量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫

量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫
段宏;陈雪岚;江湖;沈骏;董胜明;熊勇华;Andrew Wang
【摘要】A CdTe/ZnSe quantum-dot submicrobead ( QBs ) , which exhibited fluorescence intensity approximately 2800-fold stronger than that of single quantum dots, was conjugated with the anti-histidine rich protein( HRP )-Ⅱ mAbs using N-( 3-( Dimethylamino ) propyl )-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride ( EDC ) method as fluorescence probe. The goat anti-HRP-Ⅱ polyclonal antibodies and donkey anti-mouse polyclonal antibodies were sprayed onto the nitrocellulose membrane as test line and control line, respectively. The resultant fluorescence probes were introduced to the immunochromatographic strip for the quantitative determination of Plasmodium falciparum. For determination of Plasmodium falciparum in serum, the QBs based immunochromatographic strips exhibited a good dynamic linear range from 5 . 8 Parasite/μL to 8010 Parasite/μL with a limit of detection of 5. 8 Parasite/μL. The detection time of the proposed QBs based immunochromatographic strips for each sample was only 15 min. Moreover, the recovery rates of the intra-and inter-assay ranged from 93. 0% to 111. 9%, and 98. 3% to 115. 1% respectively, while the relative standard deviations ( RSDs) of intra-and inter-assay were below 5%.%以羧基化CdTe/ZnSe量子点荧光微球为荧光标记物,采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)法偶联抗恶性疟原虫富组氨酸蛋白(Pf)单克隆抗体制备荧光探针；以羊抗恶性疟原虫组氨酸多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜,形成试纸条检测线和质控线,建立了免疫层析试纸条定
量检测血清中恶性疟原虫的方法。

所使用的羧基化量子点荧光微球的荧光强度为单个量子点的2800倍。

实验结果表明,该荧光试纸条定量检测血清中恶性疟原虫线性范围为5.8~8010 Parasite/μL,最低灵敏度达到5.8 Parasite/μL,单个样品检测时间只需15 min。

加标回收实验显示,试纸条批内回收率为93.0%~111.8%,批间回收率为98.3%~115.1%,且批内、批间的相对标准偏差均小于5%。

【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2015(000)003
【总页数】6页(P338-343)
【关键词】量子点荧光微球;免疫层析试纸条;恶性疟原虫;定量检测
【作者】段宏;陈雪岚;江湖;沈骏;董胜明;熊勇华;Andrew Wang
【作者单位】南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047;江西师范大学生命科学学院，南昌330029;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047;北京金源佳和生物科技有限公司，北京100036;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047;Ocean NanoTech，LLC.，San Diego，CA 92126，USA
【正文语种】中文
1 引言
疟疾(Malaria)是一种由疟原虫引起的红细胞内寄生虫病，其中90%由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，Pf)侵染造成［1，2］。

该病由携带疟原虫的按蚊通过叮咬方式进行传播，是目前在全球范围内造成死亡人数最多的一种寄生虫病。

疟
疾常见的诊断方法包括以镜检法为基础的病原学诊断、以抗原抗体特异性反应为基础的免疫学诊断以及以聚合酶链式反应(PCR)为代表的分子生物学诊断方法。

传统的镜检方法是疟疾诊断的金标准方法，但该方法检测周期长，对操作人员的专业技能要求较高，且平均灵敏度只有50 ～100 Parasite/μL，因此不能适应当前疟疾
快速诊断的临床需求［3，4］。

PCR方法检测灵敏度较高，且可以确定疟原虫的
种属，对疟疾的有效防治具有较大的指导作用;但该方法检测疟原虫需要特殊的设
备及实验室环境的支持，对操作人员实验技能要求较高，不适合基层医院及现场的即时检验(Point－of－care testing，POCT)［5，6］。

以胶体金为标记物的免疫层析方法，因具有快速、使用简单等优点［7］，已逐渐应用于疟疾的现场诊断，目前约有30 余种胶体金免疫层析试纸条商品。

但常规胶体金免疫层析试纸条检测疟原虫灵敏度普遍偏低，只有50 ～100 Parasite/μL ［8］，且易受血样基质及外界条件的干扰而出现漏检现象。

因此，在一定程度上限制了其推广使用。

新型荧光标记物(如荧光微球等)能有效消除有色样品本底的基质干扰，提高检测灵敏度，是目前免疫层析方法定量检测的首选标记物之一［9］。

李怀明等［10］曾采用Ru(4，7－Ph2－phen)3染料掺杂的荧光硅球为探针，建立了猪尿中盐酸克伦特罗的免疫层析试纸条定量检测方法，检测灵敏度远高于胶体金免疫层析试纸条定性检测方法。

量子点(Quantum dots，QDs)作为一种新型的荧光标记材料，具有激发光波长范围宽、斯托克位移大、荧光谱峰狭窄对称及耐光漂白等优良的光学特质［11］，已广泛应用于提高免疫层析方法的检测灵敏度。

如Beloglazova 等［12］将QDs 作为免疫探针用于免疫层析试纸条法检测玉米
赤霉烯酮，灵敏度为0.03 ng/mL。

崔希等［13］将免疫磁分离结合胶体金免疫层析方法快速测定大肠杆菌。

量子点微球(Quantum－dot submicrobeads，QBs)
通过将大量的量子点包裹于聚合物微球中，使得荧光强度进一步提高，由于包有聚合物的外层，亦进一步增强了QBs 光学及溶液稳定性［14］。

Zhang 等［15］
以QBs 为探针，建立了基于膜片的乙肝表面抗原斑点杂交免疫学检测方法，检测
限达到0.078 ng/mL。

本实验室以QBs 为探针，建立了免疫层析试纸条检测食品中黄曲霉毒素B1 的方法，灵敏度高达0.42 pg/mL［16］。

本研究以Pf 中富组
氨酸蛋白(HRP－Ⅱ)为检测抗原，以CdTe/ZnSe QBs标记抗HRP－Ⅱ单克隆抗体，建立了基于QBs 为探针的免疫层析试纸条超灵敏快速定量检测血清中Pf 的方法。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
XY Z3000 点膜仪(Bio－Dot 公司);自动切条仪(金标生物科技公司);粒径分析仪(英国马尔文公司);JEOL JEM 2100 高分辨率透射电子显微镜(日本电子株式会社);便携式荧光试纸条读取仪(上海互帼科学仪器有限公司);硝酸纤维膜(NC 膜)、结合垫、
吸水纸及PVC 底板(美国Millipore 公司)。

表面羧基修饰的CdTe/ZnSe 量子点聚合物微球(QBs，美国Ocean Nnotech.公
司赠送);灭活的Pf 阳性血清(美国夏威夷大学George Hui 教授提供，浓度为
2.4×105 Parasite/μL);鼠抗HRP－Ⅱ单克隆抗体(Mouse anti－HRP－ⅡmAb)与羊抗Pf 多克隆抗体(Goat anti－HRP－ⅡpAb)由北京金源佳和生物科技有限公司免费提供;驴抗鼠二抗(北京中山生物科技公司);人血清(索莱宝公司);牛血清白蛋白(BSA)、乙基－(3－二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，sigma 公司);其它试剂均为分析纯。

2.2 QBs标记探针的制备
采用EDC 一步法［17］将QBs 上的羧基与鼠抗HRP－Ⅱ单克隆抗体上的氨基进
行偶联。

具体步骤如下:将0.6 mg QBs、40 μg EDC 与10 mL PB 缓冲液(pH 6.0，0.01 mol/L)混匀后，加入120 μg 鼠抗HRP－Ⅱ单克隆抗体;室温搅拌反应45 min 后继续加入40 μg EDC 以及1.2 mL 10% (w/V)BSA 溶液进行封闭反应2 h;
反应溶液以13000 r/min 离心10 min，2 mL 超纯水洗涤沉淀，离心，沉淀复溶
于2 mL PBS(pH 7.4，0.01 mol/L，含2%果糖，1%聚乙二醇2000，5%蔗糖，1% BSA，0.4%吐温－20)中，4 ℃保存备用。

2.3 QBs试纸条的制备及检测流程
将不同浓度羊抗HRP－Ⅱ多克隆抗体(0.5，1.0 和1.5 g/L)和驴抗鼠二抗(0.5 g/L)分别喷凃于NC膜上作为Pf 检测线(T 线)和质控线(C 线)，NC 膜于37℃干燥12 h。

将预处理好的NC 膜、结合垫以及吸水纸依次粘贴在PVC 底板上，使用自动切条机将其切成宽度为4 mm 的试纸条，室温干燥保存备用。

图1 免疫层析试纸条检测原理(A 为阳性，B 为阴性)Fig.1 Schematic diagram of immunochromatographic strips1.结合垫(Conjugate pad);2.PVC 底板(PVC plate);3.硼酸纤维膜(Nitrocellulse membrane);4.检测线(Test line);5.质控线(Control line);6.吸水纸(Absorbent pad)。

A:Positive sample，B:Negative sample.
血清中 Pf 检测流程如图1 所示将1.5 μL QBs 探针与68.5 μL 血清混合孵育5 min 后，加到试纸条结合垫上，室温反应10 min 后，荧光试纸条读取仪读取试纸条T、C 线荧光强度。

当血清中含有Pf 时，QBs探针上的鼠抗HRP－ⅡI 单克隆抗体与HRP－Ⅱ蛋白结合，免疫复合物经NC 膜迁移至试纸条T 线区域与羊抗HRP－Ⅱ多克隆抗体结合，形成双抗体夹心免疫复合物，T 线出现荧光条带，荧光强度与Pf 浓度呈正相关(未出现Hook 效应之前);反之，则QBs 探针不能被T线上的羊抗HRP－Ⅱ多克隆抗体捕获，T 线无荧光条带，未被T 线捕获的QBs 探针进一步迁移至试纸条C 线区域，与C 线上的驴抗鼠二抗结合产生荧光。

若C 线不显荧光条带，检测无效。

2.4 QBs试纸条制备及检测条件的优化
2.4.1 QBs 探针抗体标记量优化取50，100，150，200，250，300，350 和400 μg 鼠抗HRP－Ⅱ单克隆抗体分别标记1 mg QBs。

获得的QBs 探针与Pf 浓
度为244 Parasite /μL(P/μL)血清孵育5 min 后，加入试纸条，30 min 后检测(T 线:羊抗HRP－Ⅱ多克隆抗体喷涂液浓度为1.0 g/L，C 线:驴抗鼠二抗喷涂液浓度
为0.5 g/L)，荧光读取仪读取T 线荧光强度，以T 线产生荧光信号最强为QBs 最佳抗体标记量。

2.4.2 QBs试纸条的优化在最佳抗体标记浓度下，通过棋盘滴定实验确定QBs 探
针以及T 线上多抗最佳剂量。

试纸条定量分析的最佳判读时间采用免疫动力学分
析方法进行确定。

具体方案如下:在最优条件下，将70 μL 待测血清(含1.5 μL QBs 探针，血清Pf 浓度为244 Parasite/μL)加入试纸条加样孔后，每隔1 min，荧光读取仪记录试纸条T、C 线荧光强度(FT，FC)以及T、C 线荧光强度比值
(FT/FC)。

绘制FT、FC 以及FT/FC随反应时间变化的曲线图，以FT/FC 达到稳定值的时间为试纸条定量分析的最佳判读时间。

2.4.3 血清Pf 检测的标准曲线在最适条件下，将灭活的Pf 分别添加至Pf 阴性的
人血清中配制Pf浓度为0 ～3.2×105 Parasite/μL 的不同样品，QBs试纸条检测，10 min 后荧光读取仪读取试纸条FT/FC 比值，每个浓度样本重复检测3 次。

以
Pf 浓度为横坐标，FT/FC 值为纵座标，绘制检测血清中Pf 标准曲线。

2.4.4 QBs免疫层析试纸条性能初步评价通过批内以及批间加标回收实验评价
QBs 荧光试纸条检测血清中Pf 的准确性以及精密度，具体步骤如下:取阴性人血清，分别添加Pf 至终浓度为22.25，360 和4800 Parasite/μL。

使用同一批次试纸条检测以上加标样品，每个浓度重复检测5 次，计算Pf 加标回收率与相对标准偏差以评价试纸条的批内稳定性;随后每隔5 天连续检测3 次，计算加标样品的回收率
与相对标准偏差以评价试纸条的批间稳定性。

3 结果与讨论
3.1 QBs表征
透射电镜图片显示QBs 聚合物微球呈球形，粒径分布均匀(图2A);单个粒子的高分
辨率电镜结果显示聚合物中包埋了大量的油溶性CdTe/ZnSe 量子点(图2A 插图)。

激光动态光散射结果显示裸露的QBs 平均水化粒径为255 nm，而QBs 探针平均水化粒径增加至295 nm，表明抗HRP－Ⅱ单克隆抗体成功偶联至QBs表面(图
2B)。

QBs 荧光光谱显示其最大荧光发射波长为620 nm，且3.5 × 10-3 nmol/L QBs溶液荧光强度与10 nmol/L 水溶性CdTe/ZnSe 量子点荧光强度基本相同，
即QBs 荧光强度较CdTe/ZnSe 量子点增强了2800 多倍(Con.QD/Con.QBs=(10 nmol/L)/(3.5 × 10-3 nmol/L)= 2857)。

3.2 QBs 探针抗体标记量优化
用不同抗体标记量的QBs 探针检测Pf 加标血清(244 Parasite/μL)，读取仪记录T 线荧光强度，结果如图3 所示。

当抗体标记量从50 μg/mg 增加至200 μg/mg 时，试纸条T 线荧光强度由579 增至1076;当抗体标记量介于200 ～250 μg/mg 时，T 线荧光强度达到最大值;进一步增加抗体标记量，T 线荧光强度反而降低。

这是由于随着QBs表面抗体标记数量的增加，T线荧光强度增加，但是当QBs表面抗体标记浓度过高时，由于空间位阻效应，QBs 探针结合活性反而下降，且随着
抗体数量增多，活性下降越显著，导致T 线荧光强度的降低。

因此，本研究以
200 μg 抗体标记1 mg QBs 为最佳抗体标记浓度。

图2 A:QBs 的透射电镜图;B:QBs 与QBs－mAbs 水化粒径测定Fig.2 A:TEM image of qiantum dots submicrobeads(QBs);B:Hydrodynamic diameter of the free QBs and QBs－mAbs
图3 T 线荧光强度随标记抗体浓度的变化(Pf 浓度244 Parasite/μL)Fig.3 Change of fluorescence intensity of test line with different amount of labeling antibody (plasmodium falciparum (Pf)concentration is 244 Parasite/μL)
3.3 QBs试纸条的优化
QBs 探针用量及T 线上羊抗HRP－Ⅱ多克隆抗体喷涂浓度也是影响荧光试纸条灵
敏度的关键参数。

本研究通过棋盘滴定实验优化QBs 探针及T 线羊抗HRP－Ⅱ多克隆抗体用量，结果见表1。

从表1 可知，当T 线羊抗Pf 多克隆抗体浓度为1.5 g/L，QBs 探针用量为1.5 μL时，试纸条T 线荧光强度达到最高1281(血清Pf 浓度为244 Parasite/μL)。

考虑到灵敏度以及检测成本，本实验采用T 线羊抗Pf 多克隆抗体浓度为1.5 g/L，QBs 探针用量1.5 μL 为最佳值。

表1 棋盘滴定优化T 线羊抗HRP－Ⅱ多克隆抗体浓度和QBs－mAbs 用量(血清Pf 浓度为244 Parasite/μL)Table 1 Optimization of goat anti－HRP－ⅡpAbs concentration sprayed on test line and QBs－mAbs amount by using a checkerboard titration (Pf concentration of serum sample is 244 Parasite/μL)组别Group T 线羊抗HRP－Ⅱ多克隆抗体浓度Goat anti－HRP－ⅡpAbs concentration sprayed on test line(g/L)QB－mAbs 用量Volume of QB－mAbs(μL)T 线荧光强度Fluorescence intensity of test line 1
0.50.5269.38±42.22 2 1.00.5550.33±36.98 3 1.50.5582.11±19.87 4
0.51.0357.59±67.89 5 1.01.0901.93±116.60 6 1.51.0982.19±71.4 7
0.51.5341.53±40.43 8 1.01.51144.92±68.63 9 1.51.51281.33±100.58
试纸条荧光信号最佳判读时间的确定是实现试纸条定量分析的前提。

通过试纸条测定阳性血清(244 Parasite/μL)的免疫动力学曲线(图4)可见，随着免疫反应时间的延长，试纸条T 线和C 线荧光强度迅速上升，且在30 min 内FT、FC 值未达到稳定值;而FT/FC 比值在加样后10 min 后即趋于稳定，且在随后20 min 内比值无明显变化。

此结果表明，FT/FC 比值为考察对象，可在一定范围内可有效消除免疫反应动力学的差异，缩短试纸条定量分析的结果判读时间，这与本实验室前期关于胶体金免疫层析定量分析方法研究的结论一致［18］。

因此Pf 荧光试纸条最佳定量分析时间确定为加样后10 min。

3.4 QBs免疫层析试纸条定量检测Pf 的标准曲线
QBs免疫层析试纸条检测血清中Pf 的标准曲线见图5A。

血清中Pf 浓度在5.8 ～8010 Parasite/μL时，FT/FC 比值随Pf 浓度的增加而增大，其线性方程为
y=0.0113x+0.016(R2=0.999)。

当血清中Pf 浓度低于5.8 Parasite/μL 时，荧光读取仪不能读取试纸条T 线荧光数据;进一步将其置于紫外光下观测，在T 线区域
也未见荧光条带，检测Pf 阳性和阴性的试纸条实物见图5B。

依据以上结果，设定QBs 荧光试纸条检测血清中 Pf 检出限(灵敏度)为5.8 Parasite/μL。

当血清中 Pf 浓度大于8010 Parasite/μL 时，FT/FC 值出现随着Pf 浓度的增大而下降的现象。

分析其原因可能是Pf 浓度过高，使得大量游离的Pf 与T 线上抗HRP－Ⅱ多抗结合，从而阻碍了T 线多抗与Pf－QBs 探针免疫复合物结合，导致FT/FC 值下降，即出现了类似于双抗夹心免疫法中常见的Hook 效应。

图4 QBs－试纸条T、C 线免疫反应动力学曲线(Pf 浓度244 P/μL)Fig.4 Kinetic curves of immunoreaction on test line and control line of QBs－based immunochromatographic strip(Pf concentration is 244
P/μL)(▲)Fluorescence of test line (FT);(▼)Fluorescence of control line (FC);(●)FT/FC
3.5 QBs免疫层析试纸条性能评价
在阴性血清中添加高、中、低不同浓度的Pf，用QBs 荧光试纸条检测，以试纸条批间、批内的加标回收率及相对标准偏差(RSD)评价方法的准确性与精密度，结果见表2。

当Pf 加标浓度为22.25，360 和4800 Parasite/μL 时，荧光试纸条批内回收率分别为111.9%，106.9% 和93.0%;批间回收率分别为115.1%，105.1 以
及98.3%;且试纸条批间、批内测定的RSD 值均小于5%。

以上结果表明，基于量子点微球的免疫层析试纸条方法检测血清中Pf 具有良好的回收率及准确度，可对
快速、灵敏地定量分析血清中Pf。

本研究以QBs 为探针，成功建立了免疫层析法快速定量检测人体血清中Pf 的方法。

基于QBs 的高荧光强度，Pf 荧光试纸条检出限达到5.8 P/μL，灵敏度较目前常规胶体金免疫层析试纸条方法提高约10 倍。

相比于实验室常用的PCR 及金标准镜
检方法，Pf 荧光试纸条方法检测只需15 min，且不需昂贵的设备、复杂的操作以及专业的操作人员，适于Pf 的现场检测。

图5 A:QBs－免疫层析试纸条定量检测Pf 的标准曲线;B:检测阳性和阴性Pf 样品
的试纸条Fig.5 (A)Calibration curve for quantitative detection of Pf by QBs－based immunochromatographic strip and (B)image of positive and negative results for Pf detection
表2 QBs－免疫层析试纸条的精密度与准确度Table 2 Precision and accuracy
of QBs－based immunochromatographic stripPf 添加水平Spiking level of
Pf(Parasite/μL)批内Intra－assay (n=5)批间Inter－assay (n=3)回收率Recovery(%)RSD(%)回收率Recovery(%)RSD(%)480093.03.3098.33.8 360106.90.77105.11.9 22.25111.93.80115.12.9
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