植物细胞融合实验
植物组织综合实验报告
植物组织综合实验报告实验背景植物组织是由细胞根据其形态和功能特点而组合形成的。
了解植物组织的结构和功能对于理解植物生长发育过程以及进行植物病理、遗传育种等研究具有重要意义。
本次实验旨在通过对植物组织的观察，研究和分析，了解植物的各种组织结构的特点和功能。
实验材料与方法实验材料：1. 鲜嫩茎尖2. 刚切取的展叶3. 玉米种子和大豆种子4. 10%的乙醇溶液5. 透明盖玻片6. 透明胶带7. 显微镜8. 实验刀片9. 注射器10. 大片的滤纸实验步骤：1. 取适量鲜嫩茎尖，用镊子夹取茎尖，将其放置在切细胞的带有标度的注射器内，加入1 mL的10%乙醇溶液。
2. 断面制片：取部分茎尖，用微型手术刀切成薄片。
3. 用切片液清洗切片：将切好的茎尖片用去离子水清洗3次，每次5分钟。
4. 涂片：用镊子夹住切好的茎尖片，将其沿透明盖玻片边缘滑动式涂布，使之均匀覆盖透明盖片，并保持片子在透明盖片的正中央。
5. 干片：用手轻轻地把透明胶带贴到茎尖上，使片子牢固固定在透明盖片上，避免出现空气的残留。
6. 观察：将制好的干片放到显微镜台上，用低倍镜和高倍镜进行观察。
实验结果与分析茎尖的解剖结构观察在显微镜下，我们观察到茎尖的解剖结构主要由表皮、栅栏细胞、松质细胞、木质部和韧皮部组成。
1. 表皮：茎尖表皮由密集的表皮细胞构成，表皮细胞的外侧上有一层透明的角质层，保护植物内部细胞不受外界环境的影响。
2. 栅栏细胞：栅栏细胞位于表皮细胞下方，通常呈长型，在显微镜下可看到细胞间有空隙，这些空隙被称为栅栏细胞间隙。
3. 松质细胞：松质细胞更靠内部，形状多样，由于含有大量气孔，从松质细胞中可以看到许多气孔。
4. 木质部：木质部由维管束组成，维管束主要由纤维细胞和导管细胞构成。
纤维细胞形似长纤维，排列整齐，而导管细胞则通常呈管状。
5. 韧皮部：韧皮部位于木质部的外部，是茎尖的最外层，主要由具有延伸性的韧皮细胞构成。
通过观察茎尖的解剖结构，我们可以了解植物茎尖的生长方式以及各层组织的功能。
植物细胞融合
结果与分析
活力很低， 活力很低，取 该条件下作为 一个融合亲本
取该条件下作为 一个融合亲本
融合原生质体细胞的分裂
初始培养的1 初始培养的1-2 天, 异核体较易识别。 异核体较易识别。
绿色的霸王原生质体 与红色的草木樨状黄 芪原生质体粘连。 芪原生质体粘连。
UV照射3 UV照射3分钟的霸王原生质体 照射 与经R 6G处理的草木樨状黄 与经R-6G处理的草木樨状黄 芪原生质体融合产物
优点： 优点：可以收集到数量 较大的纯净原生质体， 较大的纯净原生质体， 同时避免收集过程中 原生质体因相互挤压 而破碎。 而破碎。
活力检测
酚藏花红染色法： 酚藏花红染色法： 0.1%酚藏 0.1%酚藏 花红能使有活力的 原生质体染成红色， 原生质体染成红色， 无活力的原生质体 不着色。 不着色。
返回
亲本原生质体的预处理
预 处 理
的 原生质体 的 原生质体
处理
·
处理的
处理
处理
处理的
处理
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原生质体诱导融合
融合比例：大约1:1 融合比例：大约1:1 诱导剂：聚乙二醇(polyethyleneglycol诱导剂：聚乙二醇(polyethyleneglycol(polyethyleneglycol PEG)融合诱导液 PEG)融合诱导液 最终状态： 最终状态：形成杂种小愈伤组织
具体步骤
1.亲本原生质体的分离、收集纯化及活力检测 亲本原生质体的分离、 亲本原生质体的分离 2.亲本原生质体的预处理 2.亲本原生质体的预处理 3.原生质体诱导融合 3.原生质体诱导融合 4.杂种融合细胞的鉴别和筛选 4.杂种融合细胞的鉴别和筛选 5.杂种融合细胞的培养和杂种愈伤组织的形成及分化 5.杂种融合细胞的培养和杂种愈伤组织的形成及分化 6.杂种愈伤组织的RAPD分析和线粒体CAPS分析 杂种愈伤组织的RAPD分析和线粒体CAPS 6.杂种愈伤组织的RAPD分析和线粒体CAPS分析 7.杂种愈伤组织对渗透胁迫的抗性分析 7.杂种愈伤组织对渗透胁迫的抗性分析 8.PEG PEG胁迫下杂种愈伤组织的游离脯氨酸含 8.PEG胁迫下杂种愈伤组织的游离脯氨酸含
诱导原生质体融合方法
诱导原生质体融合方法原生质体融合（Protoplast Fusion）是一种常用的遗传工程技术，用于将两个或多个植物细胞的原生质体融合成一个细胞。
这项技术可以用于基因转移、细胞杂交、基因组互补等研究和应用。
原生质体融合有许多不同的方法和策略。
下面我将介绍几种常用的原生质体融合方法：1. 化学诱导融合：这是最简单的原生质体融合方法之一。
首先，将需要融合的细胞分别处理，使其形成原生质体，然后将两种原生质体混合在一起，并使用一种化学物质（如聚乙二醇）来破坏原生质体的细胞壁。
细胞壁被破坏后，原生质体会相互融合成一个细胞。
这种方法的优点是简单易行，但融合效率较低。
2. 电穿孔融合：这是一种常用的物理诱导原生质体融合方法。
首先，将需要融合的细胞分别处理，使其形成原生质体。
然后，将原生质体置于含有金属离子的融合液中，如含有钙、镁等离子的PBS缓冲液。
使用一个电极将电流加到融合液中的细胞上，从而形成微小的电流孔。
电流孔能使细胞膜短暂地变得透明，原生质体便可以通过这些孔进入另一个细胞，并彼此融合。
3. 高速离心融合：这是一种利用机械力来诱导原生质体融合的方法。
首先，将需要融合的细胞分别处理，使其形成原生质体。
然后，将原生质体置于离心管中，并进行高速离心。
高速离心时，细胞的离心管内壁会形成主要的离心力，使细胞的原生质体被推到细胞的中心。
当离心完毕后，将生成的原生质体集中到一起，并通过重力或离心来诱导其融合。
4. 基因枪融合：这是一种利用基因枪将DNA导入细胞，并诱导细胞融合的方法。
首先，将需要融合的细胞分别处理，使其形成原生质体。
然后，将DNA负载在金属微粒上，并通过气压或爆炸将金属微粒射入细胞质中。
在这个过程中，细胞膜被破坏，使DNA可以进入细胞，并导致细胞融合。
以上是几种常用的原生质体融合方法。
根据实验需要和研究目的，可以选择适合的融合方法。
这些方法都有各自的优缺点，需要根据实际情况进行选择和优化。
原生质体融合方法的发展对于植物基因工程和农业育种具有重要意义，可以提高植物的遗传性状和生产性能，为植物育种和农业发展提供新思路和方法。
植物原生质体培养及细胞融合过程
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
细胞融合实验报告
姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合【实验题目】动物细胞融合【实验目的】1.了解动物细胞融合的常用方法。
2.学习化学融合的基本操作过程。
3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。
【实验材料与用品】1、材料鸡血红细胞2、试剂50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。
3、器材倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。
【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。
目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。
1、病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2、化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG是广泛使用的化学融合剂。
3、电激诱导融合姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
【实验步骤】在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。
植物细胞融合(实验)
A Alignment: Cells are brought into close contact by means of dielectrophor esis.
B Fusion pulse: A squarewave pulse of a mere 15 microseconds is applied in order to permeate the membrane. The membranes then fuse.
细胞在融合过程中发生的主要变化： 细胞在融合过程中发生的主要变化：
呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用 下，细胞膜的性质发生变化。 首先出现 细胞膜的性质发生变化。 细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的 细胞凝集现象； 膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在 膜发生粘连；继而融合形成多核细胞； 培养过程中多核细胞又进行核的融合而成 为单核的杂种细胞， 为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核 的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。 的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。
（2）使用时再加入： 使用时再加入： 纤维素酶 R-10 果胶酶 R-10 0.8% 1%
因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活， 因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活， 故先将酶储液灭菌， 故先将酶储液灭菌，待用时再将酶制剂按 比例加入到第一步已灭菌的酶液内。 比例加入到第一步已灭菌的酶液内。
2）配制CaCl2.2H2O 0.16mol/L 配制CaCl （pH5.8-6.2 用于悬浮原生质体） pH5.8用于悬浮原生质体） 3)PEG液 3)PEG液： 30%（ 30%（w/v) PEG(MW=6000) CaCl2.2H2O kH2PO4 山梨醇 调pH 5.8-6.2 5.80.01mol/L 0.00074mol/L 0.1 mol/L ；用时现配！ 用时现配！
植物细胞融合(实验)
准备仪器
准备适当的显微镜、离心 机、摇床、培养皿等实验 仪器。
分离原生质体
表面消毒
将实验材料表面消毒，以避免污染。
酶解
用适当的酶溶液处理实验材料，使细胞壁分解，释放 出原生质体。
分离
将酶解后的组织用离心机或过滤法分离出生质体。鉴定通过形态学观察、分子生 物学技术或免疫学技术等 方法对融合细胞进行鉴定。
培养与繁殖
将筛选和鉴定合格的融合 细胞进行培养和繁殖，以 备后续实验或应用。
03
植物细胞融合实验结果分 析
融合细胞的筛选结果
1 2
筛选方法
采用抗性筛选和荧光激活细胞分选（FACS）等 方法，从融合细胞群体中筛选出具有稳定融合特 征的细胞。
筛选和培育融合细胞
在融合后的细胞中筛选具有双亲遗传 特征的融合细胞，并进行进一步的培 育和筛选。
克隆和繁殖
对筛选出的融合细胞进行克隆和繁殖， 获得具有特定性状的植物个体。
02
植物细胞融合实验步骤
准备实验材料
01
02
03
选择实验材料
选择健康、无病虫害的植 物组织作为实验材料，如 根、茎、叶等。
准备试剂
植物细胞融合(实验)
目录
• 植物细胞融合实验简介 • 植物细胞融合实验步骤 • 植物细胞融合实验结果分析 • 植物细胞融合实验的应用与展望 • 结论
01
植物细胞融合实验简介
植物细胞融合的定义
01
植物细胞融合是指将来自不同植 物的细胞通过物理或化学方法诱 导融合，形成一个具有双亲遗传 特征的融合细胞的过程。
植物细胞融合技术可以用于新品种的培育和遗传改良，未来可以开展 相关研究，为育种工作提供新的工具和方法。
《植物细胞融合实验》课件
目录
• 植物细胞融合实验概述 • 植物细胞融合实验材料与方法 • 植物细胞融合实验结果与分析 • 植物细胞融合实验结论与展望
01
植物细胞融合实验概胞融合是指将不同植物的 细胞通过物理或化学方法诱导融 合，形成一个具有双亲遗传特征 的融合细胞的过程。
02
植物细胞融合技术是植物生物技 术领域中的一项重要技术，为植 物遗传改良和育种提供了新的途 径。
植物细胞融合的实验目的
创造具有优良性状的转基因植物。 实现植物种质资源的保存和利用。
改良植物的抗逆性、抗病性和抗虫性等。 促进植物基因工程和细胞工程的发展。
植物细胞融合的应用前景
在农业上，植物细胞融合技术可以用于培育抗逆、抗病、 抗虫、优质、高产的转基因植物，提高农作物的产量和品 质，满足人类不断增长的食物需求。
的改良提供了有力支持。
实验结果表明，融合后的植物 细胞表现出更强的分裂和分化 能力，进而形成完整的融合植 株。
植物细胞融合技术在克服远缘 杂种不育、创造新种质资源方 面具有巨大潜力。
研究展望
01
深入研究融合细胞和融合植株的遗传、生理和生化特性，提高融合技 术的效率和成功率。
02
拓展植物细胞融合技术在农业、林业和其他领域的应用，为解决全球 资源短缺和环境问题提供更多解决方案。
培养基
用于培养融合后的细胞。
实验设备与试剂
显微镜
观察细胞融合过程。
离心机
分离和洗涤细胞。
恒温培养箱
培养融合后的细胞。
实验方法与步骤
准备实验材料
选择适当的植物细胞、酶和培养 基。
酶解处理
将植物细胞放入含有酶的溶液中 ，使其细胞壁分解。
植物体细胞融合技术
2.1．1植物细胞工程的基本技术--------植物体细胞融合技术学习目标1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。
2、尝试进行植物组织培养。
学习重点1、植物组织培养的原理和过程2、植物体细胞杂交的原理一、 植物体细胞杂交技术1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。
2．过程 不同的植物体细胞果胶酶纤维素酶−−−→−不同细胞原生质体−−−→−人工诱导原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。
3．植物体细胞杂交步骤：(1)去掉细胞壁，分离出有活力的 ，目前最常用的去细胞壁的方法是酶解法，也就是在温和条件下用 、 去除植物细胞的细胞壁。
(2)不同植物体细胞原生质体融合，必须通过 法和 法来诱导融合。
方法有： 等促使原生质体融合。
化学法是用(PEG)作为诱导剂来诱导融合。
融合后再生出 。
(3)用植物组织培养方法进行培育，可得到杂种植株。
如图在此过程中需要注意的问题有：①植物体细胞杂交过程中，植物体细胞融合所依据的生物学原理是 ；植物组织培养的理论基础是 。
②体细胞融合成功以后，既有AB 型杂种细胞，还能形成AA 型和BB 型两种融合细胞，但只有AB 型细胞是植物体细胞杂交所形成的杂种细胞，因此在杂种细胞形成后还应有一个 过程。
③目前常用的去除细胞壁的方法是 ，保证了原生质体活性。
植物体细胞融合完成的标志是新细胞壁的形成。
④植物体细胞杂交过程仍以植物组织培养为前提，通过植物组织培养完成杂种植株的培育过程。
⑤植物体细胞杂交的最大突破是克服远缘杂交不亲和的障碍，但是目前仍有许多理论和技术问题没有解决，离推广应用仍有一定距离。
【当堂检测】 1．不能．．用于人工诱导原生质体融合的方法是 （ ） A ．振动 B ．电刺激 C ．PEG D ．重压 2．与传统的有性杂交法相比，植物体细胞杂交的最大优点是 （ ） A ．可使两个亲本的优良性状组合到一起 B ．可以克服远缘杂交不亲和的障碍 C ．可以培育出高产性状明显的新品种 D ．可以降低生成成本，提高接济效益3．植物体细胞杂交的过程实质是 （ ）A ．细胞质融合的过程B ．细胞核融合的过程C ．细胞膜融合的过程D ．细胞原生质体融合的过程 4．原生质体融合后，需诱导产生细胞壁，参与此过程的细胞器是 （ ） A ．叶绿体、高尔基体 B ．线粒体、高尔基体 C ．叶绿体、线粒体 D ．线粒体、内质网 5．高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误．．的是 （ ）A ．该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的B ．该愈伤组织的细胞没有全能性C ．该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞D ．该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构 6．以下不能．．说明细胞具有全能性的实验是 （ ） A ．胡萝卜韧皮部细胞培育出植株 B ．紫色糯性玉米种子培育出植株 C ．转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株 D ．番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株7．植物组织培养过程中的脱分化是指 （ ）A ．植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞B ．未成熟的种子经过长期培养，培养出幼苗的过程C ．植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程D ．取植物的枝芽培育成一株新植物的过程8．在脱分化形成愈伤组织的过程中，下列各项为非．必要条件的是（）A．培养基需要消毒灭菌B．给予适宜的温度C．给予充足的光照D．给予适宜的养料和激素9．通过植物体细胞杂交，获得一个杂种植株需要的步骤是（）A．分离原生质体→诱导原生质体融合→组织培养→得到杂种植物B．分离原生质体→原生质体直接融合→组织培养→杂种植株C．获取细胞→原生质体融合→组织培养→杂种植株D．获取细胞→原生质体直接融合→组织培养→杂种植株10．胚状体是在植物组织培养的哪一阶段上获得的（）A．愈伤组织B．再分化C．形成完整植株D．取离体组织11．利用植物的茎尖、茎段、花药、花粉等，在无菌的条件下，放在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使它发育成完整的植株。
促进植物细胞融合的方法
促进植物细胞融合的方法
植物细胞融合是一种常见的细胞生物学研究方法，可以用于探究细胞间的互作关系、基因转移和杂交育种等领域。
为了提高植物细胞融合的效率和成功率，可以采取以下方法：
1. 电融合法：利用高压电场作用于两个植物细胞，使其膜发生短暂的孔洞，从而实现细胞融合。
2. 化学融合法：在生长培养基中加入一定浓度的聚乙二醇（PEG）等化合物，使细胞膜发生变化，促进细胞融合。
3. 真核融合法：通过感染植物细胞的病毒或利用光合细菌等微生物直接注入细胞，使其发生真核融合。
4. 基因工程法：利用基因编辑技术对植物细胞进行基因改造，增强细胞融合的能力和效率。
以上方法均有其优缺点，具体选择应根据实验需要和研究对象进行选择。
- 1 -。
自己做得植物体细胞杂交
植 物 细 胞 融 合
原生质体A
原生质体B 原生质体融合 正在融合的 原生质体
筛选
再生出细胞壁 植物体细胞融合完成的标志 细胞分裂
杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
植物组织培养
植物体细胞杂交的过程
植物细胞A
去 壁
原生质体A 原生质体B
去 壁
融合的 原生质 诱 体AB
导
杂种 细胞 脱 再 AB 分
生 出 细 胞 壁
结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重 组，从而使细胞发生融合，形成杂种细胞。
人工诱 导原生 化学法：聚乙二醇（PEG） 质体融 物理法：离心、振动、电刺激等 合方法：
﹜
电激法使生质体融合
请思考：
•3．两个原生质体能发生 融合与细胞膜的什么特 性有关？
植物体细胞杂交的过程
思考：原生质体的融合是哪一部 分的融合？这实现了什么？
植物细胞去掉细胞壁叫什么名字 呢
原生质体的概念：除去细 胞壁的植物细胞叫做原 生质体。
材料1：经漫长的进化过程，有性杂交中精子与卵 细胞能够自然发生融合形成受精卵，而体细胞的原 生质体不能自然发生融合，因而需要人工诱导迫使 二者融合。
思考：原生质体如何融合在一起呢？
材料2：聚乙二醇（PEG)分子能改变各类细胞的生物膜
针对训练：若番茄体细胞中染色体组 成为AA，马铃薯体细胞中染色体组 成为BB，则杂种细胞中染色体组成 是怎样的？
植物体细胞杂交的过程
思考：假设原生质体两两融合， 培养基中会出现什么类型的细胞？ 都是我们所需要的吗？
请思考：我如何知道 原生质体融合了呢 •4．两个来源不同的原生 质体发生了融合成功的 标志是什么？
植物体细胞杂交的概念
植物原生质体的制备及融合
显微镜、低速台式离心机、水浴锅；直式漏斗、离心管；眼科镊等
▪ 试剂
洗涤液 混合酶液 PEG溶液 高钙高pH溶液 20%蔗糖溶液等
原生质体的分离制备
▪ 取新鲜花瓣，以蒸馏水清洗，用吸水纸吸干多余水分。 ▪ 用尖头镊剥取材料的下表皮（带有红色的叶肉细胞），将
下表皮创面朝下浸在酶液中，27℃酶解1hr（振荡）。
▪ 所用小平皿、离心管、漏斗、小镊子等自来水 冲洗并以蒸馏水洗干净后，控干
▪ 托盘及其中的其他物品用自来水冲洗干净
▪ 实验中
植物原生质体的 制备及融合
背景
▪ 原生质体分离 ▪ 细胞融合
▪ 病毒诱导融合（动物细胞） ▪ PEG诱导融合 ▪ 电融合
背景
▪ 融合过程
▪ 细胞的接触 ▪ 细胞质膜的融合 ▪ 细胞质的融合 ▪ 遗传物质的选择（异核体的核融合）
应用
▪ 杂交育种
▪ 单克隆抗体技术
实验器材、试剂等
▪ 材料
剑兰（唐菖蒲）花瓣
原生质体的分离制备
镜检，0 μm
50 μm
原生质体的分离制备
▪ 过滤，以去除大块组织。 ▪ 700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入3mL洗涤液吹打均匀，700rpm离心5分钟，弃上清。 ▪ 加入少量洗涤液（一两百微升即可或由原生质体的量来决
定），悬浮原生质体。 ▪ 镜检，如果碎片较多，可采取蔗糖漂浮方法去除碎片。
▪ 比较分析实验组与对照组之间的差异及 原因
▪ 思考：原生质体制备和融合过程中各种 试剂的渗透压？
提醒
▪ 蔗糖漂浮
▪ 务必留下足够进行融合的细胞悬液 ▪ 使用5ml离心管 ▪ 配平
▪ 35mm dish用于酶解，60mm dish用于融合观察
植物体细胞杂交利用的原理
植物体细胞杂交利用的原理植物体细胞杂交，听上去有点复杂，但其实挺有趣的。
这就像是在为植物“相亲”，把两种不同的植物细胞放在一起，看能不能结合出个更牛的品种。
想象一下，如果把西瓜和哈密瓜的基因结合在一起，结果会不会出现一个超甜的“西哈瓜”？有点儿意思吧？这其中的原理其实是利用植物细胞的能力，把两种不同的细胞结合在一起，形成一个新的细胞。
这就像是把两种美味的食材混在一起，可能会产生意想不到的美味。
怎么做到这一点呢？科学家们会用一些特定的技术，像是使用药剂或者激素，来促进细胞融合。
就像是给植物“喝酒”，让它们放松心情，更容易在一起。
哈哈，听起来是不是有点搞笑？不过，确实就是这么回事。
细胞之间的相互作用很重要，它们要能够“聊得来”，才能成功结合在一起。
如果没有这种“化学反应”，再好的细胞也没办法成功结合。
细胞结合后，形成的细胞就有了新的基因组。
这时候就像是给植物换了一身新衣服，变得焕然一新。
这种新生的细胞可能会表现出之前两种植物都没有的特性。
比如说，它可能长得更快，或者能抵抗某种病虫害，甚至能开出特别的花。
这就像是超能力一样，真是让人兴奋！想要实现这一点可不是那么容易，科研人员需要花费大量的时间和精力去探索和实验。
听说，植物体细胞杂交还有一个有趣的地方，就是它可以打破传统的繁殖方式。
以前我们觉得植物只能通过种子繁殖，但现在通过细胞杂交，可以创造出全新的植物。
这种方法为农业带来了新的希望，尤其是在面对气候变化和食品安全问题时。
科学家们可以根据市场的需求，定制出合适的作物，让大家吃得更健康，生活得更好。
想想看，未来的农田里可能会有各种神奇的植物在生长，真让人期待。
不过，科学发展到今天，也有不少争议。
有人担心这种杂交会对生态环境产生负面影响，或者对人类健康造成威胁。
这种声音不无道理，毕竟新事物总会带来一些未知的风险。
可是，科学的进步往往需要勇于尝试和探索。
只要做好科学的研究和监管，植物体细胞杂交带来的好处应该是大于风险的。
植物细胞融合(实验)
a.调整融合仪参数,电击使 原生质体融合
b.PEG法使原生质体融合
2021/3/15
倒置显微镜观察并照相
27
实验步骤:
1.取酶储液10ml,分别加入纤维素酶和果胶酶 0.08g,0.1g,制备酶液。
2.取材:烟草、洋葱根尖各0.7g
取洋葱根尖,并将其切成0.5cm长短大小放入小 平皿中;取烟草叶片将其剪成0.5cm2 大小放入小 平皿中。
在众多的化学试剂中,PEG应用最为
广泛,因PEG液比病毒更易制备和控制、
活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合
的能力更强。PEG是一种多聚化合物。
2021/3/15
7
PEG诱导原生质体融合的机理: 带有大量负电荷的PEG与水之间的氢
键结合,使溶液中自由水消失,由于高度脱 水引起原生质体凝集,形成大小程度不同的 凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭曲变 形,邻近原生质体之间紧密接触。
2021/3/15
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3.仪器 1）大型仪器:
高压灭菌锅,超净工作台,离心机,倒置显微镜, 电融合仪。
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2）一般实验用品 大小培养皿,小烧杯,小滴管,刻度离心管,
小漏斗,不锈钢网300目
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五.实验步骤
实验路线:
烟草叶肉及洋葱根尖 原生质体酶解分离
提纯原生质体并调 整原生质体密度
3.酶解:将酶液等量加入到存有实验材料的平皿中, 放入250c培养箱酶解。洋葱约4h,烟草约3h。
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4.观察酶解效果
5.原生质体的分离和纯化
1）酶解后,用300目铜网过滤酶液,去除未酶解的 杂质,将滤液收集在10ml离心管中。
动植物细胞融合（cellfusion）技术
动植物细胞融合（cell fusion）技术红色皇后为什么会有眨着小眼睛的豌豆？还有卖萌傲娇的猫香蒲又是从哪里来的？泳池突然冒出的海藻僵尸三人组，是不是缠绕海藻把僵尸拉到水里的结果？在虚构中寻找现实的人不一定脑子就有问题，因为现实比科幻小说更奇妙。
确实有一些科学家热衷于制造各种各样的动植物合体，细胞融合（cell fusion）技术就是其中最具黑科技风味的一种。
界不同，肿么谈恋爱？细胞融合顾名思义，就是让本来茕茕孑立的细胞合为一体。
有各式各样的工具和手段，鼓励细胞“在一起”。
比如聚乙二醇（polythyleneg-glycol），这种化学物质能让包裹在外的细胞膜分子散开，细胞膜本身就像液体一样会流动，两个细胞就像两滴水般融为一体。
再或者仙台病毒（Sendai virus），它的外壳里的成分，可以促使动物细胞凝集起来，大家像坐公交一样挤到一起，导致“日久生情”。
细胞并不像身体这样排斥异己，科学家可以尽情尝试过各种黑暗的组合。
在上个世纪七十与八十年代，大豆与大麦，人与蚊子，鸡与酵母，中国仓鼠与烟草，植物与变形虫，人与胡萝卜，这些组合都被尝试过。
一项1976年的胡萝卜和人类细胞融合实验尤为猎奇，因为他们用的是海拉细胞系（HeLa cell line）。
海拉细胞系在科学界可谓大名鼎鼎，它们采自一位美国妇女的子宫颈癌组织，“主人”已于1951年死去，癌细胞却一直欣欣向荣地分裂，在需要人类活细胞的各种实验中做出贡献。
王晋康还为它们写过一篇科幻小说《癌人》。
胡萝卜细胞与人类癌细胞的融合，细胞被染成不同的颜色，深黑色的是人类细胞，浅灰色的是胡萝卜细胞D Dudits et al. Fusion of human cells with carrot protoplasts induced by polyethylene glycol. Hereditas(1976) 82:122.在这个实验中，半海拉细胞半胡萝卜细胞的怪物存活了超过72小时，像胡萝卜一样长出了细胞壁（植物细胞裹着坚硬的“墙壁”，无法融合，所以在实验之前，必须用能分解细胞壁的酶把它剥掉），有些分别来自人类和胡萝卜的细胞核融合在一起。
促进植物细胞融合的方法
促进植物细胞融合的方法植物细胞融合是指将两个或多个植物细胞融合为一个细胞，从而产生新的植物体。
植物细胞融合在植物育种和基因工程研究中具有重要的应用价值。
本文将介绍几种常用的促进植物细胞融合的方法。
1. 电融合法电融合法是一种常用的促进植物细胞融合的方法。
该方法利用高压电脉冲破坏细胞膜，使细胞间质融合。
首先，将待融合的两个植物细胞放置在含有融合缓冲液的培养基中，然后将电极插入培养基中，施加高压电脉冲。
电脉冲的作用下，细胞膜发生孔洞，使细胞间质相互融合。
融合后的细胞可以通过培养和筛选得到植株。
2. 化学融合法化学融合法是另一种常用的促进植物细胞融合的方法。
该方法利用化学物质破坏细胞膜，使细胞间质融合。
常用的化学物质包括聚乙二醇（PEG）和多价阳离子。
首先，在含有融合缓冲液的培养基中，将待融合的两个植物细胞共同处理。
化学物质会破坏细胞膜，使细胞融合。
融合后的细胞可以通过培养和筛选得到植株。
3. 基因转化融合法基因转化融合法是一种利用基因工程技术促进植物细胞融合的方法。
该方法利用载体将外源基因导入植物细胞中，从而改变细胞的性状和功能。
首先，将待融合的两个植物细胞分别转化为含有不同标记基因的转基因细胞。
然后，将转基因细胞进行融合，通过筛选和培养得到融合后的细胞。
基因转化融合法可以用于改良植物的性状，并在基因工程研究中发挥重要作用。
4. 培养基条件优化培养基条件的优化对促进植物细胞融合也起到重要的作用。
合适的培养基成分、培养基pH值、温度和光照条件等都会影响细胞融合的效率和成功率。
例如，增加融合缓冲液的浓度可以提高电融合和化学融合的效果；调节培养基pH值可以改变细胞膜的稳定性；适宜的温度和光照条件可以促进细胞的生长和分裂。
因此，对培养基条件的优化可以提高植物细胞融合的成功率。
总结起来，电融合法、化学融合法、基因转化融合法和培养基条件优化是促进植物细胞融合的常用方法。
这些方法在植物育种和基因工程研究中具有广泛的应用前景。