沙地云杉及近缘种的FISH技术优化

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沙地云杉及近缘种的FISH技术优化
王 菊 白玉娥 内蒙古农业大学林学院
【摘　要】 沙地云杉是稀有珍贵树种，具有耐旱抗寒、防风阻沙和调节气候等特点。

对于我国北方及西部地区治沙造林
是难得的优良树种。

应用优化后的荧光原位杂交（FISH）技术，对沙地云杉与近缘种的种间遗传多样性进行研究。

【关键词】 沙地云杉 FISH技术优化 近缘种
沙地云杉( Picea mongolica)是中国珍稀树种，集中成片的分布在生态环境恶劣的内蒙古自治区克什克腾旗白音敖包自然保护区，形成了罕见的沙地森林。

荧光原位杂交（FISH）技术是在分子水平上反映物种间遗传多样性的一种有效方法，该技术在植物细胞遗传学研究、基因扩增、染色体核型分析、植物进化及亲缘关系鉴定等方面广泛应用[1]，有助于更好地理解云杉物种间的亲缘关系和进化。

对研究和防治我国北方土地荒漠化，保护京津地区的周边生态环境也有着重要意义。

1 实验材料及方法
1.1 实验材料
沙地云杉、红皮云杉和白杄云杉的种子均来自天然林（内蒙古自治区克什克腾旗白音敖包林场、小兴安岭长白山林区和山西五台县五台山），随机选取30株无病虫害的健壮植株，相邻植株间的距离应大于100ｍ。

于当年秋季采摘30年以上树龄的云杉球果，分装在透明的袋子，从球果中取出种子，放在4℃冰箱中保存备用。

次年6月采集云杉当年生嫩叶，置于保鲜袋中标记分装，带回实验室于-70℃冷冻保存以制备5S rDNA探针。

1.2 实验方法
1.2.1 种子发芽及根尖固定
将消毒后浸泡过的3种云杉种子在湿滤纸的培养皿中25℃下发芽。

待根系生长到约2cm时切取根尖，用0.1%秋水仙素+0.5%二甲基亚枫改良混合液进行预处理，置于23℃、120rpm 的摇床内处理6h，用蒸留水清洗，加入新鲜Carnol固定液（乙醇：冰乙酸=3：1，V / V）转入4℃冰箱内固定24-48h。

1.2.2 染色体制片
固定好的根尖用蒸馏水冲洗2—3次，加入混合酶溶液(1%果胶酶+2％的纤维素酶)，置于37℃恒温水浴锅解离70min，用蒸馏水缓缓清洗。

在制片过程中，取材是很关键的一步，是实验成功的基础。

选取云杉根尖的分生区，用去壁低渗火焰干燥法进行染色体制片，显著提高了染色体图像的平整性和分散程度。

1.2.3 探针及标记
沙地云杉5S rDNA探针进行生物素标记，使用小麦45S rDNA探针经地高辛标记。

1.2.4 荧光原位杂交
以45SrDNA和5SrDNA为探针进行原位杂交所用的探针标记、探针浓度及具体操作步骤等参见文献[2]。

杂交后用OlympusBX51荧光显微镜进行照相。

2 分析与讨论
2.1 染色体制片优化分析
三种云杉染色体均为2n=24。

3种云杉的核型十分相似，都有16条长的中部着丝粒染色体，8条短的亚中部着丝粒染色体，与已报道的其它云杉一致。

染色体核型分析用来识别3种云杉同源染色体，由此判断出三种云杉树种间有着高度保守和一致性的核型。

亲缘关系越近的物种其核型则越相似[3]。

2.2 荧光原位杂交（FISH）优化分析
根据FISH的荧光镜检结果，45SrDNA和5SrDNA探针在云杉各染色体上具有不同的杂交信号，能够有效辨识云杉各条染色体。

在三种云杉的染色体上均有一个保守的45S rDNA信号位点，较强的45S rDNA信号位点出现在次缢痕处，一些较弱的信号出现在间质区。

三种云杉都表现出了相同5SrDNA信号模式，以前报道过的分子系统学分析表明，这些物种是密切相关的物种；虽然研究中没有从5S rDNA信号位点上找到三种云杉之间的差异，但这些信号位点是松科云杉属植物所特有的[4]。

三种云杉优化后的FISH分析，有助于确定它们的同源染色体，并且为杂交基因组的遗传起源提供额外的重要证据。

结束语
荧光原位杂交（FISH）技术优化在沙地云杉及近缘种的成功探索,为其精确核型分析、基因定位、物理图谱构建等方面的研究,奠定了一定的技术基础,具有较重要的应用价值。

参考文献
[1] Matsusaki, Y. and Garajova, Z. 2002. Chromosome identification
and comparative karyotypic analyses of four Pinus species. Theor.
Appl. Genet. 105: 491–497.
[2] Koo DH, Hur YK, Jin DC, Bang JW. Karyotype analysis of a
Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv.Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization.
Mol Cells, 2002, 13(3): 413418.
[3] Shibata, F., Hizume, M.. and Garajova, Z. 2004. Conserved
FISH karyotypes in four species of Abies (Pinaceae).Chromosome Sci.8:95-98.
[4] Datson, P. M. and Murray, B. G. 2006. Ribosomal DNA
locus evolution in Nemesia: transposition rather than structural rearrangement as the key mechanism Chromosome Res. 14: 845–857.
作者简介
王菊(1992—)，女，汉族，内蒙古乌兰察布人，内蒙古农业大学林学院硕士研究生，从事林木遗传育种理论与技术的研究。