用鸡胚分离流行性乙型脑炎病毒从血液分离成功二例
猪的疾病 猪流行性乙型脑炎 的知识和防治
猪的疾病猪流行性乙型脑炎的知识和防治一、概述：猪流行性乙型脑炎(Swine epidemic encephalitis B)是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种人、畜共患传染病。
猪感染后表现为高热、流产、产死胎及公猪睾丸炎。
本病由蚊虫传播，常于夏末初秋流行，有明显的季节性。
从1871年首次在日本发现至1934年在日本分离出乙脑病毒，已有过十几次大流行。
现在东南亚地区的日本、朝鲜、菲律宾、泰国、印度尼西亚、印度及我国都有发生，其他国家称为日本脑炎，为了与日本冬春季流行的一种嗜眠性脑炎(称流行性甲型脑炎)相区别，故将本病称为乙型脑炎。
本病分布很广，主要在亚洲各国发生，我国较多地区都有发生，人畜共患，危害甚大，被世界卫生组织列为需要重点控制的传染病。
也是我国重点防制的传染病之一。
二、病原：流行性乙型脑炎病毒属黄病毒科(Flavividae)、黄病毒属(Flavivirus)，是一种小的病毒。
病毒粒子直径约30～40nm，呈球形，20面体对称，为单股RNA。
在氯化铯中的浮密度为1.24～1.25g/cm3。
有囊膜，外层为含糖蛋白的纤突。
外层纤突是具有血凝活性，能凝集鹅、鸭、鸽、绵羊和雏鸡的红细胞。
但不同毒株的血凝滴度有明显的差异。
本病毒能在多种细胞上培养繁殖。
可在鸡胚卵黄囊内繁殖，在鸡胚成纤维细胞、猪肾细胞、仓鼠肾细胞、牛胚肾细胞以及BHK21、PK15、Hela、Vero等传代细胞中增殖，并产生细胞病变和形成蚀斑。
马、牛、羊、猪、鸡都有相当高的隐性感染率，病毒在感染动物血液内存留的时间很短，主要存在于脑、脑脊髓液和死产胎儿的脑组织，以及血液、脾、肿胀的睾丸，以肿胀睾丸的含毒量最高。
流行地区的吸血昆虫，特别是伊蚊属和库蚊属昆虫体内常能分离到病毒。
试验动物中，各种年龄的小鼠都有高度的易感性，是常用来分离和繁殖病毒的实验动物，其中以1～3日龄的乳鼠最易感。
小鼠脑内接种最好，接种后2～4天发病，并于1～2天死亡。
猪乙型脑炎症状表现及流行特点
猪乙型脑炎症状表现及流行特点猪乙型脑炎多发于日本、东南亚、俄罗斯、朝鲜、马来西亚、越南、新加坡、泰国、缅甸、斯里兰卡、印度尼西亚，我国的台湾和香港也有报道。
下面我们了解一下猪乙型脑炎症状表现及流行特点。
一、猪乙型脑炎的临床症状(1)人工感染的潜伏期3-4天。
猪常突然发病，体温升高达40-41℃，呈稽留热。
病猪精神委顿，喜卧，饮欲增加，结膜潮红，食欲减少或废绝，粪干呈球形，表面常覆有灰白色黏液，尿呈深黄色。
少部分猪后肢轻度麻痹，有的后肢关节肿胀疼痛而跛行，有的病猪可能有视力障碍。
(2)怀孕母猪感染后，发生流产、早产或延时分娩，胎儿大小不等，且多是死胎或木乃伊胎。
流产后，母猪症状减轻，康复后不影响下次配种。
有的怀孕母猪临近预产期都不见腹部和乳房膨大，不泌乳。
同窝仔猪的大小和病变有显著差别，有的出生后几天内就发生痉挛而死亡，有的却生长发育良好。
(3)公猪感染后除表现一般症状外，常发生睾丸肿胀，且多呈一侧性，程度不一；局部发热，有痛感；约数日后开始消退．多数缩小变硬，失去配种能力。
二、猪乙型脑炎的实验室诊断(1)初步诊断：根据流行病学，同场公母猪的临床表现，妊娠母猪分娩后所产仔猪情况，病理剖检等资料进行初步诊断。
确诊有赖于实验室进行的血清学检查或病毒分离。
(2)病毒分离鉴定：病毒分离是对疑似本病流产或早产的胎儿，采死产仔猪的脑组织，并将其制成悬液，接种于鸡胚卵黄囊内或1-5日龄乳鼠脑内，进行病毒分离，通过中和试验等方法确定分离病毒是否为jev。
(3)血凝抑制试验：乙脑的血凝抑制抗体较补体结合抗体出现的早，一般在发病后4-5天开始出现，病后2周左右达到高峰，并可持续1年左右。
因此，测定血凝抑制抗体可以较早的做出诊断。
一般按双份血清法判定，即恢复血清的血凝抑制效价为急性期的4倍以上才具有诊断意义。
血细胞主要采自鹅、鸽和雏鸡。
(4)酶联免疫吸附试验(elisa)：本试验的阳性检出率明显高于补体结合试验，检出的脑脊髓液、胎儿体内的lgm抗体具有早期诊断意义。
国家流感中心标准操作规程
（修订版）
中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 二○○七年三月
前言
为规范国家流感中心的实验技术和操作步骤，保证实验结果的准 确性和可重复性，并作为国家流感中心所有工作人员使用指南。依据 《中华人民共和国传染病防治法》、《中华人民共和பைடு நூலகம்国家标准实验室 生物安全通用要求（GB 1989-2004）》及相关法律法规，参考世界卫 生组织《实验室生物安全手册（第三版）》以及流感/禽流感相关推荐 方案，并根据《流行性感冒诊断标准》、《人禽流感诊断标准》和《禽 流感实验室检测技术方案》中的相关内容制定了本标准操作规程 （SOP）。在国家流感中心标准操作规程（2004 年版）的基础上，增 补了大量内容，制定本标准操作规程。
本版标准操作规程包括基本生物学实验 SOP、标本采集 SOP、 病毒分离 SOP、病毒鉴定 SOP、病毒核酸检测 SOP、血清学检测 SOP、 动物学实验 SOP、耐药性监测 SOP 以及标本及毒株管理 SOP 等。并 且根据近年来的工作需要和进展，建立了许多实验方法，如分子鉴别 诊断技术、禽流感 H5N1 NASBA 检测方法、流感/禽流感抗体单放射 免疫扩散溶血技术（SRH）等以及研究工作中实验的操作规程。
第五章 核酸检测 SOP......................................................................................101
流感/禽流感病毒 RT-PCR 引物制备 ..........................................................................103 流感/禽流感病毒 Real-time PCR 引物探针制备........................................................105 禽流感病毒 RT-PCR 检测 ...........................................................................................107 人禽流感实时荧光定量 PCR 检测 .............................................................................113 禽流感病毒 H5N1 NASBA 检测 ................................................................................119 分子鉴别诊断技术.......................................................................................................125
预防疾控微生物检验技术：呼吸道病毒考试试题(最新版)
预防疾控微生物检验技术：呼吸道病毒考试试题（最新版）1、单选最易发生抗原变异，造成流感大流行的是（）最易发生抗原变异，造成流感大流行的是A.甲型流感病毒B.乙型流感病毒C.丙型流感病毒D.副流感病毒E.呼（江南博哥）吸道合胞病毒正确答案：A2、单选流感病毒抗原变异的意义在于（）A.引起血凝现象B.增强病毒的侵袭力C.易于在鸡胚尿囊腔生长D.抗原性增强E.导致新亚型出现造成流感大正确答案：E3、单选流感特异预防效果不理想的主要原因是（）A.病毒的抗原性弱B.有很多不同亚型病毒同时流行C.甲型流感病毒的血凝素和神经氨酸极易发生变异D.活疫苗出现毒力返祖E.亚单位疫苗免疫力维持时间短正确答案：C4、单选从流感病人的咽漱液中分离流感病毒，最好将标本接种于（）A.小鼠腹腔B.鸡胚羊膜腔C.鸡胚尿囊腔D.人胚羊膜细胞E.Hela细胞正确答案：B5、多选可引起中枢神经系统感染的有（）可引起中枢神经系统感染的有A.流感病毒B.风疹病毒C.麻疹病毒D.呼吸道合胞病毒E.副流感病毒正确答案：B, C6、多选有关“流感病毒”的叙述，哪项是正确的（）有关"流感病毒"的叙述，哪项是正确的：A.为分节段的RNA病毒B.易发生抗原性变异C.核衣壳上有血凝素D.易在鸡胚中生长繁殖E.可引起人兽共患病正确答案：A, B, D, E7、多选风疹病毒的传播途径有（）A.皮肤接触B.呼吸道C.垂直传播D.消化道E.媒介昆虫叮咬正确答案：B, C8、单选流感病毒的血凝素和神经氨酸酶属于（）A.衣壳B.核心C.包膜D.刺突E.壳粒正确答案：D9、单选下列哪种病毒不属RNA病毒（）A.流感病毒B.副流感病毒C.呼吸道合胞病毒D.风疹病毒E.腺病毒正确答案：E10、单选为预防风疹和先天性风疹综合征，禁忌接种风疹减毒活疫苗的人群是（）A.育龄期女青年B.结婚登记时的女青年C.注射过抗风疹人血清免疫球蛋白孕妇D.妊娠妇女（孕妇）E.1岁以上的少年儿童正确答案：B11、单选划分流感病毒亚型是依据（）A.核蛋白抗原B.M蛋白抗原C.HA和NAD.核酸类型E.培养特性正确答案：C12、多选流感易造成大流行的原因有（）A.血凝素和神经氨酸酶易发生变异B.流感病毒可经飞沫和密切接触方式迅速传播C.人群对新亚型缺乏免疫力D.缺乏有效的流感疫苗E.流感病毒对理化因素抵抗力强正确答案：A, B, C, D13、单选孕妇在怀孕期最初3个月感染哪种病毒可能引起胎儿先天性畸形（）A.风疹病毒B.腺病毒C.腮腺炎病毒D.柯萨奇病毒E.ECHO病毒正确答案：A14、单选甲型流感病毒亚型划分的依据是（）A.脂蛋白B.包膜上的血凝素和神经氨酸酶C.内膜蛋白D.可溶性抗原E.核蛋白正确答案：B15、单选预防麻疹最有效的措施是（）A.注射胎盘球蛋白B.注射成人全血C.注射丙种球蛋白D.注射麻疹减毒活疫苗E.注射恢复期病人血清正确答案：D16、单选与流感病毒成熟释放有关的成分是（）A.血凝素B.神经氨酸酶C.M蛋白D.脂质双层E.LPS正确答案：B17、单选麻疹病毒的受体是（）A.唾液酸B.CD46C.CD4D.免疫球蛋白超家族的细胞粘附分子E.聚合人血清白蛋白正确答案：B18、单选甲型流感病毒最容易发生变异的成分是（）A.包膜脂类B.神经氨酸酶和血凝素C.衣壳蛋白D.基质蛋白E.核蛋白正确答案：B19、多选能引起5岁幼儿结膜炎的病原体是（）A.腺病毒B.副流感病毒C.沙眼衣原体D.肺炎链球菌E.埃及嗜血杆菌正确答案：A, C, D, E参考解析：腺病毒引起眼结膜炎和角膜结膜炎。
流行性乙型脑炎(全科)课件
参与社区防控
全科医生应积极参与社区 防控工作，指导居民做好 个人防护和消毒措施。
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THANKS
临床特征
潜伏期：一般为10-14天，平均12天。
以上内容仅供参考，具体可查阅专业医 学书籍或咨询专业医生获取更全面和准 确的信息。
后遗症期：部分患者可遗留神经系统后 遗症，如智力减退、瘫痪等。
前驱期：起病急，常有发热、头痛、恶 心、呕吐等前驱症状。
急性期：主要表现为高热、头痛、意识 障碍、抽搐等症状，严重者可出现呼吸 衰竭、休克等。
告知患者家属
全科医生应及时告知患者家 属病情，并指导家属如何照 顾患者。
抗病毒治疗
对于确诊的流行性乙型脑炎 患者，全科医生应及时启动 抗病毒治疗，以减轻症状和 缩短病程。
研究展望
疫苗接种
抗病毒药物
进一步研究和开发针对流行 性乙型脑炎的疫苗，提高接
种覆盖率。
研究和开发新的抗病毒药物 ，以更有效地治疗流行性乙
02
流行性乙型脑炎的诊断与 鉴别诊断
诊断标准
临床症状
急性起病，高热、头痛、呕吐、 意识障碍等。
流行病学资料
在流行季节（夏秋季）发病，患 者近期与蚊虫叮咬史。
实验室检查
脑脊液检查显示白细胞增多，以 淋巴细胞为主，蛋白轻度增高， 糖正常或偏高，氯化物正常。血 清学检测显示特异性IgM抗体阳
性。
鉴别诊断
疫苗接种后可产生有效的免疫保护，降低感染和发病风险。
04
流行性乙型脑炎的案例分 析
案例一：疑似流行性乙型脑炎的病例
发病前1周有发热、头痛、恶心等 症状，随后出现意识障碍、抽搐 等表现。
流行性乙型脑炎
流行性乙型脑炎【概述】流行性乙型脑炎（以下简称乙脑）的病原体1934年在日本发现，故名日本乙型脑炎，1939年我国也分离到乙脑病毒，解放后进行了大量调查研究工作，改名为流行性乙型脑炎。
本病主要分布在亚洲远东和东南亚地区，经蚊传播，多见于夏秋季，临床上急起发病，有高热、意识障碍、惊厥、强直性痉挛和脑膜刺激征等，重型患者病后往往留有后遗症。
【诊断】临床诊断主要依靠流行病学资料、临床表现和实验室检查的综合分析，确诊有赖于血清学和病源学检查。
（一）流行病学资料本病多见于7～9三个月内，南方稍早、北方稍迟。
10岁以下儿童发病率最高。
（二）主要症状和体征起病急、有高热、头痛、呕吐、嗜睡等表现。
重症患者有昏迷、抽搐、吞咽困难、呛咳和呼吸衰竭等症状。
体征有脑膜刺激征、浅反射消失、深反射亢进、强直性瘫痪和阳性病反射等。
（三）实验室检查1.血象白细胞总数常在1万～2万/mm3，中性粒细胞在80%以上；在流行后其的少数轻型患者中，血象可在正常范围内。
2.脑脊液呈无色透明，压力仅轻度增高，白细胞计数增加，在50～500/mm3，个别可高达1000/mm3以上。
病初2～3天以中性粒细胞为主，以后则单核细胞增多。
糖正常或偏高，蛋白质常轻度增高，氯化物正常。
病初1～3天内，脑脊液检查在少数病例可呈阴性。
3.病毒分离病程1周内死亡病例脑组织中可分离到乙脑病毒，也可用免疫荧光（IFT）在脑组织中找到病毒抗原。
从脑脊液或血清中不易分离到病毒。
4.血清学检查⑴补体结合试验：阳性出现较晚，一般只用于回顾性诊断和当年隐性感染者的调查。
⑵中和试验：特异性较高，但方法复杂，抗体可持续10多年，仅用于流行病学调查。
⑶血凝抑制试验：抗体产生早，敏感性高、持续久，但特异性较差，有时出现假阳性。
可用于诊断和流行病学调查。
⑷特异性IgM抗体测定：特异性IgM抗体在感染后4天即可出现，2～3周内达高峰，血或脑脊液中特异性IgM抗体在3周内阳性率达70%～90%，可作早期诊断，与血凝抑制试验同时测定，符合率可达95%。
病毒的分离与鉴定
(5)每日在灯下检视鸡
胚情况(若鸡胚在接种 后24h内死亡为非特异 性死亡,应弃之).
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
实验材料 (1)脑炎病毒悬液. (2)小白鼠(3W龄). (3)1ml的注射器、针头. (4)碘酒、酒精棉球. 实验方法: (1)以左手将小白鼠头部和体部固定于台面. (2)用碘酒、酒精棉球消毒头部右侧眼、耳间部位
鸡胚尿囊腔接种法
实验材料： (1)来亨鸡受精卵、卵架、检卵灯。 (2)碘酒、酒精消毒棉球。 (3)灭菌的手术刀、镊子、剪刀。 (4)1ml注射器及针头。 (5)病毒液:流感病毒、新城鸡瘟病毒。 (6)无菌胶布。
分离鉴定程序 病人急性期咽喉含漱液 (经双抗处理) 鸡胚培养(羊水囊或尿囊腔) 35℃ ，72h 收获：取羊水或尿囊液作血凝试验 (+) ( —) 作血凝抑制试验 盲传鸡胚两代，仍为 阴性时报告阴性
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
(3)以1ml的注射器抽提病毒悬液,以右手持注射器, 将针头向眼外与耳根连线中点略偏向耳的方向刺 入颅腔,约进针2~3mm,注入量0.02~0.03ml.
(4)注射完毕,将用过之物煮沸消毒. 实验结果:
接种后每日观察动物2次.动物一般在接种后3-4d后 开始发病,食欲减退,活动迟缓,耸毛、震颤、卷曲、 尾强直,逐渐导致麻痹、瘫痪而死亡.
实验方法：
(1)取孵育10~12d鸡胚, 在检卵灯下画出气室
界线,于胚胎附近无大
血管处画出标记作为
注射入口.
(2)将卵置于卵架上,消 毒标记处,用无菌剪刀 尖在标记处打一小孔.
实验方法：
(3)用灭菌注射器吸取流感病毒液 0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射. (4)注射后,用无菌胶布 封孔,置35度温箱孵育.
乙型脑炎实验报告
一、实验目的1. 学习乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）的分离和培养技术。
2. 掌握乙型脑炎病毒的鉴定方法，包括病毒颗粒的形态学观察、血清学检测和分子生物学检测。
3. 了解乙型脑炎病毒的基本生物学特性及其在疾病发生发展中的作用。
二、实验原理乙型脑炎病毒是一种单股正链RNA病毒，属于黄病毒科。
它通过蚊虫叮咬传播，感染人类和中枢神经系统动物。
本实验采用脑组织悬液进行病毒分离，并通过形态学观察、血清学检测和分子生物学检测对病毒进行鉴定。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：小白鼠脑组织、蚊子、乙脑病毒阳性血清、乙脑病毒阴性血清、乙脑病毒抗原、PCR试剂等。
2. 试剂：DMEM细胞培养液、胎牛血清、无菌水、抗生素、10% formalin、0.5%胰蛋白酶、兔抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-FITC、DNA提取试剂盒等。
四、实验方法1. 病毒分离与培养- 将小白鼠脑组织制成悬液，加入抗生素处理后进行离心。
- 将上清液接种于蚊细胞单层培养，37℃培养48小时。
- 收集蚊细胞培养上清液，重复上述步骤，直至出现典型的CPE（细胞病变效应）。
2. 病毒颗粒的形态学观察- 取CPE细胞培养上清液，用负染法进行电镜观察。
- 观察病毒颗粒的形态、大小和表面特征。
3. 血清学检测- 将病毒培养上清液与乙脑病毒阳性血清和阴性血清进行间接免疫荧光试验（IFA）。
- 观察荧光信号，判断病毒的存在。
4. 分子生物学检测- 提取病毒RNA，进行RT-PCR扩增乙脑病毒基因片段。
- 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带，判断病毒的存在。
五、实验结果1. 病毒分离与培养- 经过多次接种蚊细胞培养，成功分离出病毒，出现典型的CPE。
2. 病毒颗粒的形态学观察- 电镜下观察到病毒颗粒呈球形，直径约为30-50nm，表面有突起。
3. 血清学检测- 间接免疫荧光试验结果显示，病毒培养上清液与乙脑病毒阳性血清产生明显的荧光信号，而与阴性血清无反应。
流行性乙型脑炎
四、发病机制与病理解剖
（一）发病机制（pathogenesis）
人被带病毒的蚊虫叮咬病毒进入人体 单核-巨噬细 胞内繁殖 进入血流 病毒血症。病毒 若无侵入中枢神经系统则呈隐性感染或轻 型病例。仅在少数情况下，当机体防御功 能减弱，病毒 血脑屏障 中枢神 经系统而发生脑炎。
有报道注射百日咳菌苗后，或原有脑囊虫病或癫痫 等，可降低血脑屏障功能，促使乙脑发生。
3、惊厥或抽搐 发生率40%～60%，可由于 高热、脑实质炎症及脑水肿所致。多于病程 第2～5d，先见于面部、眼肌、口唇的小抽搐， 随后呈肢体阵挛性抽搐，可为单肢或双肢， 重者出现全身抽搐，强直性痉挛，历时数分 钟至数十分钟不等，可伴有意识障碍。频繁 抽搐可导致紫绀、甚至呼吸暂停。
惊厥或抽搐
是乙脑严重症状之一。由于脑部病变部位与程度不同，可 表现轻度的手、足、面部抽搐或惊厥，也可为全身性阵发 性抽搐或全身强直性痉挛，持续数分钟至数十分钟不等。
叮咬史。
(二)临床表现：包括起病急、高热、
头痛、呕吐、意识障碍、抽搐、病理反
射及脑膜刺激征阳性等。
七、诊 断
(三)实验室检查： 1.血象：WBC 10～20×109/L，N80%以 上，E减少。 2.CSF: 压力增高，外观无色透明或微 混，WBC多在50～500×106/L，个别可高达 1000×106/L以上，分类早期以N稍多，氯 化物正常，糖正常或偏高。少数病例病初 脑脊液检查正常。
抽搐，肌张力增强，脉搏慢，高热。Βιβλιοθήκη 3) 昏迷加重或烦躁不安。
4) 瞳孔忽大忽小，对光反射迟钝。
五、临床表现
外周性呼吸衰竭的原因
1）脊髓病变致呼吸肌麻痹
2）呼吸道痰阻、蛔虫阻塞喉部
3）并发肺部感染等
流感病毒的分离鉴定(二)
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对
照
0.5%鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
摇匀置室温60～90分钟
结果
++++ ++++ ++++ +++ ++ ++
▪ 目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。
▪ 原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠 等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待 检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象， 即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝 抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免 疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用， 借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。
(5)稀释完毕后加人体积分数为0．5％的压积鸡红 细胞悬液，每管0．2mL,室温放置30~60mn。
流感病毒血凝试验
试管号
12 3 4 5
67
8
9
10
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
边缘不整齐。
“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
流行性乙型脑炎病毒的分离和鉴定
流行性乙型脑炎病毒的分离和鉴定
根据乙型脑炎明显的季节性和地区性及其临床特征，例如高热和狂暴或 沉郁等神 经症状，流行期中不难作出诊断。但是必须与其它的病毒性、细菌性和中毒性脑炎相鉴别。 由于母猪可能发生流产，公猪可能发生睾丸炎，还需注意与布氏杆菌病、细小病毒病以及生 殖和呼吸道综合症等鉴别。为了确诊，必须进行病毒分离和血清学试验等特异性诊断。?
(1) 病毒的分离和鉴定：在动物发热初期，可采血液或血清分离病毒。动物死后， 应尽快(夏天不得超过2～3小时)采取脑组织分离病毒。各项操作以 及病料的运送，必须遵守“冷藏”和“快速”两个原则。根据作者等的经验，如将乳 鼠带到现场接种，可以明显提高病毒分离率。? 乳鼠是应用最多的实验动物，也是多年来实践证明比较有效的病毒分离动物。 应用脑内?皮下同时接种法或在脑内接种的同时，再较大量地作腹腔接种，例如0?2～0? 5ml，常可提高病毒分离率。乳鼠发病时，离群、拒食、抽筋、消瘦， 此时即可采脑作 进一步传代或鉴定。但需注意，发病乳鼠常被母鼠吃掉，故应及时将母鼠取走。也可将上述材料接种于7～9日龄的鸡胚卵黄囊内，2～3天后收获胚体，再作乳鼠接 种。 近年来常用仓鼠肾原代细胞分离乙脑病毒，即在已经长成单层的仓鼠肾细胞内 加入该培养瓶(管)原营养液量1/5～1/10的接种材料，吸附30～60分钟后，加入维持液， 继续置37℃，每天观察1次，共7天，如发现“＋＋”的细胞病变，即可收获，供传代或鉴 定用。仓鼠肾BHK?21细胞系也可被用于分离病毒，接种病料后观察1周后如无CPE出现,可作盲传。? 即使被检材料中含有病毒，但在初代接种小鼠或细胞培养物后，往往不见发病或 不出现细胞病变，这是野外毒株尚未适应实验动物或细胞培养物的缘故。 因此第1代接 种呈阴性结果时，应继续盲传2～3代，也就是经一定时间(7～10天) 而尚未发现动物发 病或细胞出现病变时，可按常法扑杀几个动物采脑，或选取几瓶细胞培养物作冻融处理， 再作下一代动物或细胞培养物的传代接种。? 欲由蚊体分离病毒时，用捕蚊管或捕蚊器捕蚊。最好先在室内饲养2～3天，待胃血 消化，抗体消失,这样可以提高病毒分离率。分离时用氯仿将蚊熏死，鉴定分类，并以 25、50或100只为1批，装入灭菌的小瓶或试管中。随后加入2～3ml25%酒精生理盐水， 充分摇洗5～10分钟，倒掉酒精液，再用灭菌生理盐水或Hanks液洗2～3次后，移入玻璃 研磨器内，加入1～2ml0?5%乳白蛋白水解物或其它稀释液，磨细后பைடு நூலகம்入离心管，以3 00 0r/min转的速度离心沉淀20分钟，吸取上清液，如上加入青、链霉素，置4℃感作1小时 后接种动物或细胞。细胞营养液内应加两性霉素，以免霉菌生长。 Hsu等在台湾南部 收集猪场的蚊，自1974年7月至1976年12月共捕蚊125 000只，分为1 650批，做成乳剂后 分别接种乳鼠和库蚊细胞培养物。在库蚊细胞培养物中分离到68株乙脑病毒，由乳 鼠脑分离到48株病毒，似乎说明库蚊细胞培养物比乳鼠更适于由蚊体分离乙脑病毒。?新分离病毒的初步鉴定按一般方法进行，请参阅本书第十四章。随后再用乙脑标准 毒株和标准免疫血清与新分离病毒进行交叉补体结合试验、交叉中和试验、交叉血凝抑 制试验。也可应用小鼠进行交叉保护试验，即用新分离毒株和标准乙脑毒株分别制备 福尔马林灭活疫苗，给3周龄小鼠皮下接种0?1～0?2ml，共2次，间隔7天， 另留部 分小鼠不免疫作为对照。于第2次注射后两周，用不同稀释度的标准乙脑毒株攻击：采用腹 腔攻击、脑内刺激法，即在腹腔注射病毒的同时，给每只小鼠脑内注射0?03ml 生理盐水或肉汤。观察3周，记录各组小鼠的死亡和保护数。如为同种病毒， 则其抵 抗标准乙脑毒株的攻击量可比对照组高100～1 000倍， 并与以标准乙脑毒株免疫的小鼠 组的保护率相近。? 检出病畜体内的病毒抗原，是快速诊断的需要，也是国内外正在探索和深入研究的 一个课题。作者等应用固相和液相补体结合试验、免疫粘附试验、反向间接血凝试验、 荧光抗体技术、免疫酶技术、?1?2?5I放射免疫测定以及反转录?多聚酶链RT?PCR反应 等方法检测乙脑感染小鼠和自 然感染病马脑内的病毒抗原，都有较高的特异性和检出率。
微生物检验技术(中级)-强化练习题(A1-A2型题 2)_1
微生物检验技术（中级）-强化练习题(A1/A2型题 2)1、有关病毒标本的采集和运送，错误的方法是A.发病早期或急性期采集标本B.发病晚期采集标本C.标本运送应放在带有冰块的保温箱中D.标本采集后应立即送实验室检查E.运输培养基中应含有抗生素2、以下试剂可加入保存标本冻存液中的是A.EDTA和二甲亚砜B.Versen溶液和甘油C.二甲亚砜和甘油D.SDS和甘油E.胰酶和二甲亚砜3、关于DMSO错误的描述是A.保存病毒标本的冻存液可加入DMSOB.是细胞低温保存的良好保护剂C.中文名二甲亚砜D.通常用含10%血清的DMSO作为悬浮细胞的保存液体E.可用于PCR反应4、不能用于人工增殖病毒的材料是A.鸡胚B.传代细胞C.原代细胞D.活体器官E.实验动物5、病毒的分离培养的意义A.是病毒学实验研究的基础B.可用于制备疫苗C.可开发特异性诊断试剂D.有助于疾病模型的复制E.以上都是6、空斑试验用于测定A.病毒的类型B.病毒的感染力C.病毒的增殖D.病毒的穿透能力E.病毒的黏附力7、细胞培养中使用的Versen又称为A.EDTA溶液B.5%碳酸氢钠C.生理盐水D.胰酶E.抗生素8、HAV是甲型肝炎的病原体，它可以感染的宿主是A.人类和猪马牛羊B.人类和袋鼠C.人类和非人类灵长类动物D.人类和家禽E.以上都可以9、病毒的形态学检查方法不包括A.EMB.ELISAC.光学显微镜D.超过滤法E.超速离心法10、鸡胚培养的注意事项不包括A.防止污染B.培养的温度和湿度C.孵育前要先擦洗鸡蛋外壳D.依据不同的病毒和目的来决定接种部位E.胚龄选择11、选择实验动物的首要条件是A.对病原的易感性B.动物健康C.动物大小D.性别E.动物品系12、检查鸡胚内病毒繁殖有直接和间接两种方法，以下不属于直接方法的是A.鸡胚死亡B.鸡胚特殊损害C.鸡胚生长迟缓D.绒毛尿囊膜形成痘疱E.血凝实验13、用鸡胚分离病毒，查不到直接感染指标的是A.痘病毒B.疱疹病毒C.流行性乙脑病毒D.流感病毒作羊膜腔、尿囊腔接种E.新城鸡瘟病毒14、对病毒最为敏感的细胞是A.原代细胞B.次代细胞C.二倍体细胞D.传代细胞E.肿瘤细胞15、最常见的组织培养方式是A.静止培养B.转管培养C.悬浮培养D.克隆培养E.混合培养16、关于二倍体细胞错误的描述是A.一般只能传30～50代B.来源于正常组织细胞C.有致肿瘤的作用D.要大量冻存10代以内的细胞，为以后传代备用E.可用于疫苗生产17、Alsever液常用于A.培养细胞B.冻存细胞C.制作红细胞悬液D.空斑试验E.中和试验18、红细胞在Alsever液中的保存期限A.4℃保存1天B.4℃保存1个月C.室温保存1个月D.4℃保存1年E.室温保存1年19、关于补体结合试验错误的是A.补体的某些组分对热很不稳定，采血后要尽快分离血清放低温保存B.为保证补体的稳定性，含补体的血清每次试验前要用冷水溶解C.补体可反复冻融D.稀释后的补体仅限当天使用E.试验中补体量过大会影响试验灵敏度20、病毒实验中用于浸泡和清洁玻璃器材的清洁浸泡液含有的化学成分是A.硫酸和重铬酸钾B.硫酸C.盐酸D.硝酸E.重铬酸钾21、配制清洁液的正确方法是A.将重铬酸钾放入自来水中，加热完全溶解冷却后慢慢加硫酸B.先加水，加硫酸再加重铬酸钾C.先加硫酸，加重铬酸钾再加水D.先加重铬酸钾，加硫酸再加水E.先加硫酸，加水再加重铬酸钾22、细胞培养液可分为细胞生长液和细胞维持液两种。
半数致死量的测定
Reed-Muench法物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。
中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。
中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。
如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。
中和反应不仅能定性而且能定量，故中和试验可应用于：1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。
2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。
动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。
3.分析病毒的抗原性。
毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。
用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。
(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。
但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。
而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。
TCID50和PFU的换算公式
1、PFU:plaque forming unit，空斑形成单位：感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。
由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。
因此建议也可使用TCID50法。
2、MOI :multiplicity of infection，感染复数：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。
其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。
噬菌体的数量单位为pfu。
一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。
后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。
能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。
传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。
其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。
其中：P 为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：P(0) = 1% = 0.01m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。
(一)原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。
但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。
对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。