人工合成的亚硝基化合物MNNG致人胃黏膜上皮细胞恶性转化模型的建立及机制分析

人工合成的亚硝基化合物MNNG致人胃黏膜
上皮细胞恶性转化模型的建立及机制分析
王霞，叶景鸿，许尤琪
南京中医药大学第二附属医院（江苏省第二中医院），南京210017
摘要：目的建立人工合成的亚硝基化合物N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）暴露致人胃黏膜上皮细胞GES-1恶性转化的模型，并分析其作用机制。

方法取GES-1细胞，分为空白对照组、溶剂对照组和MNNG诱导组。

空白对照组正常培养，MNNG诱导组在培养基中加入2μmol/L的MNNG，溶剂对照组加入等体积的DMSO。

常规培养4周。

于实验第5周行病理染色观察三组细胞形态，细胞克隆形成实验检测细胞克隆能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Western blotting法检测细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达，qPCR法检测LC3Ⅱ、Beclin1mRNA表达，裸鼠成瘤实验检测各组细胞成瘤能力。

结果MNNG诱导组细胞体积增大，形态不规则，排列紊乱，部分细胞呈团块状生长，部分细胞呈梭形。

与空白对照组相比，MNNG诱导组细胞克隆形成数目明显增多，细胞迁移速度增高（P均
<0.05），LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表达水平降低（P均<0.05），裸鼠成瘤能力增加。

结论成功建立MNNG致人
胃黏膜上皮细胞恶性转化模型，其机制可能与自噬相关。

关键词：人胃黏膜上皮细胞；亚硝基化合物；N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍；细胞恶性转化；细胞自噬；细胞模型
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.02.010
中图分类号：R735.2文献标志码：A文章编号：1002-266X（2021）02-0046-04
Establishment of MNNG-induced malignant transformation model of human gastric
mucosal epithelial cells
WANG Xia，YE Jinghong，XU Youqi
The Second Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing210017，China Abstract：Objective To establish a model of malignant transformation of human gastric mucosal epithelial cells GES-1by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine（MNNG）exposure and to explore the mechanism.Methods GES-1 cells were divided into three groups：the blank control group，solvent control group，and MNNG-induced group.The cells in the blank control group were cultured normally.The cells in the MNNG-induced group were added with2μmol/L MNNG in the medium，and the solvent control group with equal volume of DMSO.GES-1cells were treated for4consecu‑tive weeks.On the5th week，the cell morphological changes in each group were observed.Cell clone formation experi‑ment was performed to test the cell cloning ability，Scratch test to detect cell migration ability，and Western blotting to de‑tect the expression levels of autophagy-related proteins LC3Ⅱand Beclin1，qPCR to detect the expression levels of LC3Ⅱand Beclin1mRNA，and nude mice tumor formation test to detect the tumor formation ability of cells in each group.Re⁃sults In the MNNG-induced group，the volume of cells increased，the morphology was irregular，and the arrangement was disordered；some cells grew into clumps，and some cells became pared with the blank control，the number of cell clone formation in the MNNG-induced group increased significantly，cell migration capacity was signifi‑cantly enhanced，the protein and mRNA expression levels of LC3Ⅱand Beclin1decreased（all P<0.05），and the tumor formation ability in the nude mice increased in the MNNG-induced group.Conclusion The model of MNNG-induced malignant transformation of human gastric mucosal epithelial cells is established successfully and it might be related to au‑tophagy.
Key words：human gastric mucosal epithelial cells；nitro compounds；N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine；malig‑nant transformation of cells；autophagy；cell model
基金项目：江苏省自然科学青年基金资助项目（BK20171096）；全国中医药创新骨干人才培训项目（国中医药人教函2019-128号）。

通信作者：王霞（E-mail：efy067@）
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胃癌的病因复杂，其中饮食习惯是一个相当重要的影响因素。

在中国人偏爱的腌制食品中含有大量亚硝胺类化合物，而亚硝胺类化合物是胃癌发生的高危因素。

N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）是人工合成的亚硝基化合物，常作为典型的模式化学诱变剂和致癌剂用于研究N-亚硝基类致癌物的致癌机制。

我们前期的研究证实，MNNG能诱导大鼠胃癌前病变的发生，是研究天然植物预防胃癌的最常用致癌剂［1］。

人胃黏膜上皮细胞GES-1具有正常人胃上皮细胞的特性和功能，可以在体外稳定传代，常被用于研究胃上皮细胞恶性转化以及胃癌的发生。

2017年7月—2018年7月，我们采用MNNG 诱导GES-1细胞恶性转化，观察其对GES-1细胞形态及细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响，探讨MNNG 构建胃黏膜上皮细胞恶性转化模型的可行性及其作用机制。

1材料与方法
1.1细胞、试剂与仪器人胃黏膜上皮细胞GSE-1由酶联生物公司提供。

MNNG（士锋生物），RNA提取试剂（康为世纪），RIPA细胞裂解液（北京普利莱基因技术有限公司），PVDF膜（Millipore），超敏发光液（赛默飞），小鼠抗人GAPDH单克隆抗体、辣根酶标记山羊抗鼠IgG（中杉金桥，1∶2000），兔抗人LC3Ⅱ多克隆抗体（博奥森生物，1∶1000），兔抗人Be‑clin1多克隆抗体（Abcam公司，1∶2000）。

显微镜（OLYMPUS），CO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），荧光PCR仪、超高灵敏度化学发光成像系统［伯乐生命医学产品（上海）有限公司］，蛋白垂直电泳仪（北京市六一仪器厂），倒置荧光显微镜（广州市明美光电有限公司）。

1.2细胞培养取GES-1细胞，加入DMEM培养液，置于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。

当细胞密度达到80%时，PBS冲洗，加入0.25%胰酶消化。

收集细胞悬液，1000r/min离心3min，弃上清液，加入培养基重悬细胞，放入培养箱中继续培养。

取对数生长期细胞，加入6孔板中，加入10%DMEM 调整细胞密度为5×105/孔，放置培养箱中培养。

1.3细胞分组与处理待细胞完全贴壁后，将细胞分为空白对照组、溶剂对照组和MNNG诱导组。

MNNG加入适量DMSO溶解，配成0.17mmol/L的MNNG溶液，用含10%FBS的RPMI1640培养液稀释成2μmol/L的MNNG溶液。

空白对照组正常培养，MNNG诱导组用含2μmol/L MNNG的培养液培养，溶剂对照组加入等体积的DMSO［2］。

持续4周，其间正常传代培养；第5周观察细胞恶性转化情况。

1.4细胞形态学观察采用伊红染色。

向细胞中加入细胞固定液固定15min，PBS浸洗3次。

苏木精染色3min，盐酸乙醇分化液分化15s，返蓝液返蓝15s，流水冲洗。

伊红染色3min，流水冲洗，脱水，透明，超净高级封片胶，200倍显微镜下观察。

1.5细胞增殖能力观察采用平板克隆实验。

取细胞培养至对数生长期，加入0.25%胰蛋白酶消化，离心，制成细胞悬液，按3×102/孔接种于6孔板中。

加入20%DMEM培养10d，待集落形成后，弃培养液，PBS浸洗，加入甲醇—醋酸固定液（甲醇∶醋酸=3∶1）固定15min。

弃固定液，加入Giemsa染液染色10～30min，流水洗去染色液，空气干燥。

将平皿倒置，叠加一张带网格的透明胶片，在倒置显微镜（×100）下计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.6细胞迁移能力观察采用细胞划痕实验。

取细胞加入6孔板，培养至细胞密度达到90%以上。

使用无菌10μL枪头沿6孔板底部做“一”形划痕，保证每孔宽度尽量一致。

弃培养基，PBS清洗3次，换成无血清培养基后拍照。

将细胞放入培养箱中继续培养，于24、48h时再次拍照。

根据0、24、48h的划痕宽度计算24h和48h的细胞迁移速度，细胞迁移速度=迁移距离/迁移时间。

1.7细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达检测采用Western blotting法。

取细胞加入裂解液，冰上裂解30min后，4℃、10000r/min离心10min，收集上清液，获得总蛋白。

BCA法测定总蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸使蛋白变性。

取总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转至PVDF膜上，4%脱脂奶粉封闭。

加入一抗，4℃孵育过夜；加入相应的二抗，室温孵育1～2h。

滴加ECL曝光液，凝胶成像系统中曝光。

采用Quantity One软件分析抗体条带灰度值。

以目标条带与内参的灰度比值表示目标蛋白的相对表达量。

1.8细胞LC3Ⅱ、Beclin1mRNA表达检测采用荧光定量PCR法。

提取细胞RNA，逆转录合成cDNA。

以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行扩增。

扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下：LC3Ⅱ上游引物5'-AGCAG‑CATCCAACCAAAAT-3'，下游引物5'-CGTCTCCT‑GGGAGGCATA-3'，产物长度281bp；Beclin1上游引物5'-AAAACCAGATGCGTTATGCC-3'，下游引物5'-CAGCCTGAAGTTATTGATTGTG-3'，产物长度为119bp。

PCR反应体系（25μL）：RNase Free dH2O 9.5μL，cDNA/DNA1μL，上游引物1μL，下游引物
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1μL，2×ULtra SYBR Mixture12.5μL。

反应条件：预变性95℃10min，变性95℃10s，退火57℃30s，延伸72℃30s；循环40次。

以GAPDH为内参，计算目的基因的相对表达量。

1.9裸鼠成瘤情况观察取4～6周龄裸鼠15只，随机分成3组，每组各5只。

取空白对照组、溶剂对
照组和MNNG诱导组细胞株，加入0.25%胰酶消化，PBS离心洗涤，配制成细胞密度为5×106/mL的细胞悬液。

取0.2mL细胞液（约1×106个细胞），接种于裸鼠右前肢皮下。

继续饲养4周，每隔4d测量裸鼠体质量，观察瘤体生长情况。

4周末处死裸鼠，取出瘤体，观察瘤体情况；行HE染色，200倍光镜下观察瘤体病理变化。

1.10统计学方法采用SPSS19.0统计软件。

计量资料以-x±s表示，组间两两比较采用t检验。

P< 0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1三组细胞形态改变情况空白对照组、溶剂对照组细胞形态规则，排列有序，多成单层生长，形状以多边形为主，MNNG诱导组细胞体积增大，形态不规则，排列紊乱，部分细胞呈团块状生长，部分细胞呈梭形。

HE染色后，MNNG诱导组可见核分裂像，多数细胞具有单核，也出现多核巨大细胞，胞质内可见空泡，细胞周边毛刺状。

2.2三组细胞增殖能力比较空白对照组、溶剂对照组、MNNG诱导组细胞克隆形成率分别为7.44%±0.12%、10.12%±1.45%、18.61%±2.01%，MMNG诱导组细胞克隆形成率高于其他两组（P均< 0.05）。

2.3三组细胞迁移能力比较24h时空白对照组、溶剂对照组、MNNG诱导组细胞迁移速度分别为（4.84±1.12）、（5.09±1.22）、（5.70±0.27）μm/h；48h时三组细胞迁移速度分别为（6.57±0.93）、（6.21±0.51）、（8.35±0.50）μm/h。

MNNG诱导组细胞迁移率高于空白对照组、溶剂对照组（P均<0.05）。

2.4三组细胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表达水平比较与空白对照组、溶剂对照组比较，MNNG诱导组LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表达水平均降低（P均<0.05）。

见表1。

2.5三组细胞成瘤情况三组裸鼠均存活，摄食、活动量、精神状态正常，体质量无明显变化。

空白对照组、溶剂对照组未成瘤，MNNG组成瘤4只。

MNNG组接种1周后注射局部可触及肿物，呈局限膨胀性生长，3周左右瘤体不再继续增大，未观察到明显的浸润或转移灶。

瘤体剥离后见完整包膜，血供丰富，表面光滑，边界清楚。

HE染色显示，肿瘤组织炎性细胞浸润，细胞结构紊乱，排列不规整。

3讨论
胃癌发病隐匿，早期症状不明显，多数患者就诊时已发生局部或远处转移，预后不佳，晚期胃癌的5年生存率仅为15%左右［3］。

研究胃癌发病的影响因素，对早期预防胃癌、减少肿瘤相关死亡具有重要意义。

流行病学资料显示，亚硝基化合物与胃癌的发生密切相关。

人体中的亚硝基化合物主要通过亚硝胺腌制和加工的肉制品、其他食物和乙醇饮料以及体内细菌还原硝酸盐而产生［4］。

MNNG是人工合成的亚硝基化合物，常作为典型的模式化学诱变剂和致癌剂用于研究N-亚硝基类致癌物的致癌机制［5-7］。

本研究结果显示，GES-1细胞在MNNG的刺激下，细胞形态逐渐发生变化，细胞无序化生长，大小不一，排列紊乱，可见多核巨细胞，成团块状生长。

细胞体积增大，周边可见毛刺状，胞质内空泡增多。

细胞集落形成数增加，克隆形成率增加，证实细胞的增殖活性增加。

细胞愈合面积变大，表明其迁移能力增强。

细胞形态向畸形和不规则改变，细胞增殖和迁移能力明显增强，提示其转化为具有恶性增殖和转移特征的细胞。

自噬是细胞维持自身内环境稳定以进行正常增殖和分化的重要方式，同时也能帮助细胞度过应激状态而生存下来。

细胞内自噬功能的异常可导致肿瘤等一系列疾病的发生。

正常情况下，自噬有利于细胞保持自稳状态；发生应激时，自噬防止有毒或致癌物损伤蛋白质及细胞器的积累，抑制细胞癌变［8］。

如细胞自噬功能缺陷，损伤的细胞器和大分子物质可以在细胞内积聚，诱发氧化应激、DNA损伤和染色体不稳定等，从而诱导原癌基因突变，增加癌变风险［9］。

研究发现，肝癌前病变期肝细胞自噬活动降低至正常的50%，肝癌细胞中自噬降低至正常的
20%，胰瘤向胰癌转化过程中自噬活性明显降低［10］。

微管相关蛋白1轻链3（LC3）是自噬体标记蛋白，可作为自噬的检测标志物。

细胞内新合成的LC3加工后成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。

LC3-Ⅰ经泛素化修饰和剪切后，结合自噬膜表面的磷脂酰乙表1三组细胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表达（-x±s）组别
MNNG诱导组
溶剂对照组
空白对照组
LC3Ⅱ蛋白
0.71±0.15
1.08±0.12*
1.47±0.02*
Beclin1蛋白
0.68±0.21
1.13±0.07*
1.17±0.08*
LC3ⅡmRNA
0.68±0.08
0.88±0.01*
1.00±0.02*
Beclin1mRNA
0.60±0.01
0.81±0.02*
1.00±0.05*
注：与MNNG诱导组比较，*P<0.05。

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醇胺，形成自噬体形式的LC3-Ⅱ，细胞自噬过程进行到自噬泡即将形成闭合结构时，只有膜结合形式的LC3-Ⅱ定位于自噬泡膜上。

因此可以根据Ⅱ型
LC3表达的水平或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值判断细胞自噬水平［11］。

Beclin-1是自噬核心复合物中重要的组成部分，在调节自噬起始囊泡形成的过程中起关键作用，是自噬第一阶段不可或缺的基因［12］，表达缺失使细胞自噬活性降低从而导致肿瘤细胞异常生长［13］。

Beclin-1表达缺陷能够降低细胞的自噬水平，诱导乳腺癌、肝细胞癌等的癌前病变，更易诱发肿瘤［14］。

实验证实Beclin-1在慢性非萎缩性胃炎、癌前病变、胃癌组织中的表达活性逐渐减弱［15-16］，可以通过促进细胞凋亡和减少细胞迁移来抑制胃癌的进展［17］。

裸鼠体内肿瘤生长与接种细胞的增殖、侵袭及转移密切相关。

MNNG诱导的胃黏膜上皮细胞不影响裸鼠的生活状态，能促进瘤体的发生，组织学病理显示肿瘤组织炎性细胞浸润，细胞结构紊乱，排列不规整，这些都和胃癌前期的发展有相似之处。

本研究利用小剂量MNNG持续刺激GES-1细胞模拟人类摄入亚硝酸盐类食物，结果显示GES-1细胞的增殖和迁移能力明显增强，发生恶性转化；其作用机制可能与细胞自噬相关。

本研究为后续研究中药对胃黏膜细胞恶性转化的作用机理建立了一个可行的细胞模型。

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（收稿日期：2020-09-24）
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