聚合酶链式反应2
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聚合酶链式反应
（polymerase chain reaction,
PCR）
Kary B. Mullis
USA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method
The Nobel Prize in Chemistry 1993
理论上，n个循环后，产量为2n拷贝。 实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，
X为扩增效率，平均为75%
PCR反应体系与反应条件
成分
加量（ul）
灭菌双蒸水
X
10×PCR 缓冲液 5.0
MgCl 2 dNTPs
2-8.0 1- 2.0
引物A
1-2.0
引物B
1-2.0
Taq酶
0.25
模板
DNA RNA
gaggtttcccgagcaggg-5’
DNA polymerase
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为 100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低 则合成产物量减少。
(dNTPs)
dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总 称，是靶DNA 序列扩增的原料。
In 'hot-start' PCR ，at least one reaction component,which can include the polymerase, salt (KCl or MgCl2) or dNTP(s), is withheld from the reaction until the system reaches a particular temperature.
变性-退火-延伸
—— 一个PCR循环
尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序 列的指数扩增并不是一个无限制的过程。
在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化 反应趋于饱和----------平台效应 (Plateau)
“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、 模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。
extension （三阶段，多循环）
产物： 模板DNA （基因组DNA） 拷贝数增加一倍
目的DNA（特异性） 拷贝数增加 2n倍
Denaturation（变性）
template DNA (dsDNA) —— 95℃±—— denaturation ——ssDNA
Annealing（退火）
primers
Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待 扩增的目标片段两端的序列互补。
Extension（延伸）
Taq 酶
dNTPS
新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。
DNA聚合酶：催化反应体系中游离的单核苷酸 （dNTPs）由引物5'→3'方向，按碱基配对的原则 延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。
PCR 的基本原理
其原理类似于DNA的体内复制， 在试管中的DNA的体外合成。
DNA的体内复制：
原料：template DNA（genomic DNA ）， RNA primer，dNTPs
PCR：
template DNA（genomic DNA ， cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPs
DNA自动测序结果举例
PCR METHODS
• STANDARD PCR • HOT START PCR • RT PCR • NESTED PCR • IN SITU PCR • ASPCR • PCR-ELISA • REAL TIME QUANTITATIVE PCR
HOT START PCR
REAL TIME QUANTITATIVE PCR
原理： 根据荧光染料形成 特异性荧光信号的 强度，计算出模板 DNA或mRNA的含量
用途： 定量分析mRNA或DNA 优点： 可进行自动化定量
分析、降低假阳性
实时PCR的基本过程
WHAT CAN PCR DO FOR US?
• 医学检测 (基因诊断) • 基因工程
template
血液 陈旧血痕 组织块或石蜡包埋组织 绒毛 毛发 羊水脱落细胞 尿 咽拭子
mRNA
cDNA
primer
1. 引 物 长 度 ： 15-30bp ， 常 用 为 20bp 左 右 。
2. 保证引物中G-C比例为50%±15%，ATGC最好随机分布。
3. 避免两条引物间或引物内部互补，特别是3’端的互补。
引物的3端: 必须严格互补
引物的5端: 可以不严格,可以加酶,加标记物, 引入突变位点等
ggttacttccctcgatttgg 5’-ggttacttccctcgatttgg gcggggattcccttccatttt
tttcttcccttttctcccaagatccagcttcttggggg cactcacgggtgcccgttgcgttctgctccgtcg gcccc/ggagctgcatggccaactcccaccag gggccgctcctcccctaccccccacccccggg ctccctctttaagtctctagctcaaggtaccc gcct ctccaaagggctcgtccc-3’(229bp)
二、基因工程:
PCR 应用
plasmid PCR Product digest
mix
Gene cloning : PCR product + vector
DNA ligase
PCR法（4 引物法）
设计引物
基因改造
分段PCR
再次PCR
获得突变基因
用4种2´,3´―双脱氧核苷酸（ddNTP）代替 部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA 合成反应，从而获得在不同部位终止反应的大 小不同的DNA链，经高分辨率变性聚丙烯凝胶 电泳分离，就可以对DNA序列进行分析
Sanger法测定DNA序列
2.DNA自动化测序
方法要点
● 基于Sanger法的基本原理 ● 用标记荧光染料的ddNTP ● 经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ● 用荧光检测仪检测信号经计算机分析 ● 得到DNA分子序列
4. length<20bp Ta（退火温度）=(4×G/C + 2×A/T – 5 °C );
length>20bp Ta=62.3 °C+0.41 °C *(%GC) - 5 °C
保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75 °C 范围内。
5. 检测目的DNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以 帮助避免使用设计不合理的引物对。
PCR
DNA片段
Cycle 1
Cycle 2
Cycle 3
PCR的产物数目 以指数级方式增长
理论上可达2n个拷贝
原料（pg）
产物(ug)
Cycle N
体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段
• PCR 基本原理 • PCR反应体系 • PCR 结果分析 • PCR 方法拓展 • PCR 的应用
dNTP浓度根据靶序列的长度和组成而定， 一般使用浓度在50-200umol/L之间
buffer /Mg2+
常用的缓冲液体系为1050mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20℃）
TaqDNA聚合酶需要游离Mg2+。
PCR反应条件
变性 95 ℃ 5min
变性 95 ℃ 1min 退火 55 ℃ 1min 延伸 72 ℃ 1min
1.RNA preparetion
2.Reverse transcription
3. PCR: a.Target Gene Specified primer b. GAPDH or β-actin primer
4. Quantictin
酶： 解旋酶，引物酶， DNA聚合酶， 连接酶
DNA polymerase
反应条件： 胞液环境，37 ℃
buffer，三种变化的温度（94，50-70， 72 ℃），cycles（25-35）
反应过程：起始（模板DNA解链、形成引发体）、 denaturation、 annealing 、
延长、终止（三阶段）
产物的鉴定，基因分型，研究变异性。
Hybridisation ： (Southern blot/dot blot )
electrophoresis/hybridisation
Sequence analysis：是检测PCR产物特异性的 最可靠方法。
DNA测序 1.Sanger法（双脱氧末端终止法）
RT-PCR (Reverse transcription-PCR)
1.RNA preparation 2.Reverse transcription 3. PCR 4. Result Analysis:Quantification or cDNA clone
Semi-Quanitify RT-PCR
35 cycles
变性 95 ℃
延伸72 ℃ 1min
延伸 72 ℃
退火 Tm-5℃
Analysis of PCR products
Gel analysis (琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电 泳 ) : PCR 产物电泳，EB（溴乙锭）染色， 紫 外仪下观察，初步判断产物的特异性。
Restriction-endonuclease digestion analysis： 酶切、电泳分离。
（polymerase chain reaction,
PCR）
Kary B. Mullis
USA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method
The Nobel Prize in Chemistry 1993
理论上，n个循环后，产量为2n拷贝。 实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，
X为扩增效率，平均为75%
PCR反应体系与反应条件
成分
加量（ul）
灭菌双蒸水
X
10×PCR 缓冲液 5.0
MgCl 2 dNTPs
2-8.0 1- 2.0
引物A
1-2.0
引物B
1-2.0
Taq酶
0.25
模板
DNA RNA
gaggtttcccgagcaggg-5’
DNA polymerase
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为 100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低 则合成产物量减少。
(dNTPs)
dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总 称，是靶DNA 序列扩增的原料。
In 'hot-start' PCR ，at least one reaction component,which can include the polymerase, salt (KCl or MgCl2) or dNTP(s), is withheld from the reaction until the system reaches a particular temperature.
变性-退火-延伸
—— 一个PCR循环
尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序 列的指数扩增并不是一个无限制的过程。
在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化 反应趋于饱和----------平台效应 (Plateau)
“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、 模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。
extension （三阶段，多循环）
产物： 模板DNA （基因组DNA） 拷贝数增加一倍
目的DNA（特异性） 拷贝数增加 2n倍
Denaturation（变性）
template DNA (dsDNA) —— 95℃±—— denaturation ——ssDNA
Annealing（退火）
primers
Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待 扩增的目标片段两端的序列互补。
Extension（延伸）
Taq 酶
dNTPS
新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。
DNA聚合酶：催化反应体系中游离的单核苷酸 （dNTPs）由引物5'→3'方向，按碱基配对的原则 延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。
PCR 的基本原理
其原理类似于DNA的体内复制， 在试管中的DNA的体外合成。
DNA的体内复制：
原料：template DNA（genomic DNA ）， RNA primer，dNTPs
PCR：
template DNA（genomic DNA ， cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPs
DNA自动测序结果举例
PCR METHODS
• STANDARD PCR • HOT START PCR • RT PCR • NESTED PCR • IN SITU PCR • ASPCR • PCR-ELISA • REAL TIME QUANTITATIVE PCR
HOT START PCR
REAL TIME QUANTITATIVE PCR
原理： 根据荧光染料形成 特异性荧光信号的 强度，计算出模板 DNA或mRNA的含量
用途： 定量分析mRNA或DNA 优点： 可进行自动化定量
分析、降低假阳性
实时PCR的基本过程
WHAT CAN PCR DO FOR US?
• 医学检测 (基因诊断) • 基因工程
template
血液 陈旧血痕 组织块或石蜡包埋组织 绒毛 毛发 羊水脱落细胞 尿 咽拭子
mRNA
cDNA
primer
1. 引 物 长 度 ： 15-30bp ， 常 用 为 20bp 左 右 。
2. 保证引物中G-C比例为50%±15%，ATGC最好随机分布。
3. 避免两条引物间或引物内部互补，特别是3’端的互补。
引物的3端: 必须严格互补
引物的5端: 可以不严格,可以加酶,加标记物, 引入突变位点等
ggttacttccctcgatttgg 5’-ggttacttccctcgatttgg gcggggattcccttccatttt
tttcttcccttttctcccaagatccagcttcttggggg cactcacgggtgcccgttgcgttctgctccgtcg gcccc/ggagctgcatggccaactcccaccag gggccgctcctcccctaccccccacccccggg ctccctctttaagtctctagctcaaggtaccc gcct ctccaaagggctcgtccc-3’(229bp)
二、基因工程:
PCR 应用
plasmid PCR Product digest
mix
Gene cloning : PCR product + vector
DNA ligase
PCR法（4 引物法）
设计引物
基因改造
分段PCR
再次PCR
获得突变基因
用4种2´,3´―双脱氧核苷酸（ddNTP）代替 部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA 合成反应，从而获得在不同部位终止反应的大 小不同的DNA链，经高分辨率变性聚丙烯凝胶 电泳分离，就可以对DNA序列进行分析
Sanger法测定DNA序列
2.DNA自动化测序
方法要点
● 基于Sanger法的基本原理 ● 用标记荧光染料的ddNTP ● 经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ● 用荧光检测仪检测信号经计算机分析 ● 得到DNA分子序列
4. length<20bp Ta（退火温度）=(4×G/C + 2×A/T – 5 °C );
length>20bp Ta=62.3 °C+0.41 °C *(%GC) - 5 °C
保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75 °C 范围内。
5. 检测目的DNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以 帮助避免使用设计不合理的引物对。
PCR
DNA片段
Cycle 1
Cycle 2
Cycle 3
PCR的产物数目 以指数级方式增长
理论上可达2n个拷贝
原料（pg）
产物(ug)
Cycle N
体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段
• PCR 基本原理 • PCR反应体系 • PCR 结果分析 • PCR 方法拓展 • PCR 的应用
dNTP浓度根据靶序列的长度和组成而定， 一般使用浓度在50-200umol/L之间
buffer /Mg2+
常用的缓冲液体系为1050mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20℃）
TaqDNA聚合酶需要游离Mg2+。
PCR反应条件
变性 95 ℃ 5min
变性 95 ℃ 1min 退火 55 ℃ 1min 延伸 72 ℃ 1min
1.RNA preparetion
2.Reverse transcription
3. PCR: a.Target Gene Specified primer b. GAPDH or β-actin primer
4. Quantictin
酶： 解旋酶，引物酶， DNA聚合酶， 连接酶
DNA polymerase
反应条件： 胞液环境，37 ℃
buffer，三种变化的温度（94，50-70， 72 ℃），cycles（25-35）
反应过程：起始（模板DNA解链、形成引发体）、 denaturation、 annealing 、
延长、终止（三阶段）
产物的鉴定，基因分型，研究变异性。
Hybridisation ： (Southern blot/dot blot )
electrophoresis/hybridisation
Sequence analysis：是检测PCR产物特异性的 最可靠方法。
DNA测序 1.Sanger法（双脱氧末端终止法）
RT-PCR (Reverse transcription-PCR)
1.RNA preparation 2.Reverse transcription 3. PCR 4. Result Analysis:Quantification or cDNA clone
Semi-Quanitify RT-PCR
35 cycles
变性 95 ℃
延伸72 ℃ 1min
延伸 72 ℃
退火 Tm-5℃
Analysis of PCR products
Gel analysis (琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电 泳 ) : PCR 产物电泳，EB（溴乙锭）染色， 紫 外仪下观察，初步判断产物的特异性。
Restriction-endonuclease digestion analysis： 酶切、电泳分离。