分子机制-蛋白与核酸作用检测-EMSA

主题:凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）

概述:

凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

目的：

1.用于研究特定的转录因子以及转录因子所结合的顺式作用元件；

2.用于研究与蛋白质相结合的DNA序列的特异性；

3.评估突变对探针DNA与结合蛋白相互作用的影响；

4.用于研究DNA-foot printing。

原理：

通常将纯化的蛋白和细胞提取液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

步骤：

使用Pierce生产的试剂盒，按照说明书操作。

1、寡聚核苷酸的标记

(1)冰上融化标记试剂盒所有试剂(TdT除外)；

(2)使用前，用lxTdT reaction buffer稀释TdT贮液，工作浓度为2U/μl；

(3)按下表加入试剂(总体积50μl):

UltraPure water25μl

5xTdT Reaction Buffer10μl

Sample oligo DNA(lμl)5μl(final concentration100nM) Biotin-N4-CTP(5μl)5μl(final concentration0.5μM) Diluted TdT(2U/μl)5μl(final concentration0.2U/μl)

(4)37C°30min；

(5)加2.5μl0.2M EDTA终止反应；

(6)加50μl氯仿:异戊醇(24：1)抽提TdT，剧烈震荡,高速离心，取上层水相；

(7)检测标记效率。

(8)互补连退火，退火后的用于EMSA分析或-20C°冻存。

2、EMSA实验步骤

(1)配制电泳胶：丙烯酰胺的浓度为4-6%，100V电压预电泳；

(2)结合反应

按下列顺序加试剂(总体积20μl):

UltraPure water dependent

10xBinding Buffer2μl

Poly(dIdC)lμl

Unlabeled taget DNA dependent

Protein Extract3-5μg

Biotin End-labeled Tagret lμl(Final concentration20fM/μl) Antibody4μg

(3)电泳

60V电压电泳，溴酚蓝前沿至胶的2/3处停止电泳；

(4)转膜

380mA电流，转膜lh；

(5)检测

a37C°融化Blocking buffer和4xWashing Buffer；

b加Blocking Bueffr，室温轻摇15min；

c制备Conjugate/blocking buffer solution；

d倒出Blocking Buffer，加入Conjugate/blocking buffer solution，室温轻摇15min；

e制备lxWashing Buffer；

f将膜转入一干净的容器，用lxWashing Buffer洗涤4次，每次5min，室温轻摇；

g将膜转入一干净的容器，加substrate Equilibration Buffer，室温轻摇5min；h制备substrate working solution(避光)；

i取出膜，在纸巾上吸去多余液体，放入干净容器，加substrate working solution，放置5min；

j取出膜，在纸巾上吸去多余液体，用保鲜膜包好,不要有褶皱；

k暗室中曝光，照相。

流程图：