林木基因组及功能基因克隆研究概述
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原创性 , 迄今仍未有采用正向遗传学手段成功克隆 林木未知基因的例子。但由于林木基本处于半野生 状态 , 大多数物种具有理想的自然群体材料 , 这些 新技术的发展为结合分子数量遗传学和群体遗传学 的研究手段 , 在林木中实现功能基因的精细定位和 快速克隆打下了坚实的基础。 目前, 国际生物学已进入了系统科学的新时 代。海量增长的生物信息为分子育种和品种分子设 计奠定了良好的信息和理论基础。分子标记及转基 因技术的发展与应用 , 为实施品种分子设计提供了 重要的技术支撑 , 国际农作物育种已进入分子育种 时代。林木由于世代周期长、近交衰退等生物学特 性 , 严重阻碍了林木遗传改良的进程 , 分子育种是 突破林木遗传改良瓶颈的关键技术 , 一旦进入实际 应用 , 将对加速林木育种改良进程 , 对提高森林生 产力将发挥不可估量的作用。克隆控制重要经济性 状和抗逆性状的主效基因 , 并在自然群体中进行等 位基因开发, 是在林木中开展分子育种的前提和 基础。
HEREDITAS (Beijing) 2010 年 7 月 , 32(7): 677― 684 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn
综述
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2010.00677
林木基因组及功能基因克隆研究概述
尹佟明
南京林业大学 , 江苏省杨树品种改良与种质创新重点实验室 , 南京 210037
678
HEREDITAS (Beijing)
2010
第 32 卷
随着全球现代化进程的加快, 人类对自然资 源、 能源 , 尤其是化石燃料的过渡依赖 , 导致温室效 应加剧和不可替代能源衰竭 , 自工业革命以来 , 人 类在短短几百年的时间里将地球历史上亿万年以来 固定的大量二氧化碳释放到大气中 , 人类正面临着 可能发生的严重生态灾难。同时化石能源的日渐枯 竭也使人类面临严重的能源问题 , 能源安全已是关 系各个国家经济发展和社会稳定的首要问题。对大 气中的碳进行固定以及发展可再生替代能源是当代 科学工作者急需解决的重大课题。进入 20 世纪 90 年代以来 , 世界各国围绕涉及国家安全、经济、社 会和生态环境可持续发展等方面的重要战略问题 , 开展重大基础和应用基础研究。描绘林木基因组蓝 图 , 解析和阐明林木基因的功能 , 培育优质速生的 森林资源成为这场世界竞争的主战场。森林作为具 有自养功能的绿色植物是地球碳固定的主要贡献者 , 森林虽然只占陆地覆盖面积的 1/3 左右 , 而固碳量 却占绿色植物的 80%左右。因此提高森林生产力对 于减少温室气体的含量具有重要意义 [1, 2], 同时森林 也为人类提供了重要的、可持续利用的再生资源 。 加速林木育种进程 , 提高森林生产力是当前面临的 世界性的重要研究课题。 继 拟 南 芥 [4] 和 水 稻 [5] 全 基 因 组 测 序 完 成 以 后 , 2006 年美国 Science 杂志首次报道了第一个木本植 物的全基因组测序工作 [6], 2007 年英国 Nature 杂志 又报道了第二个木本植物— —葡萄的全基因组测序 研究[7]。 近年来由于第二代测序平台的推出, 有望使全 基因组测序成为一种低成本、常规的研究手段。进入 2009 年以来, 宣布即将完成全基因组测序的物种名单 不断增加, 如根据美国能源部联合基因研究所最新公 布的信息, 在该所开展全基因组测序的真核生物已达 109 个, 原核生物达 473 个(http://genome.jgi-psf.org/)。 测序技术的飞速发展 , 将使林木从基本遗传平台构 建研究的初始阶段 , 快速进入后基因组研究时代。 以比较与功能基因组为代表的基础研究 , 和以分子 育种为代表的应用研究将成为林木遗传研究的重点 和热点。测序技术的发展使超高通量 SNP 检测成为 可能 , 结合芯片杂交与 454 测序技术 , 目标区域局 部测序技术也日臻成熟 。 在一些重要作物中 , 已有 许多控制重要农艺性状的主效基因被克隆 。目前 林木基因克隆研究还主要以同源克隆为主
摘要: 在美国能源部资助下 , 首个多年生木本植物— — 杨树的全基因组测序已经完成且序列信息已对公众开
放。杨树全基因组测序的完成标志着林木基因组进入后基因组研究时代。克隆控制重要性状的主效基因是林木 后基因组时代的主要研究内容。近年来 , 在一些重要作物 , 如水稻、蕃茄及玉米中 , 先后成功克隆了多个控制 重要农艺性状的主效基因 , 分子育种在作物中已进入实用阶段。林木相对于这些重要作物而言 , 分子遗传学的 研究起步较晚 , 同时 , 由于林木自身的一些生物学特性 , 在林木中精确定位与克隆未知基因一度被视为遗传学 研究领域的难点。随着技术和研究手段的不断进步 , 以及林木基因组资源的快速积累 , 有望在这一领域取得突 破 , 为在林木中开展分子育种创造条件。文章综述了国际上林木基因组与功能基因克隆研究的现状与新发展 , 并对后基因组时代的林木功能基因克隆研究的预期成果进行了展望 , 以期为从事该领域研究的科研人员提供 参考。
Abstract: Supported by the Department of Energy (DOE) of U.S., the first tree genome, black cottonwood (Populus trichocarpa), has been completely sequenced and publicly release. This is the milestone that indicates the beginning of post-genome era for forest trees. Identification and cloning genes underlying important traits are one of the main tasks for the post-genome-era tree genomic studies. Recently, great achievements have been made in cloning genes coordinating important domestication traits in some crops, such as rice, tomato, maize and so on. Molecular breeding has been applied in the practical breeding programs for many crops. By contrast, molecular studies in trees are lagging behind. Trees possess some characteristics that make them as difficult organisms for studying on locating and cloning of genes. With the advances in techniques, given also the fast growth of tree genomic resources, great achievements are desirable in cloning unknown genes from trees, which will facilitate tree improvement programs by means of molecular breeding. In this paper, the author reviewed the progress in tree genomic and gene cloning studies, and prospected the future achievements in order to provide a useful reference for researchers working in this area.
, 缺少
第7期
尹佟明 : 林木基因组及功能基因克隆研究概述
679
克隆研究所需要的遗传平台包括 : 遗传图、物理图 和序列图。
成了遗传图谱 [10,
19, 20]
, 也开展了大量数量性状遗传
位点分析 , 但距在林木中实现图位克隆这一目标仍 相距甚远。然而通过这些研究 , 使林木分子遗传学 家认识到了林木遗传图谱构建和 QTL 分析中存在的 问题 , 同时由于测序技术的飞速发展 , 使在林木中 大量发展保守性高的、序列特异性标记成为可能。 2001 年 , Genetics 杂志报道了含有上百个 SSR 标记 杨树的遗传图谱 [21], 松树也建成了含有近百个表达 序列标签多态性分子 (Expressed sequence tag polymorphism, ESTP)标记的遗传图谱 [22]。这些标记在遗 传图谱中的大量应用 , 使林木分子遗传学家早期的 构想成为现实 , 通过这些标记 , 我们可以对种内不 同家系以及属内不同种间的遗传图谱进行比较 , 根 据标记在染色体上的线性顺序可以研究不同个体基 因组中的染色体重排事件 , 同时可以建成宏基因组 平台 , 将不同家系、不同种、甚至属级分类水平上 的物种的基因组作为一个大遗传系统进行研究。利 用宏基因组平台 , 我们可以将不同学科利用不同材 料获得的遗传信息整合到一起 , 进行比较、 验证 , 从 而为在林木中实现图位克隆提供可靠的依据。 2002 年 , 美国能源部启动了杨树全基因组测序 计划 , 由于染色体组装的需要 , 需要建成高密度、 高 覆盖度和高精度的遗传图谱。在杨树全基因测序计 划的带动下 , 美国能源部橡树岭国家实验室于 2004 年发表了林木第一张与染色单体数相对应的、覆盖 全基因组的遗传图谱 [23] 。这一工作是与全基因组测 序同时独立展开的 , 其后的结果表明 , 图谱上标记 的顺序与它们在染色体序列组装中的顺序有高度的 一致性 , 比对中发现的几个主要的染色体重排事件 , 也在其后的比较基因组研究中得到了证实。同时通 过单倍体细胞交叉数、 累计观测长度及 1 000 次抽样 估算的遗传长度 , 均显示杨树基因组的期望遗传长 度约为 2 500 cM。 该图谱实现了杨树基因组的完整覆 盖 , 所获得的近千个遗传标记全部定位在了不同的 染色体上。该图谱的建成, 标志着林木中高精度遗传 图谱的建成, 为 QTL 的准确定位创造了条件。 2.2 林木物理图谱构建和 EST 测序 染色体步行是经典图位克隆的重要环节 , 因此 物理图谱是图位克隆研究的重要平台之一。Genome Canada 和美国橡树岭国家实验室联合报道了杨树的
关键词: 基因克隆 ; 林木基因组 ; 反向遗传学 ; 正向遗传学 ; 连锁分析 ; 相关分析 ; 分子育种
A review of the genomic and gene cloning studies in trees
YIN Tong-Ming
Jiangsu Key Laboratory for Poplar Germplasm Enhancement and Variety Improvement, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
Keywords: gene cloning; tree genome; reverse genetics; forward genetics; linkage analysis; association analysis; molecular breeding
收稿日期 : 20091030; 修回日期 : 20091224 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (编号： 30971609)和林业公益性行业科研专项 (编号： 200904002)资助 作者简介 : 尹佟明 (1970), 男 , 教授 , 博士 , 研究方向：分子数量遗传学与基因组学。 Tel: 025-85428165; E-mail: tmyin@njfu.edu.cn. 致 谢 : 感谢王明庥院士、黄敏仁教授、施季森教授 , 他们Leabharlann Baidu讨论和评述为本文的写作提供了许多帮助 , 在此深表谢意！
1
未知基因克隆的遗传学手段
识别和克隆未知基因的遗传学手段可分为两大
类 : 反向遗传学手段和正向遗传学手段。反向遗传 学手段是通过突变诱导、插入失活、转座子示踪等 技术来研究基因的功能 , 即由遗传物质到性状、表 型的研究途径。反向遗传学是功能基因组研究的主 要技术手段。通过反向遗传研究 , 已有许多重要基 因被识别和克隆 , 代表性的如 MADSBOX 基因家族 中一些重要基因的克隆 [11]。然而通过随机突变或基 因修饰产生的表型变化是随机的 , 很难恰好出现我 们感兴趣的表型。对育种工作者而言 , 更感兴趣的 是如何针对一些重要的经济性状和抗逆性状 , 识别 并克隆相应的主效基因。从生物的性状、表型到遗 传物质的研究途径称为正向遗传学手段。在未知基 因克隆研究领域 , 正向遗传学的代表性技术是图位 克隆。林木相比于拟南芥 , 不太适合作为功能基因 组基础研究的模式植物。对林木而言 , 急需研究清 楚的是那些控制重要经济性状和抗逆性状的主效基 因 , 为分子育种的开展创造条件。图位克隆技术是 定位与分离这些基因的有效遗传学手段之一。进行 图位克隆需要建立相应的遗传研究平台 , 经典图位
原创性 , 迄今仍未有采用正向遗传学手段成功克隆 林木未知基因的例子。但由于林木基本处于半野生 状态 , 大多数物种具有理想的自然群体材料 , 这些 新技术的发展为结合分子数量遗传学和群体遗传学 的研究手段 , 在林木中实现功能基因的精细定位和 快速克隆打下了坚实的基础。 目前, 国际生物学已进入了系统科学的新时 代。海量增长的生物信息为分子育种和品种分子设 计奠定了良好的信息和理论基础。分子标记及转基 因技术的发展与应用 , 为实施品种分子设计提供了 重要的技术支撑 , 国际农作物育种已进入分子育种 时代。林木由于世代周期长、近交衰退等生物学特 性 , 严重阻碍了林木遗传改良的进程 , 分子育种是 突破林木遗传改良瓶颈的关键技术 , 一旦进入实际 应用 , 将对加速林木育种改良进程 , 对提高森林生 产力将发挥不可估量的作用。克隆控制重要经济性 状和抗逆性状的主效基因 , 并在自然群体中进行等 位基因开发, 是在林木中开展分子育种的前提和 基础。
HEREDITAS (Beijing) 2010 年 7 月 , 32(7): 677― 684 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn
综述
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2010.00677
林木基因组及功能基因克隆研究概述
尹佟明
南京林业大学 , 江苏省杨树品种改良与种质创新重点实验室 , 南京 210037
678
HEREDITAS (Beijing)
2010
第 32 卷
随着全球现代化进程的加快, 人类对自然资 源、 能源 , 尤其是化石燃料的过渡依赖 , 导致温室效 应加剧和不可替代能源衰竭 , 自工业革命以来 , 人 类在短短几百年的时间里将地球历史上亿万年以来 固定的大量二氧化碳释放到大气中 , 人类正面临着 可能发生的严重生态灾难。同时化石能源的日渐枯 竭也使人类面临严重的能源问题 , 能源安全已是关 系各个国家经济发展和社会稳定的首要问题。对大 气中的碳进行固定以及发展可再生替代能源是当代 科学工作者急需解决的重大课题。进入 20 世纪 90 年代以来 , 世界各国围绕涉及国家安全、经济、社 会和生态环境可持续发展等方面的重要战略问题 , 开展重大基础和应用基础研究。描绘林木基因组蓝 图 , 解析和阐明林木基因的功能 , 培育优质速生的 森林资源成为这场世界竞争的主战场。森林作为具 有自养功能的绿色植物是地球碳固定的主要贡献者 , 森林虽然只占陆地覆盖面积的 1/3 左右 , 而固碳量 却占绿色植物的 80%左右。因此提高森林生产力对 于减少温室气体的含量具有重要意义 [1, 2], 同时森林 也为人类提供了重要的、可持续利用的再生资源 。 加速林木育种进程 , 提高森林生产力是当前面临的 世界性的重要研究课题。 继 拟 南 芥 [4] 和 水 稻 [5] 全 基 因 组 测 序 完 成 以 后 , 2006 年美国 Science 杂志首次报道了第一个木本植 物的全基因组测序工作 [6], 2007 年英国 Nature 杂志 又报道了第二个木本植物— —葡萄的全基因组测序 研究[7]。 近年来由于第二代测序平台的推出, 有望使全 基因组测序成为一种低成本、常规的研究手段。进入 2009 年以来, 宣布即将完成全基因组测序的物种名单 不断增加, 如根据美国能源部联合基因研究所最新公 布的信息, 在该所开展全基因组测序的真核生物已达 109 个, 原核生物达 473 个(http://genome.jgi-psf.org/)。 测序技术的飞速发展 , 将使林木从基本遗传平台构 建研究的初始阶段 , 快速进入后基因组研究时代。 以比较与功能基因组为代表的基础研究 , 和以分子 育种为代表的应用研究将成为林木遗传研究的重点 和热点。测序技术的发展使超高通量 SNP 检测成为 可能 , 结合芯片杂交与 454 测序技术 , 目标区域局 部测序技术也日臻成熟 。 在一些重要作物中 , 已有 许多控制重要农艺性状的主效基因被克隆 。目前 林木基因克隆研究还主要以同源克隆为主
摘要: 在美国能源部资助下 , 首个多年生木本植物— — 杨树的全基因组测序已经完成且序列信息已对公众开
放。杨树全基因组测序的完成标志着林木基因组进入后基因组研究时代。克隆控制重要性状的主效基因是林木 后基因组时代的主要研究内容。近年来 , 在一些重要作物 , 如水稻、蕃茄及玉米中 , 先后成功克隆了多个控制 重要农艺性状的主效基因 , 分子育种在作物中已进入实用阶段。林木相对于这些重要作物而言 , 分子遗传学的 研究起步较晚 , 同时 , 由于林木自身的一些生物学特性 , 在林木中精确定位与克隆未知基因一度被视为遗传学 研究领域的难点。随着技术和研究手段的不断进步 , 以及林木基因组资源的快速积累 , 有望在这一领域取得突 破 , 为在林木中开展分子育种创造条件。文章综述了国际上林木基因组与功能基因克隆研究的现状与新发展 , 并对后基因组时代的林木功能基因克隆研究的预期成果进行了展望 , 以期为从事该领域研究的科研人员提供 参考。
Abstract: Supported by the Department of Energy (DOE) of U.S., the first tree genome, black cottonwood (Populus trichocarpa), has been completely sequenced and publicly release. This is the milestone that indicates the beginning of post-genome era for forest trees. Identification and cloning genes underlying important traits are one of the main tasks for the post-genome-era tree genomic studies. Recently, great achievements have been made in cloning genes coordinating important domestication traits in some crops, such as rice, tomato, maize and so on. Molecular breeding has been applied in the practical breeding programs for many crops. By contrast, molecular studies in trees are lagging behind. Trees possess some characteristics that make them as difficult organisms for studying on locating and cloning of genes. With the advances in techniques, given also the fast growth of tree genomic resources, great achievements are desirable in cloning unknown genes from trees, which will facilitate tree improvement programs by means of molecular breeding. In this paper, the author reviewed the progress in tree genomic and gene cloning studies, and prospected the future achievements in order to provide a useful reference for researchers working in this area.
, 缺少
第7期
尹佟明 : 林木基因组及功能基因克隆研究概述
679
克隆研究所需要的遗传平台包括 : 遗传图、物理图 和序列图。
成了遗传图谱 [10,
19, 20]
, 也开展了大量数量性状遗传
位点分析 , 但距在林木中实现图位克隆这一目标仍 相距甚远。然而通过这些研究 , 使林木分子遗传学 家认识到了林木遗传图谱构建和 QTL 分析中存在的 问题 , 同时由于测序技术的飞速发展 , 使在林木中 大量发展保守性高的、序列特异性标记成为可能。 2001 年 , Genetics 杂志报道了含有上百个 SSR 标记 杨树的遗传图谱 [21], 松树也建成了含有近百个表达 序列标签多态性分子 (Expressed sequence tag polymorphism, ESTP)标记的遗传图谱 [22]。这些标记在遗 传图谱中的大量应用 , 使林木分子遗传学家早期的 构想成为现实 , 通过这些标记 , 我们可以对种内不 同家系以及属内不同种间的遗传图谱进行比较 , 根 据标记在染色体上的线性顺序可以研究不同个体基 因组中的染色体重排事件 , 同时可以建成宏基因组 平台 , 将不同家系、不同种、甚至属级分类水平上 的物种的基因组作为一个大遗传系统进行研究。利 用宏基因组平台 , 我们可以将不同学科利用不同材 料获得的遗传信息整合到一起 , 进行比较、 验证 , 从 而为在林木中实现图位克隆提供可靠的依据。 2002 年 , 美国能源部启动了杨树全基因组测序 计划 , 由于染色体组装的需要 , 需要建成高密度、 高 覆盖度和高精度的遗传图谱。在杨树全基因测序计 划的带动下 , 美国能源部橡树岭国家实验室于 2004 年发表了林木第一张与染色单体数相对应的、覆盖 全基因组的遗传图谱 [23] 。这一工作是与全基因组测 序同时独立展开的 , 其后的结果表明 , 图谱上标记 的顺序与它们在染色体序列组装中的顺序有高度的 一致性 , 比对中发现的几个主要的染色体重排事件 , 也在其后的比较基因组研究中得到了证实。同时通 过单倍体细胞交叉数、 累计观测长度及 1 000 次抽样 估算的遗传长度 , 均显示杨树基因组的期望遗传长 度约为 2 500 cM。 该图谱实现了杨树基因组的完整覆 盖 , 所获得的近千个遗传标记全部定位在了不同的 染色体上。该图谱的建成, 标志着林木中高精度遗传 图谱的建成, 为 QTL 的准确定位创造了条件。 2.2 林木物理图谱构建和 EST 测序 染色体步行是经典图位克隆的重要环节 , 因此 物理图谱是图位克隆研究的重要平台之一。Genome Canada 和美国橡树岭国家实验室联合报道了杨树的
关键词: 基因克隆 ; 林木基因组 ; 反向遗传学 ; 正向遗传学 ; 连锁分析 ; 相关分析 ; 分子育种
A review of the genomic and gene cloning studies in trees
YIN Tong-Ming
Jiangsu Key Laboratory for Poplar Germplasm Enhancement and Variety Improvement, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
Keywords: gene cloning; tree genome; reverse genetics; forward genetics; linkage analysis; association analysis; molecular breeding
收稿日期 : 20091030; 修回日期 : 20091224 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (编号： 30971609)和林业公益性行业科研专项 (编号： 200904002)资助 作者简介 : 尹佟明 (1970), 男 , 教授 , 博士 , 研究方向：分子数量遗传学与基因组学。 Tel: 025-85428165; E-mail: tmyin@njfu.edu.cn. 致 谢 : 感谢王明庥院士、黄敏仁教授、施季森教授 , 他们Leabharlann Baidu讨论和评述为本文的写作提供了许多帮助 , 在此深表谢意！
1
未知基因克隆的遗传学手段
识别和克隆未知基因的遗传学手段可分为两大
类 : 反向遗传学手段和正向遗传学手段。反向遗传 学手段是通过突变诱导、插入失活、转座子示踪等 技术来研究基因的功能 , 即由遗传物质到性状、表 型的研究途径。反向遗传学是功能基因组研究的主 要技术手段。通过反向遗传研究 , 已有许多重要基 因被识别和克隆 , 代表性的如 MADSBOX 基因家族 中一些重要基因的克隆 [11]。然而通过随机突变或基 因修饰产生的表型变化是随机的 , 很难恰好出现我 们感兴趣的表型。对育种工作者而言 , 更感兴趣的 是如何针对一些重要的经济性状和抗逆性状 , 识别 并克隆相应的主效基因。从生物的性状、表型到遗 传物质的研究途径称为正向遗传学手段。在未知基 因克隆研究领域 , 正向遗传学的代表性技术是图位 克隆。林木相比于拟南芥 , 不太适合作为功能基因 组基础研究的模式植物。对林木而言 , 急需研究清 楚的是那些控制重要经济性状和抗逆性状的主效基 因 , 为分子育种的开展创造条件。图位克隆技术是 定位与分离这些基因的有效遗传学手段之一。进行 图位克隆需要建立相应的遗传研究平台 , 经典图位