变异链球菌总蛋白质提取方法的比较研究

变异链球菌总蛋白质提取方法的比较研究田晓蓓1，何永红1，孔祥丽1，温艳丽2，万呼春2*1、四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，成都 （610041）2、四川大学华西口腔医学院，成都 （610041）E-mail：whcwcums@摘要：目的建立稳定、有效、简便的提取变异链球菌总蛋白质的方法。

方法收集的变异链球菌分别采用超声、热裂解超声、反复冻溶超声与玻璃珠辅助反复冻溶超声四种方法破碎细菌，用两种裂解缓冲液溶解细菌蛋白质，通过观察细菌破碎程度、测定提取蛋白质浓度及蛋白质单向电泳图谱分析比较各提取方法的效果。

结果四种方法都可以有效裂解细菌，其中起主要作用的是超声，裂解液Ⅱ（30mM Tris-Hcl，7M脲，2M硫脲，4％CHAPS，5mM PMSF，pH 8.0）溶解蛋白质的能力强于裂解液Ⅰ（50mM Tris-Hcl, 0.3％SDS, 0.3％DTT，pH 8.0），提取蛋白经丙酮沉淀后仍能重新溶于与双向电泳中一维等电聚焦所用上样缓冲液成分基本一致的裂解液Ⅲ（15mM Tris-Hcl，7M脲，2M硫脲，1﹪DTT，4﹪CHAPS，pH 8.0）中，蛋白质单向电泳图谱显示四种方法提取的蛋白质的条带分布基本相同。

结论以裂解液Ⅱ作为裂解缓冲液，采用反复冻融超声的方法可以有效地提取变链菌总蛋白质，具有较好的稳定性和重复性，且操作简单。

关键词：变异链球菌，蛋白质组，超声中图分类号：R780.2蛋白质组学是从探讨个体总蛋白质变化入手，研究环境因素变化对个体生命活动的影响。

变异链球菌（简称变链菌）是口腔龋病的重要病原菌之一，在口腔疾病防治研究中，变链菌蛋白质组研究逐渐成为一个新的热点。

对变链菌总蛋白质进行有效提取，是开展变链菌蛋白质组研究的基础。

国外有文献分别报道了几种变链菌蛋白质的提取方法[1-9]，但未见对这些提取方法进行比较研究的报道。

本文在参考国内外文献基础上，对几种变链菌总蛋白质的提取方法进行系统的比较研究，期望建立一种有效、稳定、简单的提取方法，为进一步开展变链菌蛋白质组研究奠定基础。

1. 材料和方法1.1 实验菌株变异链球菌（S. mutans ）ATCC 25175，由口腔医学国家重点实验室提供。

1.2 主要试剂裂解液Ⅰ（50mM Tris-Hcl, 0.3％SDS, 0.3％DTT，pH 8.0）；裂解液Ⅱ（30mM Tris-Hcl，7M脲，2M硫脲，4％CHAPS，5mM PMSF，pH 8.0）；裂解液Ⅲ（15mM Tris-Hcl，7M脲，2M硫脲，1﹪DTT，4﹪CHAPS，pH 8.0）；BCA试剂盒（PIERCE）；玻璃珠（Φ425～600um,sigma）；实验用水均为超纯水。

1.3 主要仪器超声破碎仪（SANYO，日本）；垂直电泳系统（BIO-RAD，美国）；凝胶成像分析系统（BIO-RAD 2000，美国），纯水仪（MILLPORE，美国）1.4 实验方法1.4.1 细菌培养和收集将变链菌接种于TPY平板，培养后挑取单菌落接种于300ml TPY液体培养基，培养20h 后离心收集细菌，洗涤两次后重悬于30ml含氯霉素（100µg/ml）生理盐水中，室温放置10min～15min，混匀等分为30份，离心，细菌沉淀保存于-20℃，备用。

1.4.2 细菌裂解1.4.2.1方法1（超声）将保存的细菌沉淀于37℃水浴30min，加入1ml裂解液Ⅰ，超声(11KHZ，10S×84次循环，间隔1min，冰浴)，振荡(5×30S，间隔1分钟，冰浴)，取10µl混悬液涂片进行革兰氏染色。

剩余混悬液离心（4℃，16060g，10min），收集上清液，其中300µl上清夜进行SDS-PAGE 电泳，另200µl和400µl上清液分别加入4倍体积预冷丙酮沉淀蛋白质，真空冻干为蛋白质粉末保存于-20℃，备用。

同时处理3份平行样本。

1.4.2.2方法2（热裂解超声）将保存的细菌沉淀于37℃水浴中30min，100℃沸水浴15min，加入1ml裂解液Ⅰ，其余同方法1。

1.4.2.3方法3（反复冻溶超声）将保存的细菌沉淀反复冻溶3次（20℃ 5min，-20℃ 30imn），加入1ml裂解液Ⅱ，其余同方法1。

1.4.2.4方法4（玻璃珠辅助反复冻溶超声）将保存的细菌沉淀反复冻溶3次（同方法3），加入1ml裂解液Ⅱ和0.5ml玻璃珠，超声(11KHZ，10S×24次循环，间隔1min，冰浴)，振荡（同方法1），取10µl混悬液涂片进行革兰氏染色。

剩余混悬液转移到新的离心管中，用0.5ml裂解液Ⅱ洗涤玻璃珠两次，合并洗涤液，离心收集上清液，其中600µl进行SDS-PAGE 电泳，另400µl和800µl分别进行丙酮沉淀，真空冻干为蛋白质粉末保存于-20℃，备用。

同时处理3份平行样本。

1.4.3 细菌裂解程度观察用100×油镜观察革兰氏染色涂片并采集图像。

1.4.4 蛋白质浓度测定用1ml去离子水溶解制备的蛋白质粉末，用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，测定时每种蛋白质粉末3个平行样本，每个样本3个平行测定孔。

同时制作标准曲线及样本加标回收，标准曲线蛋白质浓度范围为0mg/ml～2mg/ml。

1.4.5 蛋白质单向电泳按《蛋白质技术手册》[10]制备SDS-PAGE，浓缩胶为5％，分离胶为10％。

取一定体积的蛋白质提取液，加入等体积2倍上样缓冲液，沸水浴5min。

将制备好的电泳样本注入SDS-PAGE加样孔中，浓缩胶80V电泳30min，分离胶120V电泳90min停止。

考马斯亮蓝R-250染色，脱色至背景清晰。

3个平行细菌样本用相同裂解方法提取蛋白质制备成电泳样本，每个电泳样本复3孔，重复电泳及染色3次。

凝胶成像分析系统观察并采集图象。

2. 结果2.1细菌破碎程度分析未经裂解处理的变链菌为革兰染色阳性球菌，呈长链状排列，见图1。

经方法1处理后细菌呈分散状态，在染色阳性菌体周围出现染色阴性的菌体碎片，见图2，方法2和方法3处理与方法1无明显差异。

方法4处理后细菌破碎程度明显低于前三种方法，同时发现仅在方法4处理过程中出现黑色颗粒状物质。

图1.未经裂解处理的变链菌图2. 经方法1处理后的变链菌2.2 提取蛋白质的浓度分析蛋白质标准曲线为y=0.105+0.830x，相关系数为0.995，样本加标回收率为86.734％。

蛋白质粉末在去离子水中的溶解性不佳，溶液中明显存在未溶解的蛋白质颗粒。

四种方法的蛋白质浓度见表1，方法4的蛋白质浓度测定时超出标准曲线上限，方法3的蛋白质浓度比其它两种方法高近30倍。

表1. 四种方法提取的蛋白质浓度————————————————————————————方法1 方法2 方法3 方法4————————————————————————————蛋白质浓度（mg/ml） 0.0657 0.068 1.5793 ＞2————————————————————————————2.3蛋白质单向电泳图谱分析图3为三个平行细菌样本分别用方法3提取的细菌总蛋白质的电泳图谱，图谱显示蛋白质经电泳分离后出现高、中、低分子量三个部分，高分子蛋白中明显分出约8个条带，而中、低分子蛋白条带分布不明显。

三个平行细菌样本及每个样本的三个复孔的蛋白质条带分布完全一致，重复电泳三次的谱图基本相同。

用其它3种方法提取的蛋白质电泳结果与方法3相似。

图3. 方法3提取蛋白质电泳图谱123道是细菌样本1；456道是细菌样本2；789道是细菌样本33. 讨论变链菌蛋白质组学为龋病的防治研究提供了一个新的途径和平台[1-9]，其中首要和关键的步骤是细菌总蛋白质的提取[11,13,14]。

细胞裂解是有效提取总蛋白的一个必要步骤，裂解细胞的方法主要有机械和非机械两种方法，非机械方法大多加入一些能降解细胞壁成分的物质，如溶菌酶等[2,6]，这样会引入外源性蛋白，影响后期分析[14]；机械方法克服了这个不足，但通常裂解条件剧烈并耗时[7]。

一般根据研究目的和欲裂解细胞的特性选择裂解方法，变链菌为G+兼性厌氧球菌，细胞壁难以破碎，因此，一般采用较为剧烈的方法裂解该菌，如超声[1-7]、加入氧化铝粉末混合研磨[15]等。

对于细菌裂解效果的评价指标，现有文献中几乎未明确提及。

Thongboonkerd等[12]的研究认为仅通过超声即可使化脓性链球菌达到80％的破碎，但未明确评价细菌破碎程度的指标。

由于细菌经裂解处理后，细胞壁破裂，胞内物质溢出，推测其染色特性和形态可能明显变化，故本研究以在显微镜下直接观察细菌染色涂片的方法来评价细菌的破碎程度。

实验结果显示超声是使细菌破碎的主要因素，在超声基础上辅以加热或反复冻融，并未明显增强细菌的破碎程度。

Svensäter等[9]在变链菌裂解体系中加入直径0.2mm 的玻璃珠并进行超声，该方法成为其课题组进行变链菌蛋白质组系列研究沿用的方法[3]。

本研究在裂解体系中加入直径0.425mm-0.6mm玻璃珠进行超声，发现玻璃珠的加入使超声循环次数大幅度降低，同时超声过程中出现蛋白质碳化现象，而细菌的破碎程度也明显低于其他3种方法，其原因可能是玻璃珠的直径太大。

细菌破碎后释放的蛋白质需充分溶解、稳定保存并可用于2-DE分析。

提取蛋白质所用的裂解缓冲液的成分必须能将所有蛋白质转换成单一构象、防止蛋白质氧化和聚集、使疏水性蛋白质溶解、失活蛋白酶及断裂二硫键和氢键[14]。

在细胞破碎过程释放的蛋白酶导致蛋白质降解，使高分子蛋白丢失并在2-DE谱图中出现修饰蛋白点，增加2-DE结果分析的复杂性，因此，在细胞裂解过程中失活蛋白酶是必要的[13,14]。

在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，在不含脲的SDS缓冲液中煮沸样品[8]，在低pH环境中[13]及直接在强变性剂如脲、TCA或SDS 中裂解样品[14]均可一定程度地抑制蛋白酶，但要完全失活所有的蛋白酶可能是相当困难的[13]。

本研究采用在裂解缓冲液中加入常用的蛋白酶抑制剂苯甲硫酰氟（PMSF）或煮沸样品的方式来失活蛋白酶。

脲和硫脲是破坏氢键和疏水相互作用的常用变性剂，能使蛋白质转变成单一结构、促使疏水性蛋白质特别是膜蛋白溶解并避免蛋白质之间相互作用，因此，绝大多数裂解缓冲液中均包含脲和硫脲[1-7,9,11]。

但脲在37℃以上会分解产生异氰酸盐使蛋白质氨甲酰化而改变其电荷特性[13,14]，因此，采用煮沸方式的裂解缓冲液中不能加入脲或硫脲[8]。

去污剂可阻止疏水蛋白域之间的相互作用，避免由于聚集和沉淀引起蛋白质丢失。

十二烷基磺酸钠（SDS）是最有效的阴离子去污剂之一，但当样本中SDS浓度高于0.2%时，就可能在2-DE谱图中出现竖条纹。