中国药典2010年版微生物检验相关内容培训班回执单
2010年版《药典》微生物限度标准
《中国药典》2010年版二部附录XI J （附录115页）《微生物限度检查法》微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。
药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。
2.口服给药制剂细菌数每1g不得过l000CFU 。
每lml 不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每lg或lml 不得过100CFU 。
大肠埃希菌每1g 或lml不得检出.3 ．局部给药制剂3.1用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3.2 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过100CPU 。
霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过10CPU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。
大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、lml 或l0cm2，不得检出。
3.3 阴道、尿道给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过100CFU 。
霉菌数和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2应小于10CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、lml 或l0cm2，不得检出。
3 .4 直肠给药制剂细菌数每1g不得过l000CFU。
每lml 不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每1g 或lml 不得过100CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每lg 或lml 不得检出。
3.5 其他局部给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2不得过100CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。
4.含动物组织（包括提取物）的口服给药制剂每10g 或10ml 还不得检出沙门菌。
2010版中国药典培训回答(第2部分：微生物限度)
2010版中国药典培训回答（第2部分：微生物限度）广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
1、微生物方法验证，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。
答：没有上限。
但一般不会高于100%，因为加进去的菌量是一样的，如果超过100%可看成是操作上的误差。
按微生物的特性，如果不超过太多，是可以接受的，但没有具体上限。
（本所控制在110%以内）。
2、在微生物方法验证时，霉菌、酵母菌计数验证只用黑曲霉及白色念珠菌做方法学验证，在操作培养过程中发现：在玫瑰红钠琼脂培养生长的白色念珠菌的形态太小与营养琼脂上培养的细菌的某些形态大小相同，这样如何判断营养琼脂上生长的菌落是否是白色念珠菌？为何这两种菌落形态相似？答：菌落形态相似不等于就是同一种菌。
在验证时，营养琼脂的验证菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，如果本底菌为0，则营养琼脂上长的菌应该不是白色念珠菌。
要判断是否为白色念珠菌，应进行白色念珠菌的相应鉴定方法后才能确定。
任何微生物都不可能只是从菌落就可以进行判断，只能判断为疑似，然后再做一系列相应的鉴定实验后才能进行判断。
3、生孢梭菌的适宜计数用培养基？（很多验证需对生孢梭菌进行计数）答：最简便的方法是用硫乙醇酸盐流体培养基。
该培养基上层为含氧层，适宜需氧菌生长，下层为厌氧层（下层高度最好7cm以上），适宜厌氧菌生长。
在培养16~18小时这个时间进行观察，计数，超过20小时,由于繁殖量大，培养基将混浊，点计不清。
或者是用哥伦比亚琼脂培养基，浇注后，置厌氧罐（袋）里，再置培养箱培养，计数。
4、微生物限度检查法中所用的培养基要进行适用性检查试验，请问这些培养基还需要做无菌检查试验吗？答：微生物限度检查，药典上没有特别说明对培养基作无菌性检查，但每次都要做阴性对照实验，阴性对照是检查整个检验系统是否被微生物污染，实际上也包括了培养基的无菌性检查。
2010版药典微生物限度检查法及指导原则培训
无
增加贴膏剂供试液制备 增加贴膏剂供试液制备 贴膏剂供试液 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层， 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置 在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。 在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适 宜的无菌多孔材料（如无菌纱布） 宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂 的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其 置于适宜体积并含有灭活剂（如山梨酯80 80或 置于适宜体积并含有灭活剂（如山梨酯80或 卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少30 30分钟 卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少30分钟 或以其它方法制备成供试液。 ，或以其它方法制备成供试液。
细菌、 4、细菌、霉菌及酵母菌计数
---计数培养基的适用性检查 ---计数培养基的适用性检查
CP2005 无 CP2010 结果判断 被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大 70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致， 于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，判该培养 基的适用性检查符合规定。 基的适用性检查符合规定。
CP2010
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂 斜面培养基中，培养5 加入3 斜面培养基中，培养5～7天，加入3～ 0.05％（v/v）聚山梨酯80 ％（v/v 80的 5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后， 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用 适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内 至无菌试管内， 适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用 0.05％（v/v）聚山梨酯80 0.9%无菌 ％（v/v 80的 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌 氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～ 制成每1ml含孢子数50 氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。 cfu的孢子悬液。 的孢子悬液 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用， 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用， 若保存在2 8℃可以在24小时内使用 可以在24小时内使用。 若保存在2～8℃可以在24小时内使用。 黑曲霉孢子悬液可保存在2 8℃， 黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证 过的贮存期内使用。 过的贮存期内使用。
2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）
2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）2010版中国药典培训回答（第4部分：菌种传代与特定菌检测）广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
1.以第五代菌做阳性对照，实验过程中的接种按药典应该也算传代，那是否算是第六代菌呢？答：依然算第五代(接种的菌株算第5代，培养后算第6代)答：其实验结果是算哪一代菌的？答：见上题2.药典规定只能传代五次，此次实验结果是否有效？答：有效3.现在有无对照菌种可以购买？联络电话？答：省药检所业务科销售药典规定的标准菌株，为第二代甘油冻存管，电话：020-********4.菌种发放单应包括什么信息？答：根据自己工作的需要，大致包括：菌种名称，编号，来源，接收日期，接收人等。
5.如何检查黑曲霉孢子悬浮液孢子含量为50~100个／ml。
铜绿假单胞菌单菌如果用甘油冷冻管，也是低温，是否也会影响它的活性？应如何保存？答：可用玫瑰红钠琼脂培养基或改良马丁琼脂来确定黑曲霉孢子悬浮液。
铜绿假单胞菌应使用最终甘油浓度为20%的甘油冻存管保存，保存在-30℃或更低温度，则可保持其活性。
若是斜面或营养肉汤，建议室温保存。
6.工作菌株，25℃下可连续使用一周，这里的工作菌株是指原液还是制备好的菌悬液。
为何工作菌株不低温存放，而是25℃？答：首先要说明，所有的操作应按药典要求来操作，这里的工作菌株指原液，工作菌株建议在2-8℃保存，但要注意的是，铜绿假单胞菌的工作菌液不能低温保存，低温会损伤其活性。
由于笔误，写成了25℃，请更正为2-8℃。
7.简单方便的厌氧培养方案？答：硫乙醇酸盐培养基；固体培养基的话可考虑使用一次性厌氧袋。
8.甘油冻存管一定要－30℃吗？0℃以下不可以吗？答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。
我们的甘油冻存管保存在-30℃。
8.三糖铁斜面穿刺会断层，这是为什么？答：产气菌产气使培养基断层，或培养基本身质量问题。
2010版药典微生物限度检查及验证
2010版药典
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制 剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方 法。 检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌 数及控制菌检查。
• 微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局 部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。 • 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂 或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。 • 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温 度为30～35 ℃ ；霉菌、酵母菌培养温度为23～28 ℃。 • 检验结果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2 为单位 报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
细菌、霉菌及酵母菌计数
• 计数培养基的适用性检查 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中 心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ] 枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis ) [ CMCC ( B ) 63501 ] 白色念珠菌（Candida albicans ）〔 CMCC ( F ) 98001 〕 黑曲霉（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]
10-3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CFU/ml
控制菌检查
控制菌检查用培养基的适用性检查
菌种 对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC ( B ) 44l02] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ] 乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B ) [ CMCC ( B ) 50094 ] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ） [ CMCC ( B ) 10104 ] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes ) [ CMCC ( B ) 6494l] 白色念珠菌（Candida albicans ） [ CMCC ( F ) 98001 ]
2010年版《中国药典》
Other Controlled Environments
<1117>Microbiological Best Laboratory Practices
<1223>Validation of Alternative Microbiological Methods
2010版微生物检验方法增修订要点
药品微生 物实验室 规范指导
关于微生物限度检查法应用指导原则
4）、对照培养基概念、用途及分发： 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质 量优良的培养基，用于培养基适用性检查。 由中国药品生物制品检定所研制及分发。
5）、方法验证试验时没有适宜的方法消除供试 品中的抑菌作用怎么办？ 更高稀释级的选择及原则 最接近要求的方法及进行风险评估的要求
• 药品质量事故高发期，如何快速、准确地获得 检验结果，又是对当前药品微生物检验工作的 一个挑战。
• 对事件的反思正在逐步深入，深化微生物控制 及检验的监管措施正在陆续推出。
微生物重点实验室建设
增强系统能力 应对应急检验
2009年4月23日中检所会同北京、天津、上海、黑龙江、江苏、浙江、广州、四 川、总后等九家药检所的主管业务所长及微生物检验部门负责人在浙江省杭州市 首次对药品检验所微生物检验重点实验室的建设问题开展研讨。
目的：在生产过程中添加适合的防腐剂以保证药 品的质量，为保证药品的质量和用药安全，添 加防腐剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性， 保持最低有效量。防腐剂效力的测定可使生产 者正确掌握产品中添加防腐剂的效力，有助于 选择合适的防腐剂，也可对防腐剂使用的正确 性给予评价。
关于抑菌效力检查法指导原则
• 设计实验方案； • 验证计数测定方法； • 制备浓菌液（108cfu/ml）； • 原包装接种； • 立即计数与第7、14、28天计数； • 计数结果的常用对数值比较； • 结果判断。
微生物(无菌)检查讲义
2010年无菌、微生物限度检查培训班讲义《中国药典》2010年版微生物限度（无菌）检查新增修订情况2010年版《中国药典》为建国以来的第九版药典。
2007年底开始工作，2010元月正式出版，2010年10月1日起实施（中华人民共和国卫生部公告（第5号））国家局、国家药典委员会、 120多家参与单位、数百位专家第一部分：无菌检查的新增修订前言部分1、新增规定：“防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
”2、新增规定：“日常检验还需要对环境进行监控。
”3、新增规定：“无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基部分1、删除：1. 硫乙醇酸盐流体培养基后括号（用于培养好氧菌、厌氧菌）的说明2、删除：2. 改良马丁培养基后括号（用于培养真菌）的说明3、删除：3. 选择性培养基项下加入适量中和剂或表面活性剂后面的“如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶（用于β-内酰胺类供试品）¡±等说明。
修订为：在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
(中和剂、灭活剂见微生物限度检查法中表1）4、将原第 6. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）修订排列为第 4. ——按顺序排列归类培养基1.～4. 均为直接用于无菌检查的液体培养基。
培养基灵敏度检查部分1、修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法：规定应使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，洗脱孢子及稀释孢子液，制成每1ml中含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）吸出孢子悬液的操作方法2、新增加稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限：“菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～8℃，在验证过的贮存期内使用。
02 2010年版《中国药典》微生物检查法
乳糖发酵培养基 曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂 沙门菌 营养肉汤 四硫磺酸钠亮绿培养基
促生长能力+指示能力 促生长能力+指示能力 促生长能力 促生长能力 抑制能力
胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂
促生长能力+指示能力
曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂
铜绿假单胞菌 胆盐乳糖培养基
促生长能力+指示能力
促生长能力 抑制能力
21
抑制能力 21 促生长能力+指示能力
三、白色念珠菌的检查
取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少 于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养24～48 小时。取上述培养物划 线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48小时（必要时延长至72 小时）。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光 滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。 若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检 出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑 选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48小时（必要 时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出 白色念珠菌。 若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉 米琼脂培养基上，培养24～48小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。 芽管试验 挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载 玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3h，置显微镜下观 察，可见到由孢子长出短小芽管。 若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品 未检出白色念珠菌。