《基因探针》PPT课件
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用的胶有所不同(RNA易形成二级构造)
探针基因的分离制备 同位素或非同位素标记
标记基因探针的纯化
检测样品核酸制备 杂交膜制备或转印
预杂交
杂交
洗膜 图3-3 核酸探针杂交试验全过程示意图
（a）
Southern
（b）
凝胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（ d ） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的基 因DNA片段
一、基因探针
1. 基因探针的类型
1〕DNA酶切片段 2〕用PCR 扩增出的核酸 3〕直接用RNA作探针 4〕人工合成〔含标记〕
2. 基因探针的要求
1〕尽量防止高度重复序列：根据目的而定。最好用cDNA(要 将polyA或polyT去掉)。 2〕G+C含量：40-60% 3〕探针本身不能有4个连续互补碱基，否那么本身形成二级构 造。 4〕不主张几个连续一样碱基 5〕检测目的核酸时，要考虑模板出现率。〔兼并性〕 6〕探针比模板短：实际用长探针检测短模板的也可，不影响 结果。
探针与核酸杂交的方法
▪ 1〕斑点杂交(dot-blot) ▪ 2〕菌落/噬菌斑：转印筛选法 ▪ 3〕组织/细胞(DNA或RNA)：原位杂交(in
situ hybridization ISH) . ▪ Southern-blot(DNA)、Northern-
blot(RNA) ▪ DNA和RNA操作根本一样，只是电泳所
菌落杂交
检测重组体克隆的菌落杂交技术
原位杂交
(in situ hybridization ISH)
▪ 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用碱基顺序 并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中 待检测的核酸按碱基配对的原那么进展特 异性结合而形成杂交体，然后再应用与标 记物相应的检测系统，通过组织化学或免 疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成 带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微 镜下进展细胞内定位。
0.5ug
10×切口平移缓冲液
2.5uL
10×dNTP〔无dCTP〕 20nmol
每种
DNase I (10ng/mL)
2.5uL
DNA聚合酶I
2.5单位
[α-32P] dCTP 16pmol
加dH2O
至25uL
14~16℃ 1~2h
加1uL0.5mol/L EDTA(pH8.0)终止反响
随机引物法
DNA的切口平移法
双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌 DNA聚合酶I可把核苷酸残基加到切口处的3’羟基端。 且由于此酶具有5’ 3’外切酶活性，它还可以从切 口的5’端除去核苷酸。5’端核苷酸的去除与3’端 核苷酸的参加同时进展，导致切口沿着DNA链移动(切 口平移)。
切口平移的反响体系
探针DNA
DNA聚合酶利用寡核苷酸作引物，沿单链模板合 成DNA。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就会在模板 的许多位置上和模板杂交，因此模板上的每个核苷酸(可 能要除去最靠近5’端的一些核苷酸)被拷贝进产物中去 的频率一样。使用[α-32P] dNTP 作为前体，用此法可 合成比活度非常高的标记DNA探针。
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基因探针
基因探针又称核酸分子杂交技术，是在1968年 由华盛顿卡内基学院〔Cavnegie Institute of Washington〕的Roy Britten及其同事创造的 。
3. 核酸探针杂交所用的固相载体
1〕芯片：种类多，用于工业生产，见各公司介绍。 2〕硝酸纤维膜(NC膜)：吸附单链DNA、RNA能力强，80-100 ug/cm2；也可非特异性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。缺点：脆、 易折断；不能吸附小片段DNA。
3〕尼龙膜：吸附DNA能力比NC膜强，也可吸附小至10bp的DNA。 优点：易把模板固定在膜上；可反复使用屡次。
基因探针是指能与特定的靶分子序列发生特异 性相互作用的标记分子.
也就是指一段能识别(与目的序列或靶序列互补)特 异性碱基序列(基因)的标记同位素等标记物的单 链DNA或RNA的分子。
▪ 检测DNA的技术称为.Southern blot杂交.
▪ 检测RNA的技术称为. Northern blot杂 交.otting〕
而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素 滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定 蛋白质之抗体进展反响,这种技术叫做韦斯顿蛋 白质杂交技术〔Western blotting〕。
▪ 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
▪ 斑点印迹杂交〔dot blotting〕和 狭线印迹杂交〔slot blotting 〕是 在Southern印迹杂交的根底上开展 的量种类式的快速检测特定核酸 〔DNA和RNA〕分子的核酸杂交技 术。由于在实验的加样过程中使用了 特殊设计的加样装置，使众多待测样 品能够一次同步转移到杂交滤膜上，
①地高辛：植物中提取。商品化地高辛标记dCTP，即 合成链时，用地高辛标记dCTP。dCTP-地高辛与酶标 抗地高辛抗体反响，加底物显色。
②生物素-亲和素：用酶标亲和素测dCTP-生物素 ③荧光：送生物公司标记
5. 探针标记方法
1〕DNA的切口平移 2〕随机引物法 3〕单链DNA探针 4〕RNA探针 5〕DNA的5’或3’末端标记 6〕寡核苷酸标记 7〕PCR标记
4〕化学活化膜：用化学试剂把NC膜处理，可吸附极少量核酸。也 可用普通滤纸。
5〕滤纸
核酸杂交常用几种膜的性 能比较
硝酸纤维膜(NC膜)
▪ 硝酸纤维膜有两种;
▪ 0.22µm孔经
▪ 0.45µm孔经
4. 基因探针的标记物
1〕同位素：H3、 S35、 P32 最常用〔缺点：不能保 存〕 2〕非同位素：
▪ 检测蛋白质的技术称为.Western blot杂 交.
▪ 还有dot blot,原位杂交技术等.
杂交类型
▪ 固相杂交 ▪ 液相杂交
核酸分子杂交
(固相杂交)
▪ Northern 杂交
▪ Southern 杂交
芯片
▪ 以上方法决定杂交模板核酸性质,
▪ DNA Southern 杂交. ▪ RNA Northern 杂交
探针基因的分离制备 同位素或非同位素标记
标记基因探针的纯化
检测样品核酸制备 杂交膜制备或转印
预杂交
杂交
洗膜 图3-3 核酸探针杂交试验全过程示意图
（a）
Southern
（b）
凝胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（ d ） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的基 因DNA片段
一、基因探针
1. 基因探针的类型
1〕DNA酶切片段 2〕用PCR 扩增出的核酸 3〕直接用RNA作探针 4〕人工合成〔含标记〕
2. 基因探针的要求
1〕尽量防止高度重复序列：根据目的而定。最好用cDNA(要 将polyA或polyT去掉)。 2〕G+C含量：40-60% 3〕探针本身不能有4个连续互补碱基，否那么本身形成二级构 造。 4〕不主张几个连续一样碱基 5〕检测目的核酸时，要考虑模板出现率。〔兼并性〕 6〕探针比模板短：实际用长探针检测短模板的也可，不影响 结果。
探针与核酸杂交的方法
▪ 1〕斑点杂交(dot-blot) ▪ 2〕菌落/噬菌斑：转印筛选法 ▪ 3〕组织/细胞(DNA或RNA)：原位杂交(in
situ hybridization ISH) . ▪ Southern-blot(DNA)、Northern-
blot(RNA) ▪ DNA和RNA操作根本一样，只是电泳所
菌落杂交
检测重组体克隆的菌落杂交技术
原位杂交
(in situ hybridization ISH)
▪ 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用碱基顺序 并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中 待检测的核酸按碱基配对的原那么进展特 异性结合而形成杂交体，然后再应用与标 记物相应的检测系统，通过组织化学或免 疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成 带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微 镜下进展细胞内定位。
0.5ug
10×切口平移缓冲液
2.5uL
10×dNTP〔无dCTP〕 20nmol
每种
DNase I (10ng/mL)
2.5uL
DNA聚合酶I
2.5单位
[α-32P] dCTP 16pmol
加dH2O
至25uL
14~16℃ 1~2h
加1uL0.5mol/L EDTA(pH8.0)终止反响
随机引物法
DNA的切口平移法
双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌 DNA聚合酶I可把核苷酸残基加到切口处的3’羟基端。 且由于此酶具有5’ 3’外切酶活性，它还可以从切 口的5’端除去核苷酸。5’端核苷酸的去除与3’端 核苷酸的参加同时进展，导致切口沿着DNA链移动(切 口平移)。
切口平移的反响体系
探针DNA
DNA聚合酶利用寡核苷酸作引物，沿单链模板合 成DNA。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就会在模板 的许多位置上和模板杂交，因此模板上的每个核苷酸(可 能要除去最靠近5’端的一些核苷酸)被拷贝进产物中去 的频率一样。使用[α-32P] dNTP 作为前体，用此法可 合成比活度非常高的标记DNA探针。
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基因探针
基因探针又称核酸分子杂交技术，是在1968年 由华盛顿卡内基学院〔Cavnegie Institute of Washington〕的Roy Britten及其同事创造的 。
3. 核酸探针杂交所用的固相载体
1〕芯片：种类多，用于工业生产，见各公司介绍。 2〕硝酸纤维膜(NC膜)：吸附单链DNA、RNA能力强，80-100 ug/cm2；也可非特异性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。缺点：脆、 易折断；不能吸附小片段DNA。
3〕尼龙膜：吸附DNA能力比NC膜强，也可吸附小至10bp的DNA。 优点：易把模板固定在膜上；可反复使用屡次。
基因探针是指能与特定的靶分子序列发生特异 性相互作用的标记分子.
也就是指一段能识别(与目的序列或靶序列互补)特 异性碱基序列(基因)的标记同位素等标记物的单 链DNA或RNA的分子。
▪ 检测DNA的技术称为.Southern blot杂交.
▪ 检测RNA的技术称为. Northern blot杂 交.otting〕
而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素 滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定 蛋白质之抗体进展反响,这种技术叫做韦斯顿蛋 白质杂交技术〔Western blotting〕。
▪ 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
▪ 斑点印迹杂交〔dot blotting〕和 狭线印迹杂交〔slot blotting 〕是 在Southern印迹杂交的根底上开展 的量种类式的快速检测特定核酸 〔DNA和RNA〕分子的核酸杂交技 术。由于在实验的加样过程中使用了 特殊设计的加样装置，使众多待测样 品能够一次同步转移到杂交滤膜上，
①地高辛：植物中提取。商品化地高辛标记dCTP，即 合成链时，用地高辛标记dCTP。dCTP-地高辛与酶标 抗地高辛抗体反响，加底物显色。
②生物素-亲和素：用酶标亲和素测dCTP-生物素 ③荧光：送生物公司标记
5. 探针标记方法
1〕DNA的切口平移 2〕随机引物法 3〕单链DNA探针 4〕RNA探针 5〕DNA的5’或3’末端标记 6〕寡核苷酸标记 7〕PCR标记
4〕化学活化膜：用化学试剂把NC膜处理，可吸附极少量核酸。也 可用普通滤纸。
5〕滤纸
核酸杂交常用几种膜的性 能比较
硝酸纤维膜(NC膜)
▪ 硝酸纤维膜有两种;
▪ 0.22µm孔经
▪ 0.45µm孔经
4. 基因探针的标记物
1〕同位素：H3、 S35、 P32 最常用〔缺点：不能保 存〕 2〕非同位素：
▪ 检测蛋白质的技术称为.Western blot杂 交.
▪ 还有dot blot,原位杂交技术等.
杂交类型
▪ 固相杂交 ▪ 液相杂交
核酸分子杂交
(固相杂交)
▪ Northern 杂交
▪ Southern 杂交
芯片
▪ 以上方法决定杂交模板核酸性质,
▪ DNA Southern 杂交. ▪ RNA Northern 杂交