植物细胞工程实验修改版

植物细胞工程实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。

当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。

二、实验器材电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。

三、实验药品NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。

四、实验步骤每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制表1 MS 培养基大量元素母液制备序号 药品名称培养基浓度（mg/L ）扩大20称量(mg)备注1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml2 KNO3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 44004 MgSO 4·7H 2O 370 37005 KH 2PO 41701700各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。

后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。

到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。

配制培养基时，每配1L 培养基取此液50ml 。

注意：①配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca 2+、SO 42一、Mg 2十和H 2PO 4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。

为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的双蒸水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量双蒸水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。

特别应将Ca 2+、SO 42一、Mg 2十和H 2PO 4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。

②CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。

另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。

２、微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。

微量元素用量较少，特别是CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O。

按照表2配方，用称感量为0.0001g的电子天平称量，其它同大量元素。

配制培养基时，每配制1 L培养基，取微量母液5ml。

表2 MS培养基微量元素母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1 MnSO4·4H2O 22.3 22302 ZnSO4·7H2O 8.6 8603 H3BO3 6.2 6204 KI 0.84 845 Na2MoO4·2H2O 0.25 256 CuSO4·5H2O 0.025 2.57 CoCl2·6H2O 0.025 2.5注意：使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。

3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。

目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。

这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。

配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。

配制培养基时，配制1L取此液5ml。

表3 MS铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1 Na2-EDTA 37.3 37302 FeSO4·7H2O 27.8 2780注意：在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。

为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA 应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。

4、有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。

培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。

配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子天平。

注意：由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。

被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。

避免此现象发生的方法是：配制母液时用无菌双蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。

表4 MS培养基有机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1 甘氨酸2 2002 肌醇100 100003 盐酸硫胺素(V B1) 0.1 104 盐酸吡哆素(V B6) 0.5 505 烟酸0.5 505、激素母液配制植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。

一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：①配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。

②细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。

③配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。

注意：所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。

五、思考题：1、配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl2·2H2O时，为什么要将蒸馏水加热？2、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。

培养基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。

表5 按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表实验二培养基的配制与灭菌一、实验目的与意义学习培养基配制与灭菌的操作方法。

对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。

不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。

另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控，次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。

培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。

二、实验器材电子天平、烧杯（1000ml）、医用搪瓷量杯（1000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。

三、实验药品蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、HCl、各种培养基母液。

四、实验步骤（一）、培养基配制（以1L MS培养基为例）1、计量根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000 ml/母液浓度（mg/L）。

2、移液取1000ml瓷杯一只，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷缸中备用。

注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。

②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。

③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错；④移液管不能混用。

3、称取称取7g琼脂，30g蔗糖备用4、融化用搪瓷杯量取600的蒸馏水放在电炉上，煮沸，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加水定容至800ml,加入蔗糖，定容至1000ml，煮沸。

注意：加琼脂的时候要边加入边搅拌，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。

此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。

但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。

5、调pH用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右，所以我们调PH值时一般要求培养基常温PH值在5.8-6.3之间，我们可以适当上调至6.3-6.4，以确保培养基的凝固)。

注意：调配时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。

7、分装溶化的培养基应该趁热分装。

分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml或100 ml)中。

注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。

锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。

每1L培养基，可分装25～30瓶。

8、包扎用封口膜封口，扎好绳子，用记号笔做好标记注意：培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。

避免此现象发生的方法是:调整培养基pH值，一般不低于5.6，若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量，。

（二）培养基的灭菌培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。

而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。

因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。

常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。

1、高压蒸汽灭菌法把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。

盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。

加热后，锅上压力表指针开始移动，当指针移至0.5kg/cm2时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。

当指针移至1.1～1.2kg/cm2时，即121℃时，维持一定的时间。