c-Met与ERKs正反馈信号环路促进结直肠癌HCT116细胞的肿瘤生成

刘敏丽１，张 雨２，武浩宇３，王凯钰３，党浩平３，常 琦３，黄 江３，贺晓斌３，赵利平３，张生军３
摘要：目的 探讨结直肠癌 ＨＣＴ１１６细胞肿瘤发生的分子机 制。方法 细胞学实验检测结直肠癌 ＨＣＴ１１６细胞中 ｃＭｅｔ 和 ＥＲＫｓ的表达；体外结合实验检测 ｃＭｅｔ和 ＥＲＫｓ的相互 作用；在结直肠癌 ＨＣＴ１１６细胞及裸鼠成瘤模型中，通过过 表达或沉默 ｃＭｅｔ和 ＥＲＫｓ检测 ｃＭｅｔ和 ＥＲＫｓ的关系。结 果 细胞学实验表明，在结直肠癌 ＨＣＴ１１６细胞中 ｃＭｅｔ及 ＥＲＫｓ过表达。体 外 结 合 实 验 表 明，ｃＭｅｔ可 以 和 ＥＲＫｓ结 合。细胞及动物实验表明，沉默或过表达 ｃＭｅｔ／ＥＲＫｓ，可以 引起 ＥＲＫｓ／ｃＭｅｔ的相应变化。结论 在结直肠癌 ＨＣＴ１１６ 细胞中，ｃＭｅｔ和 ＥＲＫｓ正反馈作用促进结直肠癌的发生。 关键词：结直肠肿瘤；ＨＣＴ１１６；ｃＭｅｔ；ＥＲＫｓ 中图分类号：Ｒ７３５５ 文献标志码：Ｂ 文章编号：１００１－７３９９（２０１９）０９－１１０８－０４ ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１９．０９．０２５
结直肠癌是目前全球发病率最高的消化道恶性肿瘤，特 别是在发达国家和地区，随着生活水平的提高和饮食结构的 改变，我国 结 直 肠 癌 的 发 病 率 也 呈 现 逐 年 上 升 的 趋 势。 ｃ Ｍｅｔ是酪氨酸激酶受 体 （ＲＴＫ）与 肝 细 胞 生 长 因 子 （ＨＧＦ）结 合后，与其他的 ＲＴＫ激活一样，形成自身二聚体或寡聚体， 从而激 活 ｃＭｅｔ，在 Ｃ 末 端 多 个 位 点 发 生 自 身 磷 酸 化 （Ｙ１２３５、Ｙ１３４９、Ｙ１３５６）［１］。ＥＲＫｓ信号通路是调控细胞的一 个重要信号通路，目前已知 ＥＲＫｓ信号通路的活化与结直肠 癌的发生、发展及生物学行为密切相关［２］。因此探索 ｃＭｅｔ 和 ＥＲＫｓ之间的关系是揭开结直肠癌发生、发展神秘面纱的 一个重要环节，为结直肠癌的靶向治疗提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
接受日期：２０１９－０４－０５ 基金项目：北京医卫健 康 公 益 基 金 （ＹＷＪＫＪＪＨＫＹＪＪＢ１７７７５）、延 安 大
学 附 属 医 院 ２０１８年 度 院 内 培 育 基 金 项 目 重 大 项 目 （２０１８ＺＤＡ０３） 作者单位：１延安大学医学院病理学教研室，延安 ７１６０００ ２延安大学附属医院普外科，延安 ７１６０００ ３西安交通大学医学部 ２０１７级临床医学专业（５＋３）规
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临床与实验病理学杂志 ＪＣｌｉｎＥｘｐＰａｔｈｏｌ ２０１９Ｓｅｐ；３５（９）
网络出版时间：２０１９－９－１２７：２１ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０７３．Ｒ．２０１９０９１２．０７２０．０２５．ｈｔｍｌ
ｃＭｅｔ与 ＥＲＫｓ正反馈信号环路促进结直肠癌 ＨＣＴ１１６细胞的肿瘤生成
培，西安 ７１００４９ 作者简介：刘敏丽，女，副教授。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｍｉｎｇｌｉ１２＠１２６．ｃｏｍ
张 生 军，男，主 任 医 师，副 教 授，通 讯 作 者。 Ｅｍａｉｌ： ｙａｎｚｈａｎｇｓｈｅｎｇｊ＠１６３．ｃｏｍ
１．１．１ 实验动物 ＳＰＦ级 ６～８周龄雄性裸鼠，重 ２０～２５ｇ。 动物生产许可证号 ＳＣＸＫ（陕）２０１２００３，动物使用许可证号 ＳＹＸＫ（沪）２０１４００２７。本 实 验 经 延 安 大 学 附 属 医 院 伦 理 委 员会批准。 １．１．２ 试 剂 ｐＣＤＮＡ３ＨＡｃｍｅｔ、ｐＣＤＮＡ３ＦｌｇＥＲＫｓ质 粒 购自 Ａｄｄｇｅｎｅ公司；ｃＭｅｔ及 ＥＲＫｓｓｉＲＮＡ购自 ＳａｎｔａＣｒｕｓ公 司；ＨＣＴ１１６细胞购自 ＡＴＣＣ公司；ＥＧＦ购自 ＳａｎｔａＣｒｕｓ公司； ｃＭｅｔ活性激酶购自 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；ＥＲＫｓ１／２、ｐＥＲＫｓ１／２、ｃ Ｍｅｔ、ｐｃＭｅｔ、βａｃｔｉｎ抗体购自 ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司。 １．２ 方法 １．２．１ ＨＣＴ１１６细胞培养 人结直肠癌 ＨＣＴ１１６细胞常规 培养于含 １０％灭活胎牛血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养基中；鼠表 皮成纤维细胞 ＪＢ６Ｃ１４１培养于含 ５％灭活胎牛血清的 ＭＥＭ 培养基中。均置于 ３７℃、５％ＣＯ２ 孵箱内培养；０２５％胰酶 消化细胞后，用含 １０％ＤＭＳＯ的胎牛血清冻存细胞。 １．２．２ 质粒及小发卡干扰 ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）准备 ｐｃＤＮＡ３ ＨＡｃＭｅｔ或 ｐｃＤＮＡ３ＦｌａｇＥＲＫｓ被转 染 进 入 ＪＢ６Ｃ１４１细 胞 中，然后用 Ｇ４１８筛选 ｃＭｅｔ或 ＥＲＫｓ过表达的稳定细胞株。 用 ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ软件合成 ｃＭｅｔ及 ＥＲＫｓｓｉＲＮＡ模板序列， ｓｉｃＭｅｔ正 义 链 ５′ＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡ ＧＡＡ３′，反 义 链 ５′ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＧＴＣＴＣＡ ＴＴＣＧ３′；ｓｉＥＲＫｓ正 义 链 ５′ＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＡＣＡＡＡＣＣＴ ＣＴＴＡＴＣＴＧＧＡＡ３′，反 义 链 ５′ＴＣＣＴＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴ ＧＡＧＡＣＡＡＡＣＣＴＣ３′。然后 分 别 通 过 慢 病 毒 包 装 的 方 式 将 ｓｉｃＭｅｔ及 ｓｉＥＲＫｓ转染 ＨＣＴ１１６细胞，通过嘌呤霉素筛选 ｃ Ｍｅｔ或 ＥＲＫｓ沉默的稳定细胞株。 １．２．３ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测 取对数期生长细胞，以 ７×１０５ 个 每毫升接种于 １０ｃｍ培养皿中，待细胞密度达 ７０％ ～８０％ 时，加入 ２００μＬＲＩＰＡ裂解液，用细胞刮将细胞破碎，收集于 １５ｍＬＥＰ管中，超声 ５ｍｉｎ打断核酸链，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ，收集 上 清，定 量，电 泳，转 膜，５％ ＢＳＡ封 闭 １ｈ后， ４℃孵育一抗过夜；次日，ＴＢＳＴ洗膜 ３次，每次 ５ｍｉｎ，加入 ＨＲＰ标记的二抗，ＴＢＳＴ清洗，ＥＣＬ发光检测。每组实验至少 重复 ３次。ＩｍａｇｅＪ１２Ｘ分析灰度值。 １．２．４ 免疫共沉淀实验 将过表达 ｃＭｅｔ的 ２９３Ｔ细胞，用 ＣＨＡＰＳ免疫沉淀裂 解 液 裂 解 细 胞，超 声，离 心 取 上 清，上 清 中加 入 ３０μＬｐｒｏｔｅｉｎａｇａｒｏｓｅＡ／Ｇ（ｂｅａｄｓ）于 ４℃ 孵 育 ３０ ｍｉｎ，离心后 取 上 清 于 新 的 ＥＰ管 中，往 上 清 中 加 入 ２０μＬ ＥＲＫｓ抗体，４℃孵育过夜，后加入 ４０μＬｐｒｏｔｅｉｎａｇａｒｏｓｅＡ／Ｇ 孵育 １ｈ，离心后将沉淀用裂解液清洗 ３次，离心，向沉淀中 加入上样缓冲液，９５℃加热 ３ｍｉｎ，然后用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检