T-SPOT TB 不含医院名称
T淋巴细胞斑点试验在结核病诊断中的临床应用
T淋巴细胞斑点试验在结核病诊断中的临床应用发表时间：2013-07-22T09:54:17.263Z 来源：《医药前沿》2013年第15期供稿作者：杨晓燕岳晨莉[导读] 近年来 T-SPOT.TB在肺结核诊断和疗效观察中的应用已取得了进展。
杨晓燕岳晨莉（武警陕西总队医院陕西西安 710054）【摘要】目的：评价结核酶联免疫斑点试验(T-SPOT.TB)快速诊断结核病的临床应用价值。
方法：对我院确诊或疑诊结核患者进行 T-SPOT.TB 检测，检测其诊断结核病的敏感性及特异性。
结果：在结核性疾病T-SPOT TB检测灵敏度为 90%(36/40) ,特异度为91.2% (31/34)。
肺结核组T-SPOT.TB检测灵敏度为92.8 %(26/ 28)，结核性胸膜炎组，检测灵敏度为83%（10/12)。
结论：T-Spot. TB 试验是检测诊断结核的快速敏感方法，在结核性疾病诊断中有重要价值。
【关键词】酶联免疫斑点试验结核病灵敏度特异度【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）15-0214-02 肺结核是危及人类健康的传染病之一，传统的结核菌素皮试及结核菌素纯蛋白衍生物作为结核感染诊断技术，其敏感性及特异性较差。
发展能用于诊断结核的快速敏感的实验室技术十分重要。
酶联免疫斑点 (enzyme linked immunospot assay, EL ISPOT)技术是一种新型的免疫酶技术，从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞。
由 EL ISPOT发展而来的结核感染 T细胞斑点试验技术 (T-SPOT.TB) ,使用结核分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells, PB-MC)，通过细胞因子 γ干扰素 ( IFN- γ)的分泌检测抗原特异性 T淋巴细胞的应答反应，从而判断结核感染状态，具有较高的敏感性和特异性[1-2]。
T-SPOT_TB操作说明电子版
结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）英文名称：T-SPOT.TB【包装规格】24人份/盒。
【预期用途】该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。
从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。
两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。
ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。
这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。
T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。
T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
【检验原理】外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。
记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。
这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。
与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。
抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。
分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。
标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。
通过洗涤去除任何未标记的抗体。
可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。
T-SPOT.TB阳性结果分析
T-SPOT.TB阳性结果分析T-SPOT.TB是IGRA（γ干扰素释放试验）的一种，主要用于MTB 感染的诊断，鉴于MTB感染包括潜伏性结核感染（LTBI）和活动性结核病（ATB），因此T-SPOT.TB在临床上的适应症即为这两种的辅助诊断。
目前临床上对于LTBI和ATB的关注度及处理方式有较大的不同，所以临床需要实验室提供其较明确的结果，在这种情况下，T-SPOT.TB（主要指T-SPOT.TB阳性结果）需要结合其他检查结果来达到临床需求。
目前T-SPOT.TB阳性结果可以从以下几个方面进行分析：1、患者存在结核中毒症状，影像学检查支持结核病诊断，临床排除其他疾病，考虑活动性结核病的诊断。
2、患者存在结核中毒症状，影像学等临床检查手段未发现结核病证据，临床排除其他疾病，考虑MTB感染状态，建议试验性抗结核治疗（既治疗，又诊断），观察疗效（临床症状），再做诊断。
3、患者不存在结核中毒症状，影像学显示病灶存在（钙化或陈旧性病灶），存在结核病史，考虑结核之前患过结核病，不代表目前为活动性结核。
4、患者不存在结核中毒症状，影像学等临床检查手段未发现结核病证据，考虑潜伏性结核感染。
根据发展为活动性结核病风险程度决定是否进行预防性抗结核治疗。
5、4种环境分枝杆菌的感染（海、堪萨斯、苏尔加、戈登分枝杆菌）也会造成T-SPOT.TB的阳性，上述四种情况仍未做出合理判断的可以考虑这中情况。
（我国未见大样本量的NTM病流行病学调查资料，但历年的结核病流行病学调查资料显示，NTM分离率1990年、2000年和2010年分别为4.9%，11.1%和22.9%）上述五种情况中，第1和第2种情况表明感染了MTB，且称活动状态，应积极治疗；第3和第4种情况提示体内有处于持留状态的MTB，两种情况较为稳定，需随访观察，高危人群，根据情况可以进行预防性治疗。
文章摘自《中华结核和呼吸杂志》2014年10月第37卷第10期。
T_SPOT_TB_痰涂片和TB_省略_NA平行检测在结核病中的诊断评价_王宗义
（Ｔ－ＳＰＯＴ．ＴＢ）；痰标 本 为 清 晨 的 深 咳 脓 性 痰， 置
于无菌容器内 送 检 （痰 涂 片 及 ＴＢ－ＤＮＡ）； 胸 腔 穿
刺液标本１０ｍｌ置于灭菌试管中送检 （ＴＢ－ＤＮＡ）。
１．３．２ 标本 检 测 Ｔ－ＳＰＯＴ．ＴＢ 检 测 试 剂 盒 由 上
海复星长征医学科学有限公司提供，严格按照说明
书操作；显色后用计算机辅助成像分析系统进行斑
点阅读与统计；结果判定按照试剂盒说明书的规定
进行：如果阴性孔 斑 点 数 为 ０～５ 个， 测 试 孔 斑 点
数 减 去 阴 性 孔 计 数 ≥６； 如 果 阴 性 孔 斑 点 数 ≥６， 测
试孔斑点数必须≥２ 倍 阴 性 孔 斑 点 数。痰 涂 片 检 测
近年来，一种诊断 ＭＴＢ 感 染 的 免 疫 学 新 方 法 ———干 扰 素－γ 释 放 试 验 （ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γｒｅｌｅａｓｅ ａｓ－ ｓａｙ，ＩＧＲＡ） 逐渐被推广并应用于临床。 目前应用 较为广泛 的 ＩＧＲＡ 包 括 应 用 ＥＬＩＳＡ 技 术 的 ＱＦＴ－ ＧＩＴ 试剂盒和应用 ＥＬＩＳＰＯＴ 技术的 Ｔ 细胞斑点试 验 （Ｔ－ＳＰＯＴ）－ＴＢ 试剂盒， 均 具 有 较 好 的 敏 感 度 和特异度 。 ［６］ 本 研 究 应 用 Ｔ－ＳＰＯＴ．ＴＢ、 痰 涂 片 和 ＴＢ－ＤＮＡ （ＰＣＲ）３种方 法 分 别 对 结 核 病 及 非 结 核 病患者进行平行检测，以此来评价这３种方法在结 核病诊断中的价值。现将结果报告如下。
中 国 预 防 医 学 杂 志 ２０１４ 年 ９ 月 第 １５ 卷 第 ５ 期 Ｃｈｉｎ Ｐｒｅｖ Ｍｅｄ，Ｓｅｐ．２０１４，Ｖｏｌ．１５ Ｎｏ．５
· ２４９ ·
·论 著·
Ｔ－ＳＰＯＴ．ＴＢ、痰涂片和 ＴＢ－ＤＮＡ 平行检测在 结核病中的诊断评价
结核感染T细胞检测T-SPOT简介与临床应用
结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）简介与临床应用汇报人：XXX 单位：XXX结核病T-SPOT 临床应用A B C 目录A 结核病1结核-定义◆肺结核（pulmonary tuberculosis）是结核分枝杆菌复合群（mycobacterium tubercuolsis complex,简称结核分枝杆菌或结核菌）引起的慢性肺部感染性疾病，占各器官结核病总数的80%-90%，其中痰中排菌者称为传染性肺结核病。
1结核-流行病学◆结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，WHO已将其列为重点控制的传染病之一。
据WHO估计全球有1/3人口已感染了结核杆菌，每年约有800万感染者发展为活动性结核病。
◆中国是世界上22个结核病高疫情国家之一，患者总数仅低于印度而居世界第二位。
2000年全国第四次结核病流行病学抽样调查结果为：活动性肺结核患病率为367/10万，菌阳及涂阳肺结核患病率各为160/10万及122/10万。
◆结核病可侵及全身各器官，其中肺结核为最常见类型，约占85%，菌阳，尤其涂阳肺结核患者是主要传染源，是防治的主要对象。
在肺外结核病中，淋巴结结核、结核性胸膜炎、骨关节结核、泌尿生殖系结核病较多见，此外，还有结核性脑膜炎、结核性心包炎、肝、脾结核、脑结核等。
◆结核病常因各种不同的相关症状而首诊于综合医院临床各科，据统计，80%以上肺结核患者首诊于综合医院。
在内科日常诊疗工作中，无论是长期发热、慢性咳嗽、咳痰、咯血、胸腹腔、心包腔积液及肺部异常阴影等的病因学诊断，结核病是常需注意鉴別的重要病种之一。
2001年7月我国卫生部公布了新的【结核病分类】(WS196-2001)，将结核病分为：◆原发性肺结核；◆血行播散性肺结核；◆继发性肺结核；◆结核性胸膜炎；◆其他肺外结核。
◆原发性肺结核乃是指初次感染结核分枝杆菌而发病者，包括原发综合征及胸内淋巴结结核。
血行播散性肺结核乃是由于机体免疫功能低下，变态反应性增高，肺内原发灶、胸内淋巴结或其他脏器病变内的大量结核分枝杆菌于短期内进入血液循环而引起肺部乃至全身播散性结核病，共包括急性、亚急性及慢性血行播散性肺结核。
T-SPOT介绍
内容
结核病基础概念 T-SPOT.TB 产品知识 T-SPOT.TB 临床应用 病例分享
11
T-SPOT®.TB原理
T-SPOT®.TB原理：结核感染者体内存在特异的效 应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原 （ESAT-6，CFP 10）刺激时会分泌多种细胞因子 （ IFN-γ ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结 核病或结核潜伏感染者的诊断
WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB
9
小结
活动性结核病与潜伏性结核感染的区别 LTBI危险因素 结核中有20%左右的肺外结核，诊断困难 传统结核诊断方法不能满足临床需要
T-SPOT®.TB
——结核感染T细胞检测 （免疫斑点法）
列入欧美等20多个国家结核诊疗指南
内容
结核病基础概念 T-SPOT.TB 产品知识 T-SPOT.TB 临床应用 病例分享
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2
ห้องสมุดไป่ตู้
内容
结核病基础概念 T-SPOT.TB 产品知识 T-SPOT.TB 临床应用 病例分享
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3
2000-2008年我国肺结核报告发病情况
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
• 快速简便
简单的血液检测，隔天报告结果
15
国外文献汇总——灵敏度
Reference Kobashi et al. J Infect. 2009; 58(3):197-204 Domínguez et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2009; 63(1):43-51 Bosshard et al. Respir Med. 2009; 103(1):30-4. Higuchi Med Microbiol Immunol. 2009; 198(1):33-7 Kim et al. Am J Med 2009 ;122(2):189-95 Nicol et al. Pediatrics. 2009; 123:38-43 Markova et al. Biotechnol. & Biotechnol. 2009;23(1): 1103-1108 Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56* Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71* Chee et al J Clin Microbiol. 2008; 46(6):1935-40 Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624* Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34* Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.* Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65* Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8 Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44. Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8* Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-703 Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8* Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-8 Losi et al Eur Respir J. 2007 Dec;30(6):1173-9 Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259 Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53 Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34* Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30* Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*
T-SPOT_TB操作说明电子版(中文版)
4．用PBS缓冲液200倍稀释浓缩标记抗体试剂。
4．不能用含有Tween或其它去污成分的PBS缓冲液，
这会导致高的本底结果。确保标记抗体工作液有少
量剩余（考虑到耗损）。因而，对于8孔板条（每孔
需要50ul），配制500ul标记抗体工作液，取2.5ul的
浓缩标记抗体试剂加497.5ul的PBS缓冲液
5．每个反应孔加入50ul标记抗体工作液，2-8℃孵 5．不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正
3.每吸取100ul细胞终溶液前都必须保证彻底混匀。 推荐每孔加样后都更换新的枪头以避免4个反应孔 出现交叉污染。 4. 为避免干扰，培养板应立即放入孵育箱。不要把 培养板堆叠，会导致温度的不均匀和空气的不流通。 不按照推荐的时间孵育会导致不正确的检测结果。
2.斑点记数
在培养板的洗涤和斑点形成阶段，不要让移液枪枪头或洗板仪枪头触碰反应孔底部的膜。移液枪枪头或洗板仪枪头产生的凹
注意：细胞培养液使用前需预温至 37℃
步骤 1.依照说明书的要求采集全血样本。室温保存 （18-25℃），不能冷冻或冷藏 2.对于使用CPT采血管的，根据厂家说明书要求来分 离PBMCs。 对于其它方法采集血样的，利用Ficoll-PaqueTMPlus 按照操作说明分离PBMCs
3.用吸液管吸取白色、云雾状PBMCs层并转移至15ml 尖底离心管中。加入细胞培养液至10ml。 4.600g离心7分钟。弃去上清液用1ml培养液重悬沉 淀。 5.加培养液至10ml，350g离心7分钟。 6.弃去上清液加0.7ml培养液重悬沉淀。
痕会导致斑点假象，影响斑点记数。
步骤
注意点
1．从培养箱中取出培养板弃去细胞培养液。
1．此时从试剂盒取出底物显色溶液恢复至室温。
结核抗体三项的标准
结核抗体三项的标准
结核抗体三项是指结核杆菌抗体（TB抗体），结核分枝杆菌
抗体（MTB抗体）和结核菌素结合试验（T-SPOT.TB）三个
指标的检测。
不同的标准可能会有所差异，以下是一般常用的标准：
1. 结核杆菌抗体（TB抗体）：
- 阳性：典型肺结核病例的IgG抗体滴度≥1:100。
- 阴性：IgG抗体滴度<1:100。
2. 结核分枝杆菌抗体（MTB抗体）：
- 阳性：MTB抗体滴度≥1:20。
- 阴性：MTB抗体滴度<1:20。
3. 结核菌素结合试验（T-SPOT.TB）：
- 阳性：大于切割值（一般为6-8个纤维）的T-细胞反应。
- 阴性：小于切割值的T-细胞反应。
需要注意的是，这些标准仅供参考，具体的标准可能会有所差异，还需要根据具体的实验室和医生的建议进行解读和判断。
实际诊断和判断结核病还需综合考虑患者的临床症状、病史、病灶影像学表现等综合因素。
因此，如果有疑似结核病的症状，应及时就医并咨询专业医生的建议。
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)简介与临床应用
结核菌的特性和临床检测的现状 又是如何？
1、结核病疫情严重
全球 • 20亿人口感染结核 • 现有活动性结核病患者2000万 • 新增活动性结核病人约900万/年 • 每年200-300万患者死亡
我国
结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印 度，居全球第二位
• 约5.5亿人口感染过结核菌 • 现有活动性肺结核患者450万 • 新发患者145万/年 • 死亡人数13万/年
- 胸部的 X-光或 CT 扫 描显示异常
- 肺外结核难以诊断 (特别是儿童)
活动性结核
• 新发TB病例来自潜伏性结核感 染人群
• 潜伏性结核感染（latent TB Infection, LTBI）人群数量巨 大——“定时炸弹”
全面性
目前检测方法是否满足临床需求？
• 细菌学 • 免疫学
灵敏度 性能不稳定
结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）简介 与临床应用
什么是结核病
• 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染 病。结核菌能侵入全身各个器官，但80% 发生在肺部，常称肺结核。
• 结核病又称为“痨病”和“白色瘟疫”， 是一种古老的传染病。
• 人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要 方式。传染源是接触排菌的肺结核患者， 而肺外结核病则不具有传染性。
暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除
- 没有症状,结核杆菌仍旧 存在而不能被侦测
- X-光/ CT 扫描显示正常
- 没有抗体应答
- 诊断困难
- 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）
机体被感染
受机体免疫力抑制 没有临床症状
终身处于感染状态
潜伏感染
5%
5%
再次激活
有临床症状 具有传染性
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）临床研究进展
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）临床研究进展2.保山市人民医院感染科云南保山 678000摘要：结核感染T细胞斑点实验作为临床上日益普遍的肺结核诊断方法，具有检测结果不受患者临床症状干扰，能排除接种卡介苗引发的假阳性结果，检测标本易于获得，操作简便、灵敏度高等优点，临床价值得到肯定；但是作为单纯的检测方法还存在不能确定结核发病阶段、发病部位及假阳性等问题，需要与其他检测方法联合应用才能提高检测效果；进一步运用该检测方法诊断结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、非典型肺结核等结核相关疾病，提升疾病诊断的准确性。
关键词：肺结核；结核感染T细胞斑点试验；临床研究肺结核是一种肺部常见慢性传染性疾病，主要致病因素是结核分枝杆菌，我国在党和政府的领导下对结核病的防治取得了巨大成效，但近年来结核病防治形势不容乐观。
目前我国作为世界上30个结核病高负担国家之一，2019年新发结核病例83.3万人，结核病发病率为58/10万。
带菌患者为其重要的传染源，大多数肺结核患者病程呈慢性过程，主要表现有低热、盗汗、消瘦、乏力等全身症状及咳嗽、咯血等呼吸系统表现。
1.T-SPOT.TB的概念在疾病早期尽早尽快确诊对疾病治疗具有关键指导意义。
针对早期快速诊断，结核感染T细胞斑点试验，又叫作结核感染干扰素释放试验，该检查方法的机理在于：结核分枝杆菌入侵人体后，T淋巴细胞会相应地留下印记，然后分离出T淋巴细胞，再进行培养增殖，同时通过特异抗原对其进行作用，使其分泌γ干扰素，再经过免疫染色后，进行斑点计数，计算干扰素的量，推算抗原特异性细胞的频率,判断是否存在结核感染。
该检测方法的标本需要采集患者的静脉血，因此摆脱了传统痰涂片、痰培养法受痰标本质量影响的弊端，并且不受机体免疫力及卡介苗接种的影响。
此法得到国内外专家的普遍认同，可以辅助早期诊断。
2.传统检测方法的不足目前肺结核主要通过症状体征，借助辅助检查，综合考虑为诊断提供依据。
结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血
结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血沉（ESR）测定对肺结核患者诊断的价值研究发布时间：2022-12-19T07:39:21.433Z 来源：《健康世界》2022年21期作者：鲁成娇1 杨艳1 鲁成志2 李彦娴1 彭晓云2 肖明英2 [导读] 目的：分析比较结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血沉（ESR）测定对肺结核患者的临床诊断价值鲁成娇1 杨艳1 鲁成志2 李彦娴1 彭晓云2 肖明英21.保山中医药高等专科学校临床医学院云南保山 6780002.保山市人民医院感染科云南保山 678000摘要：目的：分析比较结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血沉（ESR）测定对肺结核患者的临床诊断价值。
方法：回顾性分析2019年1月-12月期间在保山市人民医院分院感染科收治的结核病患者临床资料，比较痰涂片检测肺结核患者对应四种检查方法的诊断效能。
结果：肺结核患者痰涂片检测与结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌IgG、IgM检测、结核DNA核酸测定、血沉（ESR）测定的灵敏度分别为92.6%（25/27）、63.3%（19/30）、68.9%（20/29）、81.6%（31/38），特异度分别为：22.9%（14/61）、73.6%（39/53）、73.4%（47/64）、36.5%（27/74）。
结论：结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）灵敏度明显高于其他检测方法，配合该病临床表现能够提升临床应用价值，该方法可用于肺结核诊断的重要辅助手段。
关键词：结核感染T细胞斑点实验（T-SPOT.TB）；结核分枝杆菌IgG、IgM检测；结核DNA核酸测定；血沉（ESR）；痰涂片抗酸染色技术；肺结核结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，曾在世界范围内广泛传播，被称作“白色瘟疫”，我国是人口大国，结核病发病率高居世界前列。
T-SPOT_TB操作说明电子版(中文版)
散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。这使得 ELISPOT 检测更加的灵敏，超过传统的 ELISA 实验。T-SPOT.TB
被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应 T 细胞。T-SPOT.TB 记数每个活化的结核特异效应 T 细胞。
【检验原理】
外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。记数 PBMCs，保证有标准的细胞数量
步骤 1.从包装袋中取出培养板条，嵌入培养板架内恢复 至室温。
2.每个样本需要用到4个检测孔： （1）加入50ul细胞培养液至每个空白对照孔内； （2）加入50ul抗原A溶液至每个必要的检测孔内； （3）加入50ul抗原B溶液至每个必要的检测孔内； （4）加入50ul阳性质控至每个细胞功能控制孔内。 3.每个患者样本使用4个检测孔，每个检测孔加入 100ul细胞终溶液（含有25万个活细胞）
育1小时
确。
6．弃去标记抗体工作液，按上述的步骤2和3洗涤。
7.每个反应孔加入50ul底物显色溶液室温孵育7分 7. 不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正
钟。
确。
8.用蒸馏水或去离子水彻底洗涤培养板终止反应。
9.在通风处或37℃温箱干燥培养板
9.斑点会因为干燥而变的清晰。可以37℃温箱干燥4
小时或室温过夜。
(4) 阳性质控
2 瓶 0.8ml/瓶 主要成分为植物血凝素 PHA，牛血清白蛋白和抑菌剂
(5) 浓缩标记抗体
1 管 50ul/管 含有碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人 γ-干扰素单抗
(6) 显色底物溶液
1 瓶 25ml/瓶 含 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氯化硝基四氮唑蓝（NBT）
(7) CD 光盘
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)在结核性疾病中的诊断意义
结核感染 T 细胞检测 (T-SPOT.TB) 在结核性疾病中的诊断意义
朱晓颖
天津市海河医院结核科 天津 津南 300000
【摘要】目的：探讨结核感染 T 细胞检测 (T-SPOT.TB) 在诊断结核性疾病中的应用价值。方法：选取我院 2015 年 1-6 月收治的 60 例结核病患者作为观察组， 另外选取 30 例健康筛查者作为对照组，分别对上述病例进行痰涂片、结核抗体检测、结核菌素试验和结核感染 T 细胞检测 (T-SPOT.TB)，分析比较不同方法的检测结果。 结果：60 例结核病患者中，有 52 例患者经 T-SPOT.TB 呈阳性，敏感性为 86.67%，经 TST 检测，43 例患者呈阳性，敏感性为 71.67%，两者的敏感性比较，差异具有 统计学意义（P<0.05）；对照组的 30 例中，1 例经 T-SPOT.TB 呈阴性，特异性为 96.67%，经 TST 检测，特异性为 80.00%，两者之间差异具有统计学意义（P<0.05）. 结核感染 T 细胞检测 (T-SPOT.TB) 诊断阳性率明显高于痰涂片法和结核抗体法，且组间差异具有统计学意义（P<0.05）；经痰涂片镜检阳性标本中 T-SPOT.TB 的阳性 率为 90.00%，阴性标本的阳性率为 85.00%，两者检测结果无明显差异（P>0.05）。结论：结核感染 T 细胞检测能快速准确诊断结核性疾病，在临床诊断中具有重要意义。
60 例结核病患者作为研究对象，另外选取 30 例健康筛查者作为对照组，探讨结
核感染 T 细胞检测试验（T-SPOT.TB）在诊断结核性疾病中的应用价值，现报道 如下。
1．资料与方法
1.1 临床资料：选取我院收治的 60 例结核病患者作为研究对象，其中继发 性肺结核患者 25 例、血行播散性肺结核患者 3 例、结核性胸膜炎患者 20 例、结
QB—SPOT结核实验
QB—SPOT结核实验
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是一种运用IGRA技术，检测被结核分枝杆菌特异的早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP 10）分别刺激后释放γ-干扰素的效应T淋巴细胞，以辅助诊断结核感染的实验室检测技术。
TBspot试验通常指T-SPOT试验，即结核杆菌感染T细胞斑点试验，又称为结核菌感染干扰素释放试验，是利用结核特异性抗原，通过酶联免疫斑点技术，检测受试者体内是否存在结核效应的T淋巴细胞，从而判断被检查者是否感染结核杆菌。
该检查的原理是结核杆菌感染之后，T淋巴细胞会形成免疫记忆。
通常在体外分离到T淋巴细胞之后，培养增殖T细胞的同时，用相应的特异性抗原，进行刺激，激活T细胞记忆，有记忆的细胞则会分泌大量的干扰素。
结核T-SPOT检查即为结核菌T细胞斑点检测，是临床用于诊断结核病的新型检查方法。
通过检测干扰素的量，判断该细胞是否存在结核感染形成的记忆，进而通过进一步的反应判断是否存在结核菌感染。
但它的结果不能作为单独或决定性诊断活动性结核的证据，阳性结果仅提示患者体内存在结核杆菌特异性的效应T细胞。
但是否为活动性结核，则需要结合患者的临床症状及其他检测指标，进行综合判断。
现在已经有多项研究的结果显示，T-SPOT试验只能判断是否感染过结核，但无法鉴别活动性结核与潜伏性结核，因此对于活动性结核的诊断价值有限。
γ-干扰素释放试验(T-SPOT.TB)及结核蛋白芯片检测对结核病诊断价值
１ ５ ． ７ ７ １ ，Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） 。涂 阴组 Ｔ—Ｓ Ｐ Ｏ Ｔ ． Ｔ Ｂ敏感性 为 ８ １ ． ７ ％（ １ ５ ６ ／ １ ９ １ ） ，结 核蛋 白芯片敏感 性 为 ６ ０ ． ７ ％（ １ １ ６ ／ １ ９ １ ） ，两
・论
著 ・
＾ ｙ 一 干扰 素释放试验 （ Ｔ—Ｓ Ｐ Ｏ Ｔ ． Ｔ Ｂ ） 及 结核蛋 白芯 片检测对 结核病诊断价值 的对 比分析
李玉静 ，孙志平 ，张彦坤 ，邢志伟 ，张殉，翟倩 ，李曼，王亮 河 北省 胸科 医院 ，石 家庄 ０ ５ ０ ０ ４ １
结核感染T细胞(T-SPOT.TB)
结核感染T细胞（T-SPOT.TB）一、名称结核感染T细胞（T-SPOT.TB）二、项目简介、临床意义及收费标准T-SPOT.TB是一种记数单个结核特异的效应T细胞的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法，其灵敏高于ELISA方法。
该检测通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。
该检测适用于所有具有结核潜伏感染风险或怀疑是结核病的人群，无论年龄、性别、种族、治疗还是免疫状况，其诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
收费标准：740元/人份，收费依据：混合淋巴细胞培养（W0309050020）（250元）×2次；干扰素测定（W0309060008）（120元）×2种抗原。
三、标本采取1.静脉血：肝素锂（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。
采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。
2.脑脊液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混匀。
3.浆膜腔积液（胸水、腹水、心包积液）：无菌密闭容器留取50ml以上，每100毫升加2500IU（0.4ml）抗凝并立即混匀。
4.关节液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混匀。
四、检测时间、报告时间检测时间：每周二（节假日除外）进行检测，标本必须在上午9点前送达实验室。
报告时间：周三出报告。
五、注意事项1.标本采集后4小时内必须送到实验室进行检测，标本采集后如果超过4小时未送检将严重影响检测结果。
2.检测脑脊液、浆膜腔积液、关节液，须同时送检静脉血。
3.冬季运送标本时注意保温，避免冷冻。
六、联系科室和电话检验科微生物室(TeL：84205491)。
T-SPOT.TB在结核病诊断中的临床意义
T-SPOT.TB在结核病诊断中的临床意义发表时间：2017-11-23T15:18:27.053Z 来源：《中国误诊学杂志》2017年第16期作者：迟维维姚国忠陈林桂许萍[导读] 分析γ-干扰素其自身释放的T细胞斑点去进行试验（T-SPOT.TB）在结核病诊断中存在的意义。
1.武警上海总队医院呼吸内科；2.武警上海总队医院呼吸内科；3.武警上海总队医院呼吸内科摘要：目的：分析γ-干扰素其自身释放的T细胞斑点去进行试验（T-SPOT.TB）在结核病诊断中存在的意义。
方法：本文主要选择在2015年1月到12月之间在我院进行住院治疗的肺结核病人共30例，结核性的胸膜炎为30例，结核性的脑膜炎为9例完成T-SPOT.TB相关的检测，同时分别对于他们的血清还有胸腔积液以及脑脊液给予腺苷脱氨酶（ADA）的检测，在医院工作人员的进行身体检查的时候，使用T-SPOT.TB进行检测并且对他们的血清进行ADA检测。
结果：结核病患者30例，T-SPOT.TB阳性30例，ADA阳性25例，结核性胸膜炎30例，T-SPOT.TB阳性30例，ADA阳性27例，结核性9例脑膜炎，SPOT.TB阳性9例，ADA阳性5例。
一家医院共有420名身体检查人员，做T-SPOT检测共291人，阳性54人，阳性率为18.6％，阴性237人，经调查后发现，54人有三人人有结核病治疗，已治愈。
其他51人无症状（如：下午发热，盗汗等），无迹象（如：胸部X线损伤，包括钙化，无胸腔积液）。
结论：T-SPOT.TB是检测结核病感染最准确的方法之一。
灵敏度非常高。
所有结核病患者均为阳性，未感染结核病的患者一般均为阳性，可见：T-SPOT.TB阳性对结核病的诊断有很强的作用，可是其自身有着一定的假阳性，并通过ADA阳性诊断结核病有一定的假阴性，两者结合，可以显着提高阳性率和特异性但T-SPOT.TB检测阴性，基本可排除结核病（HIV病人除外），其对于结核病的排除有着非常主要的意义。
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2006年-韩国上市许可
2008年-美国FDA的PMA认证
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2010年-中国、新加坡和俄罗斯的产品注册
检测过程
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采集样本（外周抗凝全血） 密度梯度离心分离外周血 单个核细胞（PBMCs）
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洗涤PBMCs
检测过程
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把PBMCs与结核特 异抗原一同加入到 预包被抗γ-干扰素 抗体的培养孔中
科室特点
• 消化科
——腹水待查
——肠结核的鉴别诊断
——发热待查 ——生物制剂治疗前结核筛查
科室特点
• 呼吸/传染/感染科
——呼吸系统疾病与结核鉴别诊断
——胸水/心包积液鉴别诊断——肺外结核辅助诊断
——发热待查
科室特点
• 风湿免疫科
——生物制剂/免疫抑制/激素等药物的使用——结核筛查
——肺结核与肺间质病的鉴别诊断
机体被感染
- 没有症状,结核杆菌仍旧 存在而不能被侦测
5%
- X-光/ CT 扫描显示正常
- 没有抗体应答 - 诊断困难 - 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）
受机体免疫力抑制 没有临床症状
5%
再次激活
有临床症状 具有传染性
- 结核杆菌可以通过涂片、 培养检测出 - 胸部的 X-光或 CT 扫 描显示异常 - 肺外结核难以诊断 (特别是儿童)
18 49 40 95 47 18 11 195
0 5 1 1 0 0 0 7
0.0% 10.2% 2.5% 1.1% 0.0% 0.0% 0.0% 3.6%
100.0% 89.8% 97.5% 98.9% 100.0% 100.0% 100.0% 96.4% 11 196 0 57 0.0% 29.1% 100.0% 70.9% 50 40 95 8 17 32 16.0% 42.5% 33.7% 84.0% 57.5% 66.3%
酶联免疫斑点技术（ELISPOT）
• • 1983年，在南北两个半球地理位置相距遥远的 两个研究小组几乎同时、独立地创立了这项技 术。 一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth， 牵头人是当时正在当地Margaret 女王医院儿 童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。 另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡 Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物 系的学者Cecil C. Czerkinsky （CzerkinskyCC et. al., 1983a）。
结核感染T细胞斑点检测试剂盒 （免疫斑点法）
上海复星
一、背景
Oxford Immunotec 公司简介
• • 公司成立于2003年，依托牛 津大学科研技术开发新产品 基于T细胞检测的技术平台最 先获得认可 产品：T-SPOT®.TB
在欧洲、美国、加拿大和其它地 区正式上市
Above: UK headquarters Abingdon, Oxon Below: US headquarters, Marlborough, MA
2、结核菌素皮试——PPD
• PPD的临床意义——阴性结果： 1、表示未受结核菌感染 2、某些情况下不排除已受结核菌感染, 使用免疫抑制剂 等;免疫功能低下如重症结核病,慢性消耗性疾病,肿 瘤,艾滋病,高龄等。 3、阴性也不表示没有结核感染.值得注意的是假阴性情况 ,在临床上有感染结核的确切依据而患者PPD试验却阴 性,这种情况常见于以下疾病：初次感染结核菌4～8 周以内,重度营养不良,恶性肿瘤,机体免疫缺陷性疾 病（先天性免疫缺陷症,艾滋病）,免疫抑制剂使用者 等,个别老年人因机体变态反应功能低下也常呈阴性 反应。
结核菌素皮试——PPD
• PPD的临床意义——阳性结果：
1.一般阳性和中度阳性： • 结核病现症患者； • 已受结核菌感染但并不意味着发病或患病； • 卡介苗接种所致变态反应； 2.强阳性： • 结核病患者； • 感染结核菌未发病者.强阳性人群结核病的发病 率高,在未找到病变时可作预防性治疗。
T-SPOT.TB 与皮试的比较
指南解读（二）
• TST和IGRA两者均可
• 美国、法国、澳大利亚、日本等 • 卡介苗(BCG)接种人群首选IGRA（美国）
指南解读（三）
• 两步法：先用TST，再用IGRA以提高灵敏 度与特异性 • 加拿大、西班牙、荷兰、韩国、澳大利亚 等
• 主要适用于接触追踪
2、应用方向
1）结核病辅助诊断/疗效评价 • “菌阴”结核病患者的辅助诊断 • 肺外结核的鉴别诊断 • 抗痨治疗的疗效评价 2）免疫力低下/受抑制患者的结核诊断/感染筛查 • 使用生物制剂/免疫抑制剂患者的结核感染筛查 • HIV感染者/肾透析患者/器官移植患者 3）儿童结核病的辅助诊断 4）结核密切接触者/高危人群的结核感染筛查 • 结核病患者的家属/医务工作者/监狱囚犯 5）接触追踪
Adams et al Scand J Infect Dis. 2008;40(3):196-203. Bocchino et al Eur J Clin Mircro Infect Dis (2008) May 10* Detjen et al Clin Infect Dis 2007 Aug 1;45(3):322-8* Barsegian et al J Hosp Inf (2008) epub ahead of print Clark et al Clin & Exp Immunol 2007 Nov;150(2):238-44 Dheda et al AIDS 2005 19;2038-41 Meier et al EJCMID 2005 24;529-536 SUBTOTAL (T-SPOT vs. TST head:head studies only)
•
37℃二氧化碳孵育 16-20小时
检测过程
• • •
洗涤培养孔 加标记二抗 孵育1小时
检测过程
•
• •
洗涤培养孔
加显色液 用蒸馏水终 止反应
检测过程
1个斑点=1个效应T细胞
空白对照
实 际 效 果 图
阴性结果
抗原 A ESAT-6 抗原 B CFP10
阳性对照 （PHA）
阳性结果
四、比较
结核病的常规诊断方法
杆菌感染的受试者会出现一定的假阳性结果，对于使用激素或免
疫抑制剂的受试者会出现一定的假阴性结果
1、方法学比较——细菌学
• 细菌学检测
——涂片、培养结核病诊断的“金标准” 涂片：快速，简便，特异性较好，灵敏度差 培养：耗时长，特异性高，灵敏度稍高于涂片 ——美国FDA临床数据 ——国内临床数据 ——国内外文献
例：研究数据
Liebeschuetz et al Lancet. 2004
• 293例怀疑结核病的非洲儿童 • 平均年龄3岁，约46% HIV抗体阳性，多数 合并营养不良 • 57例确诊结核病的儿童中，ELISPOT阳性率 81%；TST阳性率35% • 年龄、 HIV感染状态和营养不良的严重程 度对ELISPOT结果无影响，但均能导致TST 结果的显著差异
对于“涂阴”结核病患者有很高的检出率（94.2%） 对于肺外结核病患者有很高的检出率（90.3%） 对于结核潜伏感染的检测，不受卡介苗（BCG） 接种影响，比PPD检测更准确 不能够提示临床患者的病变部位 不能够根据斑点数量的多少来判断受试者是活动性 结核病患者或是潜伏感染者 对于结核/癌症患者的鉴别诊断，须结合临床症状 进行判断
• •
酶联免疫斑点技术（ELISPOT）
结核杆菌特异抗原
ESAT-6与CFP 10抗原
•
由结核杆菌基因组 RD1区相同的操纵子 编码的蛋白 所有的卡介苗 （BCG）均丢失该 基因序列 绝大多数的环境分枝 杆菌也不存在RD1区
•
•
•
采用γ-干扰素释放实验原理，依靠结核特异
抗原保证效应T淋巴细胞的特异性 • 结合酶联免疫斑点技术的特性，提高检测灵敏 度
酶联免疫斑点技术（ELISPOT）
• 近二十多年来，随着抗体制备、PVDF膜材料等 技术改良，ELISPOT 分析技术已经是当世公认 的最灵敏的抗原特定T细胞的体外检测技术 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能 够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，灵 敏度高。 其技术原理，可一句话概括为：用抗体捕获培 养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显 色方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
•
试剂盒研制临床背景
结核病——全球关注的问题 全球
• • • • 20亿人口感染结核 新增活动性结核病人约900万/年 每年130万患者死亡
中国
450万活动性结核病人
•
•
新增活动性结核病人约145万/年
死亡人数约13万/年
活动性结核与潜伏感染
接触活动性结核病患者 暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除
方法学比较——TST Vs T-SPOT.TB
T-SPOT.TB test TST
Studies of IGRA Specificity in Subjects in Low Endemicity Settings
Subjects
Number Positive "Specificity" Number Positive "Specificity" Subjects positives Rate % positives Rate %
（1）细菌学检查 是结核病诊断的金标准，但涂片阳性率低，培养又耗费时日
（2）分子生物学检查
虽然快速、灵敏，但操作烦琐、技术要求高 （3）结核抗体诊断 诊断价值有限，但其简便、快速，可以作为结核病的辅助诊断方 法之一 （4）PPD（TST）实验 传统的结核感染检测方法，对于接种过卡介苗(BCG)或环境分枝