重组右旋糖酐蔗糖酶的表达条件优化及合成产物研究

史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：/item.htm?id=9176907081史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：/item.htm?id=9176907081重组右旋糖酐蔗糖酶的表达条件优化及合成产物研究王雅洁，张洪斌 ，胡雪芹，伊晓楠（合肥工业大学化工学院制药工程系，合肥230009）摘要：目的选择合适的培养基，在工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28-dexYG中高效表达右旋糖酐蔗糖酶，并研究该酶合成右旋糖酐的条件。

方法通过设计正交实验，考察培养基中各组分及其浓度对诱导产酶结果的影响。

在选择合适培养基之后，通过改变温度、蔗糖浓度和pH值，研究它们对合成产物产量和黏度的影响。

结果成功选择了可高效表达该酶的表达培养基，在该培养基中待菌浓达到2.0时，加入IPTG至0.25mmol/L继续诱导培养4h，可以获得高活力的酶。

蔗糖浓度对产量的影响比较显著，通过控制发酵条件并不能有效控制合成产物的分子量。

结论得到可以高效表达该酶的培养基，研究利用该酶合成右旋糖酐的条件，为实现该酶合成糖酐的工业化生产奠定了基础。

关键词：右旋糖酐蔗糖酶；培养基；表达；右旋糖酐中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：Optimization of culture conditions for recombinant dextransucrase expression andstudy of dextran synthesisYajie Wang, Hongbin Zhang*, Xueqin Hu, Xiaonan Yi（Department of Pharmaceutical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009,China）ABSTRACT: OBJECTIVE To select a proper medium for recombinant dextransucrase expression in engineering strain E. coli BL21 (DE3)/pET28-dexYG and study the conditions of dextran synthesis. METHODS The medium components for cell growth and enzyme expression were optimized using an Orthogonal experiment. After the medium had been decided, the temperature、sucrose concentration and pH value effects on yield and viscosity of synthesized dextran were studied. RESULTS When the cell density reached 2.0, 0.25 mmol/L IPTG was added and the culture continued for 4 h for enzyme induction. Under the selected medium and these conditions, the dextransucrase expressed was with high activity. Sucrose concentration effects the dextran yield grateley ,but it could not control the molecular weight of dextran by controlling the synthesizing conditions. CONCLUSION Selected the medium for dextransucrase expression and conditions studies of dextran synthesis would provide bedrock for industrial production of dextran by the recombinant dextransucrase.KEYWORDS: dextransucrase; medium; expression; dextran引言基金项目：安徽高校省级自然科学研究重点项目（KJ2008A067），合肥工业大学博士基金（GDBJ2008-021）作者简介：王雅洁，女，安徽岳西人，硕士研究生。

*通讯作者：张洪斌，副教授，博士，Tel/Fax:+86-551-2901968; E-mail:zhb5678@右旋糖酐蔗糖酶（dextransucrase，EC 2.4.1.5）可以催化D-吡喃葡萄糖基从蔗糖转移到葡聚糖，是一种分泌型葡萄糖基转移酶（Glucosyltransferases）。

很多菌株，比如肠膜样明串珠菌（Leuconostoc）、链球菌（Streptococcus）和乳酸菌（Lactobacillus）都能在一定的培养条件下生产该酶。

右旋糖酐蔗糖酶的主要产物右旋糖酐作为血浆扩容剂受到广泛的关注，人们从肠膜样明串珠菌发酵液中分离纯化得到右旋糖酐蔗糖酶，并对其性质进行了研究[1，2]。

蔗糖是葡萄糖基最好的供体，其他糖及其衍生物如麦芽糖、异麦芽糖、黑曲霉糖及其他化合物都可以作为葡萄糖基的受体。

利用这些受体的反应，不仅可以生产在食品、医药行业应用广泛的右旋糖酐，还可以用来生产低分子量的葡聚糖。

果糖是天然的副产物，它接受一个葡萄糖基生产二糖-吡喃果糖-5-葡萄糖苷[3]，它是一种可用于工业转化的很有潜力的选择性增甜剂。

利用肠膜状明串珠菌或链球菌发酵得到的右旋糖酐蔗糖酶是诱导酶，诱导物与酶底物均为蔗糖，产生了的高粘度葡聚糖与酶和细胞形成复合物，对酶的提取纯化和催化产物的质量控制都造成很大的困难。

本实验室从一株L. mesenteriodes中扩增出右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG（GenBank，DQ34576），并成功构建了能高效表达的重组右旋糖酐蔗糖酶工程菌株E. coli BL21 (DE3)/pET28-dexYG[4]。

本文通过对培养基成分和表达条件的考察，实现在该工程菌中高效表达高活力的右旋糖酐蔗糖酶，并利用该酶进行合成右旋糖酐的研究。

1 材料1.1菌种：基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28-dexYG由本实验室构建、保存。

1.1主要试剂和仪器：异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）购自默克公司；卡那霉素购自上海捷瑞；其他常用试剂均为市售国产试剂。

1515型高效液相色谱仪（Waters公司）；VIS-723紫外分光光度计（上海精密科学仪器公司）；高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；低温冰箱 (－50℃)（日本SanYo）；pH计（上海康仪仪器）；恒温摇床（武汉中科仪器厂）。

2 方法2.1 右旋糖酐蔗糖酶的表达将基因工程菌BL21 (DE3)/pET28-dexYG于37℃、含卡那霉素（50 μg/m L）的LB培养基[5]中进行过夜密集培养。

将过夜培养的细菌按照1%的接种量接种到含卡那霉素（50 μg/m L）的新鲜培养基中，37 ℃、250 r/min培养至OD600为1.0时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，25 ℃、250 r/min诱导4 h右旋糖酐蔗糖酶的表达。

收集细菌沉淀，超声破碎细菌后，离心收集上清。

2.2 右旋糖酐蔗糖酶酶活力测定参照文献[6]。

2.3 酶表达培养基的组成研究培养基各组成及浓度研究，通过L1873七因素三水平正交实验，各因素与水平见表1。

按照表2分别配制培养基，并照1.2中分别在不同培养基中表达右旋糖酐蔗糖酶，检测酶活。

表1 培养基优化正交实验因素水平表Tab. 1 Selected factors and assigned levels for optimizing medium components and concentrationSerial no. Factor Level 1 Level 2 Level 31 Glycerol (g/L) 0 5 102 Glucose (g/L) 0 5 103 Tryptone (g/L) 5 10 154 Yeast extract (g/L) 2.5 5 105 M9 salt solution 0 0.5 16 Calcium chloride(mM) 0 0.05 0.17 Magnesium sulfate (mM) 0 0.1 0.2（10×M9 salt solution[7]（1L）：Na2HPO4·7H2O 12.8g；KH2PO4 3g；NaCl 0.5g；NH4Cl 1g。

）2.4 菌体生长曲线研究将基因工程菌BL21 (DE3)/pET28-dexYG于37℃、含卡那霉素（50 μg/m L）的LB培养基中进行过夜密集培养。

将过夜培养的细菌分别按照1%的接种量接种到含卡那霉素（50 μg/m L）的LB、表达培养基中，37 ℃、250 r/min培养，4h后加入IPTG至0.5mmol/L，25 ℃、250 r/min培养4h，每小时取样测OD600和pH值。

2.5 酶表达条件的研究在正交实验确定培养基组分的情况下，选择最优培养基，研究诱导菌浓、IPTG诱导浓度与诱导时间对酶活的影响。

2.6 重组右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐的研究通过改变反应体系中酶的浓度、蔗糖浓度、pH值和反应温度，研究不同反应条件对产量与特性黏度的影响。

用含0.05 g/L氯化钙、pH 5.4、200 mmol/L乙酸-乙酸钠配制蔗糖溶液，加入酶液后混合均匀于25 ℃反应。

反应结束后，向反应液中加入两倍体积95 %的乙醇，离心后弃上清液。

沉淀在75 %乙醇中反复捏洗后，置于60 ℃干燥，称重计算产量。

另取0.1 g样品溶解于50 mL去离子水，过滤后用乌式黏度计在25℃测量特性黏度。

2.7 HPLC 检测右旋糖酐分子量及分布采用HPLC法分析特性黏度不同的两种右旋糖酐产物，色谱条件如下：GPC分离柱（7.8mm ×300mm），2414型示差折光检测器；流动相为纯水，流速0.6mL/min，样品质量浓度1g/L；检测器温度40℃，柱温度60℃。

3. 结果3.1酶表达培养基的组成研究结果见表2。

诱导产酶培养基设计的最佳方案为：甘油5 g/L，葡萄糖5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母浸膏5 g/L，1×M9盐，镁离子0.1 mmol/L。