第二讲：流式细胞术原理FSC与SSC

第二讲：流式细胞术原理FSC与SSC
我们在第一讲：流式细胞术概述中介绍了流式细胞术是什么，能够检测哪些样本的哪些参数，三大系统以及数据的呈现形式；另外，我们前段时间为大家分享了常用流式细胞仪荧光参数。

这一讲，实验小白为大家简单介绍一下流式细胞术的基本原理以及FSC和SSC这两个参数的用处。

流式细胞术原理
在一定的压力下，鞘液带着细胞通过喷嘴中心进入到流式照射室，在流式照射室的分析点，激光照射到细胞发生散射和折射，发射出散射光（包括前向散射光和侧向散射光）；同时细胞所携带的荧光素被激光激发并发射出荧光。

前向散射光（Forward scatter, FSC）和侧向散射光（side scatter, SSC）检测器把散射光转变成电信号。

而荧光则被聚光器收集，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增检测器，把荧光信号也转变成电信号。

这些电信号再经过数据化处理后输入电脑并储存，即可对细胞进行分析或分选。

流式细胞术中的三大系统
根据工作原理，流式可以划分为液流系统、光学检测系统和电子控制系统三大系统：
液流系统：流动室及液流驱动系统。

光学检测系统：激光光源及光束形成系统；聚焦光源透镜、各种滤光片；光电倍增管（PMT）收集不同波长荧光信号。

电子控制系统：荧光信号转换为电信号，并将信号放大；电信号转化为数字信号；流式软件：收集，分析，数据和图片的输出。

液流系统单细胞液流的形成
我们在第一讲中就介绍了流式细胞术就是利用流式细胞仪对处在
快速直线流动状态的单细胞进行逐个分析的技术。

那么单细胞液流是如何形成的呢？
重点：FSC和SSC参数
实验小白将实验样本制备成单细胞悬液，染色后就可以上机检测了。

单细胞悬液在上述的液流系统带动下逐个通过流式细胞仪的检测点，经过机器内部复杂的处理后，我们就可以得到一系列的数据。

然而，不管您是做什么流式实验，最先得到的都是FSC和SSC数据。

即使样本没有经过任何染色，您也可以得到FSC和SSC数据。

1. FSC和SSC参数的意义
1
前向散射光，FSC，
反映的是细胞的大小。

2
侧向散射光，SSC，
反映的是细胞的复杂程度。

2. FSC和SSC参数的用处 A用于区分白细胞亚群
如上图所示，由于淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的FSC和SSC的参数不同，因此，我们可以用这两个参数将这些细胞区分开。

这对于我们更进一步分析其亚群的比例和功能至关重要。

B用于去除双联体细胞
我们一直强调流式细胞术是逐个检测和分析单个细胞的技术方法，因此，如果有细胞-细胞粘连在一起，会导致分析的结果不准确。

如何排除这种干扰呢？FSC和/或SSC参数又派上用场了。

1
FSC-A vs. FSC-H作图，
选出单细胞。

2
FSC-W vs. FSC-H作图，
选出单细胞。

“小白”粉
FSC-A vs. FSC-H和FSC-W vs. FSC-H做的图不一样啊，哪一种比较好？其实除了这两种，还有用SSC-A vs. SSC-H或者SSC-W vs. SSC-H作图去除双联体细胞的。

有选择障碍的小白怎么办......
首先你得知道A(area)、W(width)、H(height)都是啥意思（见下图）!
实验小白砖家
Rodrigo Pestana Lopes · Becton, Dickinson and Company接着解释道：
The basics of doublet discrimination is to detect disproportions between cell size vs. cell signal. Digital instruments have a function that allows one to correlate A and H so that they present the same variation when PMT voltages are changed, so that they can be correlated one to the other. In BD instruments we call this Area Scaling. When this factor is set properly, even though the voltage pulse is different between A and H, they will have the same reported value (that will be used to represent this particular event in the dot plot). So, if anyone has ever positioned the same parameter on both axis of a dot plot, you'll know that the graph that will apear is a perfect diagonal line (45 degrees, passing through ZERO). So, the basics of A vs. H strategy is, assuming that the instrument is set correctly and that A equals H, when correlating the same parameter (for
instance, FSC) A vs. H, the same cell will have the same (or very similar) value in both axis. Therefore, all singlet events will be presented in a more diagonal display than doublets.
实验小白砖家
“小白”粉
能说人话吗？
Rodrigo Pestana Lopes接着说：
However here is a thing that very few people no: the only way you can correctly discriminate doublets using the FSC-H vs. FSC-A strategy is ensuring that FSC Area Scaling has been set correctly (not with beads, but with the cells from your experiment). If this has not been done, there is a chance of error.
实验小白砖家
“小白”粉
What are you talkling about？
Rodrigo Pestana Lopes接着说：
Using the H vs. W strategy though is not affected by Area Scaling since both parameters are independent one from another. Therefore, it tends to be the more accurate way of performing doublet discrimination.
实验小白砖家
“小白”粉
您再这样，我就去屎......
就是能用FSC-W vs. FSC-H去除双联体细胞，就不用FSC-A vs. FSC-H；SSC与之相同。

实验小白砖家
“小白”粉
懂了，还是中文最屌！
C巧用FSC参数研究细胞-细胞接触机制
简单的说，作者发现CD4+CD19+cells,猜测是CD4+T细胞与CD19+B细胞粘连在一起了。

为了证明这个假设，作者用流式检测了CD4+T细胞以及B细胞的的FSC值约为1000，而CD4+CD19+cells 的FSC值大约为2000.因此，流式结果进一步提示CD4+CD19+cells 是T cell-B cell conjugates.【数据来自于Nature Immunology,2009,10(4):385-393】，详细内容请参考巧用流式细胞术研究细胞-细胞接触机制文章。

作者简介。