实验六 考马斯亮蓝染色显示细胞骨架2009-4

样0分钟
⑤
5分钟
⑦
20分钟
洗两 次各 5分 钟
⑨
⑧
⑦
10分钟 5分钟 加盖 玻片
镜 检
②
④
⑥
⑥
注意事项
洋葱鳞茎内表皮不必剪得过大，否则很难平整地 铺开在载玻片上，而是部分重叠着，影响观察效 果。 另外，在用高倍镜观察之前要盖上盖玻片，如果 载玻片上较干，最好先滴上一滴水后再盖盖玻片， 以免造成很多气泡，影响观察效果。 染色时间不宜过长，否则会染色过甚反而观察效 果不佳。 用1%Triton X-100抽提杂蛋白的时间要控制好， 时间长将破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大， 影响观察效果。 偶数离心管为对照管，奇数离心管为样品管。

中等纤维
微管
微丝
免疫荧光染色：
左：微丝，中：微管 ，右：中等纤维
微管

微管的形态结构：中空的圆柱状结构。横断面上 看是由13根原纤维纵向围绕而成。
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细胞质中大部分微管为单管
实验六
考马斯亮蓝染色显示细胞骨架
一、实验目的
1、了解细胞骨架成分显示方法的原理
和操作步骤； 2、观察微丝在细胞中的分布。
二、实验原理
考马斯亮蓝R250(Coomassie blue R250)是 一种蛋白质染料，能非特异地显示细胞骨架蛋白。 用含去垢剂TritonX-100的缓冲液处理细胞，可 将细胞的膜结构和部分蛋白质抽提掉，但细胞骨 架系统的蛋白质却被保留，用考马斯亮蓝R 250 染色后，在光学显微镜下可见一种网状结构，其 主要成分为直径40nm左右的微丝束。 观察时可能会发现细胞膜上有些孔洞，甚至 有些细胞变空了，这可能是由于Triton X-100处 理时间过久破坏细胞结构所致。
洋葱表皮细胞（对照组，100倍）
值日
请大家在实验后把桌面整理好，补好枪 头， 注意废弃物的处理，使用过
的枪头、盖玻片、洋葱放在废物 桶里。小烧杯洗干净，载玻片去 掉盖玻片后冲洗干净，交到回收 框中。登记显微镜使用记录本，经助教 检查后再离开!
每一个学生 复式显微镜（带油浸物镜）（microscope） 每一组学生 擦镜纸（lens paper）；记号笔；小片滤纸；载玻 片；盖玻片；剪刀；小镊子；移液枪；1ml枪头； 洋葱鳞茎（置于小烧杯中） 9个5ml离心管：①1%TritonX-100；②③M缓冲液； ④⑤3%戊二醛；⑥⑦磷酸缓冲液；⑧⑨0.2%考马斯 亮蓝R250染色液（可从试剂瓶中吸取）

五、作业
1.
简单画出所观察到的图像（包括对照）并分 析。（10倍镜或40倍镜）
六、思考题
1、用1%的Triton X-100处理细胞的作用是什么？ 2、M缓冲液的作用是什么？ 3、比较微丝、微管、中间纤维的差别，如分布、 结构、功能等。

洋葱表皮细胞（200倍）

洋葱表皮细胞（400倍）

单管 A B
主要构成鞭毛、纤毛。
二联管
A
B 三联管
C
主要构成中心粒。
微管的化学组成：
微管蛋白 (55ku 450aa) 微管蛋白 (55ku 550aa)
2个鸟嘌呤核苷酸结合位点。
异 二 聚 体
二价阳离子结合位点。 秋水仙素、长春花碱结合位点。
首尾相连 原纤维
（13）
微管
微管的功能：
维持细胞形态：微管具有一定刚性，在保持细

四、实验操作
1．用小镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约1cm见 方（每人做两片，不要太大，否则不易展开），分 别放在两离心管[一离心管放两片]（①含0.5ml 1%TritonX-100，②含0.5ml M缓冲液对照），处理 20分钟。 2．将①中的洋葱表皮用镊子夹出，放入③0.5ml M缓 冲液的离心管中处理5分钟。对照②维持原样。 3．将②③管中的表皮夹出，分别放入④⑤0.5ml 3%戊 二醛固定液的离心管中固定20分钟。 4．将④⑤管中的表皮夹出，分别放入⑥⑦0.5ml的磷 酸缓冲液的离心管中洗两次，每次5分钟（洗完吸掉 液体）。

研究的历史
1879年，弗莱明（W.Flemming）首先观察和描述了 有丝分裂过程，并指出细胞质由纤维网络及网络中 的非纤维物质组成。 20世纪60年代开始在电镜切片中看到骨架纤维。60 年代末以来，相继分离提纯了各种骨架蛋白，并制 备出相应的抗体。 1974年，拉扎里季斯（zarides）和韦伯 （K.Weber）首先应用间接免疫荧光技术研究了细胞 骨架。 70年代中期以后细胞骨架的研究已成为细胞 生物学中最大的分支学科之一。 最近新发展的影像增强技术使在活细胞内对细胞骨 架的观察有了可能，特别是这种方法结合荧光猝灭 技术，对在分子水平上弄清细胞骨架的结构与功能 将是个有力的推动。
中等纤维
形态与分布：中等纤维是一类中空的纤维状结构，单根或成
束分布于细胞质中，常形成精细发达的纤维网络，外与细胞
膜有细胞外基质相连，内与核纤层有直接的联系。中等纤维 与微丝、微管及其他细胞器也有着错综复杂的纤维联络。
显示细胞骨架的非特异性方法
培养的成纤维细胞用 Coomassie blue染色的结果。
胞外形方面起支撑作用。细胞突起部分，如伪足、 鞭毛、纤毛、神经轴突的形成和维持，都是微管 在起关键作用。
细胞与细胞器运动：中心体；鞭毛和纤毛的结
构（“9+2”图式）
参与物质的运输：线粒体、突触小泡、前溶酶
体小泡、内吞小泡等，与膜更新有关的蛋白质， 都是通过微管运输的。
微丝
形态：是一类由蛋白纤维组成的实心纤维细丝。 6-7nm， 长短不一。 在细胞中：微丝可成束、成网或纤维状分散分布 肌细胞：微丝形成特定的稳定结构； 非肌细胞：微丝常分布在细胞膜下方，多呈现一种动态结构。
细胞松弛素可特异性的破坏微丝组装；鬼笔环肽：稳定、促进微丝聚合。
非肌细胞中肌动蛋白单体（G-actin）与纤维（F-actin）在 一定条件下互相转化。在含有ATP和Ca2+、低浓度的单价离 子(Na+、K+等)溶液中微丝趋向解聚G-actin；在含有 Mg2+和高浓度的Na+、K+离子溶液中微丝趋向聚合（Gactin—F-actin），溶液ｐＨ＞7，易于进行微丝的组装。 本实验中M缓冲液提供的离子条件可使F-actin稳定。
显示细胞骨架成分的特异性方法
1、特异性的药物结合反应： 如罗丹明标记的鬼笔环肽，可以显示微丝。 2、免疫细胞化学方法： 制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫荧光、 免疫酶标的方法显示细胞骨架。
电子显微镜下的细胞骨架
小肠上皮细胞的冰冻蚀刻的电镜照片，显示细胞质膜下面的 细胞骨架网络——终末网。
三、实验用品
接上页
3．将②③管中的表皮夹出，分别放入④⑤0.5ml 3% 戊二醛固定液的离心管中固定20分钟。 4．将④⑤管中的表皮夹出，分别放入⑥⑦0.5ml的 磷酸缓冲液的离心管中洗两次，每次5分钟（洗完吸 掉液体）。 5．在⑥⑦管中的表皮夹出，分别放入⑧⑨0.5ml的 0.2%考马斯亮蓝R250染液中，染色10分钟。 6．夹出⑧⑨两管中的表皮，再放入⑥⑦管中，各加 入0.5 ml磷酸缓冲液洗一次，5分钟。然后将表皮 （带少量液体）平铺在载玻片上，加盖玻片，显微 镜下观察。

细胞骨架：指真核细胞中位于细胞质、细胞 核的蛋白质纤维组成的网架系统。
作用：在细胞的形态维持、细胞的运动、物质运 输、能量转换和细胞分裂中发挥重要作用。 三种组成成分： 微丝、微管、 中等纤维

核糖体 线粒体 内质网 微管 微梁网络 微丝
细胞骨架的特征
1、动力学可变性：各种细胞运动如肌肉收缩、 鞭毛摆动、纤毛煽动、有丝分裂期的染色体移动 及各种细胞运动均依赖于细胞骨架。如有丝分裂 期由微管组成的纺锤丝的延长与缩短。细胞骨架 在细胞内处于不断的重组状态。 2、与细胞器等发生可逆的联系：细胞骨架可决 定细胞器及一些生物大分子的定位及运动，因而 对细胞器及一些生物大分子的移动、运输、分泌 等许多重要细胞学功能甚至整个细胞的代谢活动 的调节都有密切关系。