转基因小鼠源性胰腺癌组织块皮下移植瘤模型的构建与评价

转基因小鼠源性胰腺癌组织块皮下移植瘤模型的构建与评价钱伟琨;李杰;严彬;曹俊宇;肖莹;秦涛;马清涌;韩亮
【摘要】目的构建基于转基因小鼠的胰腺癌组织块皮下移植瘤模型(transgenic mice-derived allografts,MDAs),为胰腺癌的体内及体外研究提供良好的实验载体模型.方法利用LSL-Kras G 12D/+;Trp 53 fl/+;Pdx 1-Cre(KPC)胰腺癌转基因小鼠的组织块进行皮下移植,构建MDAs.利用HE染色、Masson染色和免疫组化染色评价MDAs的组织病理特征及免疫细胞浸润情况.结果 MDAs成功模拟出胰腺癌的大体和组织病理形态,且其保留了胰腺癌高增殖和高间质纤维化的病理特征.MDAs的纤维化和增殖程度较正常胰腺明显增高(P<0.05);MDAs还可成功模拟胰腺癌MPO+中性粒细胞、CD68+巨噬细胞和CD3+T淋巴细胞的浸润状态.结论MDAs更利于在体内模拟胰腺癌的进展,是一种可行的胰腺癌研究模型.
【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(040)003
【总页数】6页(P368-373)
【关键词】胰腺癌;转基因小鼠;组织块;皮下移植瘤
【作者】钱伟琨;李杰;严彬;曹俊宇;肖莹;秦涛;马清涌;韩亮
【作者单位】西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院肝胆
外科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院肝胆外科,陕西西安 710061
【正文语种】中文
【中图分类】R73-3
胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，具有早期症状不明显、进展快速、治疗效果不佳等特点，其5年生存率不足8%[1-2]。

目前，对胰腺癌发生、进展及治疗的
具体机制研究尚不够全面，且缺乏有效的研究模型是制约研究的重要因素。

现阶段胰腺癌的研究模型主要有多种种属来源的胰腺癌细胞系及由其构建的皮下/原位移
植瘤模型、人源性组织块移植瘤模型(patient derived xenograft models, PDXs)、转基因小鼠模型和类器官模型等[3]。

这些模型的建立及应用对胰腺癌的基础研究
提供了良好平台，然而细胞模型的非系统性、移植瘤模型的免疫缺陷等固有缺陷也在某种程度上影响了胰腺癌的研究进展。

本研究主要利用LSL-KrasG12D/+；Trp53fl/+；Pdx1-Cre(KPC)胰腺癌转基因小鼠拟构建一种新型的胰腺癌组织块皮下移植瘤模型(transgenic mice-derived allografts, MDAs)，旨在活体内更加快速、有效、准确地模拟出胰腺癌的进展过程，助力胰腺癌的基础研究。

1 材料与方法
1.1 转基因小鼠的来源与构建课题组转基因小鼠构建于南京大学模式动物研究所，于西安交通大学医学部实验动物中心SPF级动物房进行饲养繁殖。

杂交方式如下：首先利用LSL-KrasG12D/+(K)小鼠与Trp53fl/+(P)小鼠杂交获得LSL-
KrasG12D/+；Trp53fl/+(KP)小鼠，随后将KP小鼠与Pdx1-Cre(C)小鼠杂交得
到LSL-KrasG12D/+；Trp53fl/+；Pdx1-Cre(KPC)小鼠。

在繁殖过程中出现的野
生型小鼠(WT)可作为MDAs的移植受体。

所有动物实验均遵循西安交通大学第一附属医院伦理委员会的要求。

1.2 MDAs的构建及观察选择3只KPC小鼠作为移植供体，分别编号为KPC1、KPC2和KPC3。

3只KPC小鼠为同一批繁殖子代，出生日期相差在1周之内，均于腹部可触及明显瘤体后进行剖杀。

采用颈椎脱位法将其安乐死，并在无菌条件下取其肿瘤组织并迅速转移至4 ℃ RPMI-1640培养液中，修剪后制成大小均匀的组织块(约3 mm×3 mm×3mm)供移植。

对4周龄的移植受体(WT小鼠，分3组，每组各10只，均为同一批繁殖子代)进行麻醉，颈部去毛后采用无菌操作进行组
织块颈部皮下移植。

模型构建后，对各组MDAs的瘤体生长情况及移植受体的生存状态进行监测，且
每3日用游标卡尺/体重秤对各组MDAs瘤体大小/移植载体体重进行测量记录，
于4周结束观察并对其进行安乐死，取出瘤体置于4 g/L多聚甲醛中性固定液中
固定，备用。

1.3 HE染色根据HE染色试剂盒指示，对固定的瘤体标本进行HE染色，于光学
显微镜下进行病理组织学观察。

1.4 Masson染色根据Masson试剂盒指示，对固定的瘤体标本进行Masson染色，测定瘤体中的胶原含量以反映其间质纤维化程度。

1.5 免疫组化染色分别采用免疫细胞的特异性标记对MDAs进行免疫组化染色以
反映其免疫细胞的浸润情况，其中MPO、CD68和CD3分别标记中性粒细胞、
巨噬细胞和T淋巴细胞，进行Ki67和α-SMA免疫组化染色观察增殖和间质纤维
化情况。

根据免疫组化试剂盒及各个抗体的说明书指示，对固定的瘤体标本进行免疫组化染色，其中一抗均购自武汉赛维尔，工作液稀释比分别为Ki67(GB13030-2，1∶200)、α-SMA(GB13044，1∶200)、MPO(GB11224，1∶200)、
CD68(GB11067，1∶500)及CD3(1∶500)。

测定MDAs的组织学特征和免疫细
胞浸润情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 24.0软件进行数据分析。

计量数据以均数±标准差表示，在数据符合正态性及方差齐性前提下，应用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行组间比较。

以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 MDAs的构建情况选择的3只KPC小鼠作为移植供体，并以30只WT小鼠
作为移植受体。

3只KPC小鼠生存期：KPC1存活125 d，瘤体17 mm×9
mm×6 mm，1.23 g；KPC2存活129 d，瘤体16 mm×10 mm×5 mm，1.15 g；KPC3存活126 d，瘤体18 mm×8 mm×6 mm，1.09 g。

进行组织块移植的结果显示，KPC1接受移植10只，意外死亡3只，最终成瘤7只； KPC2接受移植10只，意外死亡2只，最终成瘤8只；KPC3接受移植10只，意外死亡2只，最终成瘤8只。

KPC小鼠原位肿瘤、胰腺癌组织块及MDAs的成瘤情况如图1所示。

图1 MDAs模型的构建Fig.1 The establishment of MDAsA：KPC小鼠腹腔大
体病理形态；B：置于培养基中的胰腺癌大体标本；C：瘤体修剪后待移植的组织块；D：MDAs瘤体在体成瘤情况。

2.2 MDAs瘤体的增长曲线移植后观察4周(图2A)期间，各组移植受体体质量未
见明显变化(结果未显示)；3组MDAs的瘤体增长曲线结果(图2B)显示，移植术
后10～20 d的瘤体增长速度均较其他时段明显增快。

移植4周时，3组MDAs
的瘤体体积：KPC1(1 158±184.4)mm，KPC2(1 095±149.2)mm，KPC3(1
084±152.8)mm，未见明显差异(P>0.05，图2C)。

说明MDAs可形成具有快速
增殖能力的肿瘤组织，且具有良好的成瘤稳定性。

图2 MDAs瘤体的增长曲线Fig.2 The tumor growth curve of MDAsA：MDAs 的构建模式图；B：MDAs瘤体的增长曲线，KPC1意为基于1号KPC小鼠瘤体
构建的MDAs，KPC2和KPC3同理(*P<0.05)；C：4周末3组MDAs瘤体体积
的比较。

2.3 MDAs瘤体的大体形态及组织病理学观察结果大体病理观察可见，MDAs瘤
体呈灰白色(去除表面结缔组织、血管组织等)，质地较硬，形状类球形，瘤体外观与KPC原位胰腺癌瘤体类似；KPC原位胰腺癌组织和其对应的MDAs皮下移植瘤组织的HE染色结果显示，在MDAs皮下移植瘤组织中，肿瘤细胞呈密集排列、
多形性及细胞核异型性明显，且可见到大小不一的腺管样结构(图3)。

即在组织层
面与其母代KPC胰腺癌形态一致，从病理学角度说明MDAs可以模拟胰腺癌的进展。

图3 MDAs瘤体形态及组织病理学观察Fig.3 The macroscopic and microscopic morphology of MDAs tumor (×400)A：KPC原位胰腺癌瘤体；B：MDAs瘤体；C：KPC原位胰腺癌瘤体HE染色；D：MDAs瘤体HE染色。

2.4 MDAs瘤体的增殖及间质纤维化程度的观察采用Ki67、α-SMA和Masson
分别代表瘤体的增殖和纤维化指标[4]，用免疫组化和Masson染色分析MDAs瘤组织学特征。

结果显示，MDAs皮下移植瘤组织的增殖和纤维化程度相较于MDAs正常胰腺组织均明显升高，α-SMA阳性面积分别为(26.970±3.232)% vs.(5.280±0.660)%，Masson染色阳性面积分别为(22.430±3.936)%
vs.(0.929±0.100)%(P均<0.05)；MDAs皮下移植瘤组织的增殖和间质化程度相
较于KPC原位胰腺癌组织无差异，α-SMA阳性面积分别为(26.970±3.232)% vs.
(28.470±3.288)%，Masson染色阳性面积分别为(22.430±3.936)% vs.
(22.700±4.129)%(P均>0.05，图4)。

说明MDAs可以很好模拟出胰腺癌的高增殖和高纤维化特征，进一步从组织学特征角度印证了MDAs可以模拟胰腺癌的进展。

2.5 MDAs瘤体的免疫细胞浸润情况免疫细胞特异性标记的免疫组化结果(图5)表
明，MDAs正常胰腺组织、KPC原位胰腺癌组织、MDAs皮下移植瘤组织，均可
发现不同程度的免疫细胞浸润，且较MDAs正常胰腺组织而言，KPC原位胰腺癌组织和MDAs皮下移植瘤组织的免疫细胞浸润数量更多，MPO阳性中性粒细胞(3.533±1.383)个vs. (37.500±3.839)个vs. (37.530±4.508)个；CD68阳性巨噬
细胞(5.000±1.762)个vs. (50.170±9.259)个vs. (48.93±10.150)个；CD3阳性T 淋巴细胞(3.933±1.363)个vs. (11.370±2.735)个vs. (18.970±2.735)个，且均为
P<0.05。

这说明MDAs除可以模拟胰腺癌的进展过程外，也较传统的PDXs模型更加真实地反映了免疫系统在胰腺癌进展过程中的作用。

图4 MDAs瘤体的增殖及间质纤维化程度Fig.4 The degree of proliferation
and fibrosis of MDAs tumor (×400)A：分别为MDAs正常胰腺组织、KPC原
位胰腺癌组织及MDAs皮下移植瘤组织的Ki67免疫组化染色、Masson染色、
α-SMA免疫组化染色结果；B：每400倍镜视野下，各组Ki67阳性细胞数量的
比较；C：每400倍镜视野下，各组α-SMA移植瘤免疫组化和Masson染色阳性面积占总面积百分比的比较。

*P<0.05。

图5 MDAs瘤体的免疫细胞浸润情况Fig.5 The infiltration of immune cells in MDAs tumor (×400)A:分别为MDAs正常胰腺组织、KPC原位胰腺癌组织及MDAs皮下移植瘤组织的MPO、CD68、CD3的免疫组化染色;B:400倍镜视野下,各组胰腺组织或瘤体MPO阳性细胞、CD68阳性细胞、CD3阳性细胞数量的比较。

∗P<0.05。

3 讨论
胰腺癌模型是研究胰腺癌的基石。

细胞学模型在分子机制的研究上优于动物学模型，但动物模型可以更加系统、真实地反映出胰腺癌发生发展及治疗过程中的整体情况，其作用无可替代。

作为应用最为广泛的动物学模型，传统的移植瘤模型利用人源性
的胰腺癌细胞直接或与胰腺星状细胞一同注入免疫缺陷小鼠皮下或者原位[5-6]，
后者较前者更充分地考虑到间质成分在胰腺癌进展过程当中的作用，更为真实地模拟出了胰腺癌的发展过程。

然而，胰腺癌发生发展的微环境并不只有胰腺星状细胞的参与，还存在着免疫细胞、血管细胞、细胞外基质等多种细胞和非细胞成分[7-8]；更重要的是，全基因组测序表明，在不同个体之间甚至在同一个体的原发肿瘤和转移灶之间胰腺癌具有很强的遗传多样性，而这种基于单一来源的胰腺癌细胞所构建的移植瘤模型，不能真实反映出胰腺癌异质性的情况[9]。

为了克服这一缺点，研究者又开发并应用了PDXs模型及其衍生技术[10]，更恰当地反映了肿瘤微环境和异质性在胰腺癌进展过程中的作用。

研究表明，PDXs模型在研究抗肿瘤的药物应答中优势明显[11]；其不足之处在于人和小鼠的异种性决定了PDXs模型只能在免疫缺陷的小鼠个体上进行异种移植，这使免疫系统在胰腺癌进展过程中的作用被削弱甚至缺失，且其较长的构建周期和对肿瘤组织选择的较高要求等缺陷限制了其广泛应用。

目前，转基因小鼠是研究胰腺癌最有力的工具之一，其中应用最为广泛的为LSL-KrasG12D/+；Pdx1-Cre(KC)；LSL-KrasG12D/+；LSL-
Trp53R172H/Trp53fl/+；Pdx1-Cre(KPC)模型[12-13]，其以器官特异性Kras基因突变和或联合P53抑癌基因突变/缺失为基础，能很好模拟胰腺癌发生发展的全过程，即腺泡细胞→腺泡导管化生(acinar-to-duct metaplasia, ADM)→胰腺导管上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasias, PanINs)→侵袭性胰腺癌→胰腺癌转移癌；而其最大的缺点是构建复杂、造价高昂、实验周期较长和数量稀少，极大限制了其广泛应用[14]。

因此，本课题组在掌握了KPC模型的基础上，开发出了MDAs模型。

本实验将3只同质性较好的KPC小鼠自发胰腺癌肿瘤组织分别进行移植、观察，并应用HE
染色、免疫组化染色和Masson染色等方法，对MDAs瘤体的大体形态、组织病理特征、免疫细胞浸润等多角度进行观察。

结果表明，MDAs可真实模拟胰腺癌
的组织病理形态、高增殖和高纤维化特征，且实验周期短而稳定，在移植1周后特别是10～20 d这一时间段内，MDAs瘤体的增长速度明显高于其他时间段，这可能与肿瘤的血管生长及肿瘤突破宿主的免疫系统有关；此外，在胰腺癌的发生发展过程中，免疫因素是极为重要的因素，与基于免疫缺陷小鼠构建的移植瘤模型(无论是人源性细胞移植瘤模型还是PDXs模型)相比，MDAs最大的优势是可以真实反映免疫系统对肿瘤进展的影响。

本实验所采用的是小鼠源性胰腺癌肿瘤组织，其可在同种小鼠个体上进行同种异体杂交，无需使用免疫缺陷小鼠，因而在胰腺癌的发展过程中免疫系统功能未受破坏，结果表明，MDAs可准确模拟出胰腺癌免疫细胞的浸润情况；值得一提的是，KPC模型无疑是研究胰腺癌发生与进展的最佳模型之一，而其造价高昂、建模技术复杂、周期长和规模难以控制，限制了其大规模应用，而利用MDAs则可以弥补KPC模型的缺陷，可更加快速、大规模用于胰腺癌生长、进展及药物疗效等方面的研究。

综上所述，MDAs模型在胰腺癌研究中的优势：①可以准确模拟胰腺癌的病理学形态和特征；②增殖快速，研究周期短且具有良好的稳定性；③具有胰腺癌微环境特别是免疫系统的参与；④较KPC模型，养殖规模可控，且同质性较好。

而MDAs最大的缺陷是需要成熟的KPC模型作为支撑；此外，MDAs皮下富血供环境与胰腺癌的乏血供特点不相符。

因此，下一步将致力于完善MDAs，进行胰腺癌组织块原位移植瘤小鼠模型的构建，以便为胰腺癌研究提供更真实的模型。

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