LD'(/'+*/8`8'/8=)2383/+*=2
!!沙门菌!$",1+/#,,""是一类重要的食 源 性 病 原 菌(分布广,危害大(可广泛感染人和动物(严 重 威胁 人类健康和 畜 牧 业 的 发 展 ) %B& 近 年 来(细 菌 多 重 耐
Y7&(*(Z4G [+8\8+(RHU(8(]4.Z U(8(]4.Z ]2*K8*^( _[4.Z U(8,8+*^(_[4G Y8+(RHR8*
!*+,,#-#+.&/01",$'0#/'#"/23#'4/+,+-5(&/460&-(0'6,76(#8/09#(:075(;#.#0(&/460$I%%IE(*40/""
形成能力和运动性的变 化(为 进 一 步 阐 明 V+2<U 对 多 重 耐 药 外 排 泵 的 调 控 机 制 提 供 试 验 依 据(同 时 为
研究 沙 门 菌 耐 药 性 产 生 机 制,遏 制 细 菌 多 重 耐 药 提 供理论基础)
B!材料与方法
B;B! 材 ! 料 B;B;B! 菌 株 及 质 粒 ! 鼠 伤 寒 沙 门 菌 4aTTBIIBB 体外诱导环 丙 沙 星 耐 药 株 !TU 标 准 株",!"#$% 基 因缺失株 !TU"V+2<U"及 大 肠 杆 菌 4aTT$#C$$( 均由安徽农业大学兽医药理与毒理学实验室保存' 自杀质 粒 MRSB$ 及 大 肠 杆 菌 F[## 和 $$BEI 感 受 态 细 胞 (购 自 广 州 诺 晶 生 物 科 技 有 限 公 司 ) B;B;$!主要试 剂 !RV 肉 汤,RV 琼 脂(购 自 上 海 生 工生物工程有限公司'A[ 肉汤培养基(购自杭州 微 生 物 试 剂 有 限 公 司)S)8N2)<a4U A+\ S)2N8\ !$c",F.4 A+)L2)(购 自 a+O+U+ 生 物 工 程 有 限 公司'$(ED二氨 基 庚 二 酸 !F4S",>?葡 萄 糖,@?阿 拉 伯糖(均 购 自 美 国 <8^N+D4,?)8=0 公 司'质 粒 小 量 提 取试剂盒,F.4 凝胶回收试剂盒,细 菌基 因组 F.4 提取试剂盒(购 自 康 宁 生 命 科 学 !吴 江 "有 限 公 司) $D内 酰 胺 类 #氨 苄 西 林 !4AS",阿 莫 西 林 !4AY",头 孢噻呋!T>6"(氨基糖苷 类#阿 米卡 星!4AO",安 普 霉素 !4SU"(四 环 素 类#四 环 素 !a>a",强 力 霉 素 !FGY"(大环 内 酯 类#阿 奇 霉 素 !4_A"(氟 喹 诺 酮 类#恩诺沙星!>.U",环丙 沙 星!THS"(酰 胺 醇 类#氟 苯尼考!66T",氯霉素!T[R"(均购自中国兽医药 品 监察所) B;$! 方 ! 法 B;$;B!引物设计!根据 .TVH中公布的鼠伤寒沙门 菌 的 基 因 组 序 列!Z2*2V+*L 登 录 号 #TS%%CB%$;B"(利 用 S)8N2)S)2N82)#;%设 计 &'(! 基 因 缺 失 所 用 引 物(即 &'(! 的 上 游 同 源 臂 4 引 物 4=)VDA6B$ 4=)VDAUB和下游同源 臂 V 引 物 4=)VDA6$$4=)VD AU$(缺 失 检 测 引 物 4=)VDa6$4=)VDaU'同 时 设 计 重组质粒检测的质粒 引物 MRSD76$MRSD7U)引 物 由通用生物系统 !安 徽"有 限 公 司 合 成(相 关 信 息 见 表 B)
菌中至少存在 4=)4V!由 4=)4,4=)V 组成"(4=)F( 4=)>6!由 4=)>,4=)6 组 成 "(A?/4VT!由 A?/4, A?/V,A?/T 组 成 "(A?34VT!由 A?34,A?3V, A?3T 组 成 "(A?/O(>N)4V!由 >N)4,>N)V 组 成"(A?-4 和 A+=4V!由 A+=4,A+=V 组成"等C种 多重耐药外排泵 ) %#DE& 其中(4=)V 属于 U.F 超家族 外 排 泵(也 是 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 最 主 要 的 耐 多 药 泵 系
第 !" 卷 ! 第 # 期 $%$% 年 # 月
西 北 农 林 科 技 大 学 学 报 !自 然 科 学 版 " &'()*+,'-.')/0123/456 7*892)38/:!.+/;<=8;>?;"
网 络 出 版 时 间 #$%BCDBBD%!!B###E!
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!安徽农业大学 动物科技学院(安徽 合肥 $I%%IE"
摘!要*目的+构建鼠伤寒沙门菌 !"#$% 和&'(! 双 基 因 缺 失 株(探 究 !"#$% 和 &'(! 对 鼠 伤 寒 沙 门 菌 耐 药
性的 影 响)*方 法 +采 用 自 杀 质 粒 MRSB$ 介 导 的 同 源 重 组 系 统 构 建 鼠 伤 寒 沙 门 菌 标 准 株 TU 的 &'(! 基 因 缺 失 株 TU"4=)V以及 &'(! 和!"#$% 双基因缺失株 TU"V+2<U"4=)V(比较分析鼠伤 寒 沙 门 菌 缺 失 株 与 标 准 株 对 氨 苄 西
!"#$%&'$#*G`K2=/892+a02!"#$% +*?&'(! ^2*2?2,2/8'*3/)+8*3'-$",1+/#,,"75<4016(061 12)2 ='*3/)(=/2?/'3/(?:/022--2=/'-!"#$%+*?&'(! '*+*/8`8'/8=)2383/+*=2'-$=75<4016(061=*A2/0'?+ V+32?'*$=75<4016(061 3/+*?+)?3/)+8*TU(?2,2/2? N(/+*/3TU"4=)V+*?TU"V+2<U"4=)V 12)2 '`/+8*2?`:0'N','^'(3)2='N`8*+/8'*N2?8+/2?`:3(8=8?2M,+3N8?MRSB$;a02?8--2)2*=238* AHT(^)'1/0 =0+)+=/2)83/8=3(`8'-8,N-')N+/8'*+`8,8/:+*?N'/8,8/:'-/02?2,2/2?3/)+8*3+*?3/+*?+)?3/)+8*3TU+^+8*3/ 4NM8=8,,8*(4N'\8=8,,8*(T2-/8'-()(4N8L+=8*(4M)+N:=8*(a2/)+=:=,8*2(F'\:=:=,8*2(4b8/0)'N:=8*(>*)'D -,'\+=8*(T8M)'-,'\+=8*+*?6,(-2*8=',12)2='NM+)2?+*?+*+,:b2?;*U23(,/+a0833/(?:3(==233-(,,:='*D 3/)(=/2?/02^2*2?2,2/8'*3/)+8*3'-TU"4=)V+*?TU"V+2<U"4=)V;a02 AHT'-/02/12,92+*/8`8'/8=3 8*^2*2?2,2/8'*3/)+8*312)2,'12)/0+*/0'328*3/+*?+)?3/)+8*3TU;T'NM+)2? 18/0 TU"4=)V(AHT'-
物的 AHT 值均有不同程度的降低'与 TU"4=)V 相比(TU"V+2<U"4=)V 对除青霉素类!氨苄西林和阿 莫 西 林"以 外 的B%种药物 AHT 下降了#%W""J;#W)与标准株 TU 相比(TU"4=)V 和 TU"V+2<U"4=)V 的生长速 率 无 明 显 变
化(但其生物膜形成能力!)#%;%B"及运动性!)#%;%#"均 显 著 下 降)*结 论+鼠 伤 寒 沙 门 菌 &'(! 和!"#$% 基 因 缺 失 后 (细 菌 的 运 动 性 及 生 物 膜 形 成 能 力 显 著 下 降 (对 多 种 抗 生 素 的 敏 感 性 增 强 )
关键词!鼠伤寒沙门菌'外排泵 4=)V'基因敲除'耐药性
中 图 分 类 号 !<"#$;EB'XJ"E
文 献 标 志 码 !4
文 章 编 号 !BEJBDCI"J!$%$%"%#D%%%BD%"
!"#$%&'(%)"#*#+&,$)$%*#(,%"*#%)-)"%)($".!"#$ *#+$%&'( /,#,0#"(01"'%$%&*)#$".'%)*+,&))%-./01*2#12*
因此(为避 免 4=)V 存 在 条 件 下 掩 盖 其 他 外 排 泵的功能(本研究在前期试验基础上(采用自 杀质 粒 介导的 同 源 重 组 技 术%BB&(对 鼠 伤 寒 沙 门 菌 标 准 株
TU 进行 基 因 缺 失 处 理(获 得 !"#$% 和 &'(! 双 基 因缺失株 TU"V+2<U"4=)V(分析基因缺失前后鼠 伤 寒 沙 门 菌 对 抗 菌 药 物 的 敏 感 性 ,生 长 特 性 ,生 物 膜
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西 北 农 林 科 技 大 学 学 报 !自 然 科 学 版 "
第 !" 卷
TU"V+2<U"4=)V12)2?2=)2+32?`:#%W P"J;#W -')B%?)(^32\=2M/S2*8=8,,8*3!4AS+*?4AY";a02 ^)'1/0)+/23'-TU"4=)V+*?TU"V+2<U"4=)V?8?*'/=0+*^238^*8-8=+*/,:='NM+)2?18/0TU(`(//02 `8'-8,N-')N+/8'*+`8,8/: !)#%;%B"+*?N'/8,8/: !)#%;%#"?2=)2+32?38^*8-8=+*/,:;*T'*=,(38'*+a02?2D ,2/8'*'-&'(!+*?!"#$%^2*238*$=75<4016(06138^*8-8=+*/,:?2=)2+32?/02N'/8,8/:'-`+=/2)8++*?/02 +`8,8/:'-`8'-8,N-')N+/8'*(108,28*=)2+32?/0232*38/898/:/'9+)8'(3+*/8`8'/8=3;
林,阿莫西林,头孢噻呋,阿米卡星,安普霉素,四环素,强力霉素,阿奇霉素,恩诺沙星,环丙 沙 星,氟 苯 尼 考,氯 霉 素 B$
种药物的敏感性及生长特性,生物膜形成能力,运动性等 生 物 学 特 性 差 异)*结 果+成 功 构 建 了 鼠 伤 寒 沙 门 菌 标 准 株
TU 的基因缺失株 TU"4=)V 和 TU"V+2<U"4=)V)药物敏感性结果显示(与标准株 TU 相比(TU"4=)V 对B$种药
统)4=)V 广泛存在 于 革 兰 阴 性 菌 细 胞 膜 上 的 转 运 蛋白中(是毒 力 和 生 物 膜 形 成 所 必 需 的) ]+*^L+* 等 证 %J& 实(4=)V 外排功能的丧失会 导 致 鼠 伤 寒 沙 门 氏菌毒力的丧失)
典型的 aT<含有$种蛋白质(即 传感 器组氨 酸 激 酶 !083/8?8*2L8*+32([O"和 反 应 调 控 蛋 白 !)2D 3M'*32)2^(,+/')(UU"%"&) 沙 门 菌 中 调 控 耐 药 性 的 双组分系统主 要 包 括 TM\4U,S0'SX 和 V+2<U(其 中 V+2<U 双 组 份 系 统 通 过 诱 导 4=)F 和 A?/4VT 外排泵 基 因 的 过 表 达 增 加 沙 门 氏 菌 的 多 重 耐 药 性 ) %C& 但 [')8:+N+ 等 发 %B%& 现(在 功 能 性 4=)4VD a',T 泵 存 在 时(其 他 外 排 泵 !4=)F,4=)>6,A?D /4VT 或 A?/>6"对抗生素的敏感性无明 显变化(推 测 4=)V 可能会影响其他外排泵的功能)