光合细菌保种方法的优化研究

21412 方法评价
该方法较上述几种方法而言 ,操作复杂 、成本较
高 ,对实验室仪器要求也较高 ,但菌种保存时间较
长 ,一般可十年以上 ,体积小生物量大 ,且不易被污 染 。该方法适用于仪器条件较好的研究机构和科研
院校进行光合细菌的保种 。
215 几种方法的比较
表 2 光合细菌保种方法的比较
方法
液体保存方法 半固体 、固体保种法 砂土管保种法 冷冻干燥法
《淡水渔业 》2005 年第 35 卷第 3 期
光合细菌保种方法的优化研究
张李阳 吴向华 戴 丽
(南京晓庄学院生命科学系 ,南京 210017)
摘 要 从菌种的保存时间 、菌活力 、对仪器的要求 、操作的复杂程度 、试验成本 、染菌概率等多方面考虑 , 对几种光合细菌保种方法进行了比较 ,发现冷冻干燥法保存光合细菌最好 ,但成本较高 。从综合考虑 ,固体 、半 固体法最适合不同条件的实验室进行光合细菌菌种保存 。
砂土管保种是常见的较好的菌种保存方法 ,成本 低 ,操作也简单 ,适合各种实验室条件的企业进行保 种 。但该方法并不适用光合细菌的保种 。我们对用 此法保存的光合细菌砂土管进行了转接试管斜面试 验和 MPN法活菌计数 ,均未获得阳性结果。分析光 合细菌未能存活的原因 ,可能是初始转接生物量和菌 活性达不到该方法的要求 。同时我们也查阅了相关 文献 ,发现也有用砂土管保存 PSB 失败的实例报 道 [2 ] 。因此 ,该方法在光合细菌的保种中可以剔除 。 214 冷冻干燥方法 21411 不同冻干剂冷冻效果的比较
310 ×109 315 ×109 215 ×109 310 ×109 210 ×109 215 ×109 117 ×109 210 ×109 018 ×109 111 ×109 012 ×109 012 ×109
存活率 (%)
7510 8715 6215 7510 5010 6215 4215操作比较简单 ,成本较低 ,但菌种保藏时 间不长 ,一般 2～3个月需转接一次以保存活力 。由 于光合细菌的生长存在趋光性 ,故在该保种方法中 出现了菌种的大量贴壁现象 ,每次转接前需对试管 进行振荡摇晃 ,否则液体中活菌含量较低 。同时该 方法还存在容易染菌的问题 ,很难保存到三个月 ,一 般在一个月左右就出现了培养液被霉菌等污染 。该 方法适用于实验条件比较简陋以人工扩增为主的小 规模光合细菌生产或应用单位进行保种 。 212 半固体和固体保种法
关键词 光合细菌 ,冷冻干燥保种 ,固体保种
光合细菌 ( Photosynthetic bacteria,简称 PSB )是 地球上最早出现的一类能进行光合作用而产氧的特 殊生理类群的原核生物的总称 。在自然界碳素 、氮 素 、硫素的转化循环中起重要作用 ,被广泛应用于水 产养殖 、禽畜饲养 、作物施肥 、生物防治 、环境保护等 领域中 ,在我国被大规模地应用于水产养殖业 。我 国研究光合细菌常聚焦于废水处理 、水产养殖效果 、 光合细菌代谢产物的提取上 ,往往忽略了对光合细 菌菌种的保存 ,以致保种问题已成许多光合细菌生 产和研发机构的瓶颈问题 。现在我国对光合细菌菌 种的保存主要以液体和半固体保种为主 ,而这种保 种方式存在保种时间短 、容易被污染等问题 。基于 上述原因 ,笔者将几种光合细菌的保种方法进行了 比较实验 ,以获得一种较好的保种方法 。 1 材料和方法 111 实验材科
[ 1 ] 葛诚 , 等. 微生物肥料生产应用基础. 北京 : 中国农业科技 出版社 , 2000, 112
[ 2 ] 王应栓 , 许福康 , 杨雪南 , 等. 光合细菌保种方法 (简报 ). 土壤通报 , 1993, 24 ( 2) : 187
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操作 复杂度
简单 较简单 较简单 复杂
成本
适用范围
较低 实验条件简陋的现场实验室
较低
常规生物实验室
较低
常规生物实验室
较高 仪器条件较好的实验室
表 3 不同保种方法的存活率和存活时间比较
方法
液体保存方法 半固体 、固体保种法 砂土管保种法 冷冻干燥法
15d 30d 60d 90d 120d 150d 180d
(1)种子培养液 在固体培养基上挑取数个单 菌落 ,接种于种子培养液中 , 30 ℃、4000 lx光照下培 养 5～7 d后 ,备用 。
(2)富集培养液 按 2%的接种量将种子培养 液接种于液体培养基中 , 30 ℃、4000 lx光照下培养 5～7 d后 ,备用 。 114 冻干保护剂
海藻糖 、蔗糖 、维生素 C、甘油 、麦芽糊精等均为 分析纯 ,脱脂乳为食品级 ,含量为 80%。 115 实验方法 11511 液态保种法 将液体培养液装入戴帽的螺 口试管中 ,灭菌 ,接种后 30 ℃、4000 lx光照下培养 2 ～4 d后 ,置于 20 ℃、2000 lx光照下保存 。 11512 半固体保种法 在液体培养基加入 1%的 琼脂后装入戴帽的螺口试管中 ,灭菌 ,穿刺接种后 , 30 ℃、4000 lx光照下培养 7～14 d后 ,置于 4 ℃冰 箱保存 。 11513 固体保种法 固体培养基装入戴帽的螺口 试管中 ,灭菌 ,穿刺接种后 , 30 ℃、4000 lx光照下培 养 7～14 d,置于 4 ℃冰箱保存 。 11514 砂土管保种法 砂土过 80目筛后 ,干热灭菌 , 装管 ,将生长 5～7 d的光合细菌培养物 4000 r/m in离 心 15 m in,转入砂土管中 ,混匀 ,置于干燥器中保存。
(2)液体培 养基 ( g /L ) : 酵 母膏 3, 蛋 白胨 3, NaC l 1013,M gSO4 015, KH2 PO4 0125, pH 712。
(3)种子培养基 ( g /L ) : NaH2 PO4 515, 苹果酸
115,乙酸钠 2, N aOH 2, NH4 C l 1, M gCl2 0125, CaC l2 0105,酵母膏 1, pH 710。 113 培养方法
收稿日期 : 2004 - 08 - 11 基金项目 :南京晓庄学院重点资助课题 (0309001) 作者简介 :张李阳 (1961— ) , 女 ,副教授 ,主要从事微生物学的研究与教学 , E - mail: jw@ njnc. edu. cn
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表 1 不同冻干剂冷冻效果的比较
冻干保护剂 海藻糖 蔗糖 麦芽糊精 甘油 维生素 C 脱脂乳
浓度 (w /w)
5% 10% 5% 10% 5% 10% 5% 10% 5% 10% 5% 10%
活菌数 (个 /mg - 1 )
冻干前
冻干后
410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109 410 ×109
这两种方法均采用穿刺接种方法 ,保存时间都差 不多 ,一般在六个月左右 ,比液体保存方法时间要长 些 ,但比冷冻干燥法要短许多 ,半固体保藏方法光合细 菌的生长更好一点 ,活菌数也要高一点。这两种方法 的优点是操作简单 ,染菌率低于液体保种方法 ,但缺点 是总体菌含量偏低 ,使用前需对菌种进行活化扩增 ,适 用于具有常规生物仪器的工厂实验室进行保种。 213 砂土管保种法
100% 92% 58% 3715% 21% 1117% 715%
+ ++ +
+
+
+
- -- -
-
-
-
97% 97% 97% 97% 97% 97% 97%
注 : “ + ”生长 , “ - ”不生长 。半固体 、固体需先转接 , 无法 进行活菌计数 , 但总体来说生长较快 。
3 结沦 通过上述试验得出如下结论 , 各种不同保种法
11515 冷冻干燥保种法 将 4000 r/m in 离心 15 m in的光合细菌加入冻干瓶中 ,分别加入 2 倍量的 保护剂 ,置于 - 30 ℃冰箱冷冻过夜后 ,冷冻干燥机 冷冻干燥 30 h,放入冰箱保存 。 116 生物量的测定 M PN 五管法 [ 1 ] 。 2 结果与分析 211 液体保种法
适合不同仪器条件的实验室 。用冷冻干燥法保存菌 种效果最好 , 但成本较昂贵 , 且操作复杂 、对仪器 要求也高 , 不适于大多数没有冷冻干燥机的实验 室 。而固体 、半固体保种法从保种时间和成本 、菌 活力 、对实验室仪器条件的要求等多方面综合来 看 , 是一种比较合适的光合细菌保种法 。
参考文献
将等量的光合细菌培养物 4000 r/m in离心 15 m in后加入冻干瓶中 ,分别加入 2 倍量的不同保护 剂置于 - 30 ℃冰箱冷冻过夜后 ,冷冻干燥机冷冻干 燥 30 h,对不同保护剂进行活菌计数 ,结果见表 1。 由表 1可以看出海藻糖的效果最好 ,蔗糖其次 。但 考虑到海藻糖价格比较昂贵 ,在实际的生产应用中 并不适合 ,所以我们采用了成本便宜的蔗糖 ,所用浓 度为 10% ,处理后的存活率可达 75%。
菌种 为 光 能 异 养 菌 ( R hodopseudom onas pa lus2 tris) ,由南京师范大学资源微生物及菌肥实验室惠 赠。 112 培养基
(1)固体培 养基 ( g /L ) : 酵 母膏 3, 蛋 白胨 3, NaC l 1013, M gSO4 015, 琼脂 20, KH2 PO4 0125, pH 712。