端粒酶逆转录酶在皮肤肿瘤原位表达水平的比较

端粒酶逆转录酶在皮肤肿瘤原位表达水平的比较丁颖果,武玲慎,涂平 [摘　要]　目的　研究端粒酶在皮肤恶性肿瘤发病机制中的作用。

方法　采用人端粒酶逆转录酶(h TERT)cRNA 探针与石蜡标本进行原位杂交的方法检测30例皮肤基底细胞癌、15例皮肤鳞状细胞癌、19例脂溢性角化、14例正常皮肤中h TERTmRNA的表达水平,并进行比较。

结果　h TERT阳性率基底细胞癌为73.35%(22/30),鳞状细胞癌为80.00%(12/15),均明显高于脂溢性角化36.84%(7/19)和正常皮肤28.57%(4/14),并具有统计学意义。

结论　h TERT 在恶性皮肤肿瘤中的阳性表达率明显高于良性肿瘤和正常皮肤,提示端粒酶在皮肤恶性肿瘤发病机制中起着重要作用。

原位杂交检测h TERT表达水平的方法有可能成为鉴别皮肤良恶性肿瘤的辅助检查手段。

[关键词]　皮肤肿瘤;端粒酶;端粒酶逆转录酶,人;原位杂交[中图分类号]　R739.15 [文献标识码]　A [文章编号]　1001-7089(2004)01-0008-03In Situ H ybridization Analysis of the Expression of H uman T elomerase R everse T ranscriptase(hTERT)in Skin TumorsDIN G Y ing2guo,WU Ling2shen,TU Ping(Depart ment of Derm atology,Peking U niversity First Hospital,Beijing100034,China)Abstract:　Objective　To study the role of telomerase in the pathogenesis of malignant skin tumors.Methods　Digoxiginin2 labled h TERT cRNA probe was applied to in situ hybridize to mRNA of h TERT in paraffin2embedded sections of30cases of basal cell carcinoma,15cases of squamous cell carcinoma,19cases of seborrheic keratosis and15cases of normal skin.R esults　In 22of30cases of basal cell carcinoma sam ples and12of15cases of squamous cell carcinoma samples,h TERT was expressed at a higher level than that of seborrheic keratosis sam ples(7positives of19)and normal skin samples(4positives of14).Conclusion　Telomerase may play an important role in the pathogenesis of malignant skin tumors.h TERT may be used as a marker for the dif2 ferentiation between malignant and benign skin tumors.K ey w ords:　skin tumor;Telomerase;Human telomerase reverse transcri ptase(h TERT);In situ hybridization 近年来研究表明,端粒酶的活性表达对细胞增殖、衰老、细胞的永生化以及肿瘤的发生、发展有重要意义。

能否将端粒酶作为恶性肿瘤的诊断指标和治疗靶点是当前倍受关注的热点。

本实验采用原位杂交方法检测皮肤基底细胞癌、鳞状细胞癌、脂溢性角化中端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, h TER T)表达水平并进行比较,以探讨端粒酶在恶性皮肤肿瘤发病机制中的作用,并对原位杂交法检测h TER T表达水平可否作为诊断皮肤恶性肿瘤的辅助检查手段进行了尝试。

1　材料和方法1.1　标本来源　所有患者均为1999年1月～2002年3月在本科就诊并经活体组织病理检查确诊者,其中基底细胞癌患者30例,年龄25～82岁,平均65.3岁,女16例,男14例;皮肤鳞状细胞癌患者15例,年　[作者单位]　北京大学第一医院皮肤性病科,北京　100034　[作者简介]　丁颖果(1976-),女,浙江省缙云县人,在读博士研究生,主要从事皮肤肿瘤和遗传性皮肤病研究。

龄为40～75岁,平均62.4岁,女8例,男7例;脂溢性角化19例,年龄40～74岁,平均61.1岁,女10例,男9例。

14例正常皮肤取自2001年11月～2002年8月外科手术切除的包皮,经病理检查为正常皮肤,患者年龄16～38岁,平均26.1岁。

所有标本均经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋。

1.2　主要试剂和方法　地高辛标记h TER T2cRNA 探针原位杂交试剂盒由北京大学医学部病理系张波教授提供;实验中所有载物片均用APES防脱片处理,石蜡切片厚4μm;原位杂交操作步骤按试剂盒说明书进行,最后用NB T/BCIP显色,蛋白甘油封片观察结果。

1.3　对照标本　已知端粒酶表达阳性的肝癌组织标本随试剂盒提供作为阳性对照;14例正常皮肤作为阴性对照;不加探针的基底细胞癌、脂溢性角化、鳞状细胞癌和正常皮肤标本各1例作为空白对照。

1.4　结果判断　①阳性信号为细胞质出现蓝紫色着色颗粒;②以典型高倍视野计数阳性细胞数占总细胞数的比例进行半定量染色强度分级:阴性(-),细胞均不显色或背景深,染色不清晰;弱阳性(+),<25%的肿瘤细胞显色;中度阳性(2+),25%～50%的肿瘤细胞显色;强阳性(3+),>50%的肿瘤细胞显色。

1.5　统计学处理　用SPSS 软件进行χ2检验,P 值<0.05为显著性标准。

2　结果2.1　皮肤基底细胞癌、鳞状细胞癌、脂溢性角化和正常皮肤h TER T 表达情况　见表1。

h TER T 阳性表达信号分布在肿瘤细胞的胞质中(见图1,2,3)。

作为阴性对照的大部分正常皮肤标本(10/14)未见h TER T 阳性表达,但是有小部分标本(4/14)可以在基底层到颗粒层的表皮细胞胞质中检出h TER T 散在表达。

作为空白对照的未加探针的基底细细胞癌、鳞状细胞癌、脂溢性角化和正常皮肤标本中均无细胞染色及背景染色。

图1　皮肤基底细胞癌h TERT 原位 图2　皮肤鳞状细胞癌h TERT 原位 图3　皮肤脂溢性角化h TERT 原位表达×100 表达×100 表达×100表1　原位杂交检测基底细胞癌、鳞状细胞癌、脂溢性角化和正常皮肤中h TERT 表达结果　例(%)组别例数染色强度3+2++-合计基底细胞癌30868822(73.33)鳞状细胞癌15462312(80.00)脂溢性角化19115127(36.84)正常皮肤14112104(28.57)2.2　统计学结果　皮肤基底细胞癌和鳞状细胞癌之间的阳性表达率差异无显著性(χ2=0.015,P =0.902);但皮肤基底细胞癌和鳞状细胞癌与脂溢性角化阳性表达率比较差异有显著性(分别为χ2=6.412,P =0.011和χ2=6.333,P =0.012),与正常皮肤的阳性表达率比较差异亦有显著性(分别为χ2=7.912,P =0.005和χ2=7.744,P =0.005);脂溢性角化与正常皮肤的阳性表达率比较差异无显著(χ2=0.016,P =0.901)。

3　讨论端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构,其功能与染色体的保护、定位和复制等有关。

端粒的长度被认为是细胞计数其分裂次数的“分裂时钟”,与细胞的分裂能力息息相关。

端粒酶可以合成端粒的重复序列并连接到染色体末端,从而维持端粒的长度[1,2]。

目前已明确人端粒酶由三个亚单位组成:端粒酶RNA ,端粒酶相关蛋白和h TER T 。

其中h TER T 是端粒酶活性的限速决定因子[3]。

正常体细胞在出生后不久即不再表达端粒酶,但在人体的永生细胞及肿瘤细胞中可有端粒酶激活并使端粒延长,以有效防止细胞老化及死亡。

肿瘤细胞株的这种特性提示,端粒酶的激活或重新表达可能是细胞或肿瘤细胞生长和永生所必须。

因此,许多人认为测定端粒酶活性有助于了解细胞的生长与增殖,并且可作为诊断肿瘤的潜在辅助性指标[2～4]。

检测端粒酶活性有许多方法,目前较常用的是建立在PCR 基础上的TRAP 及其各种改良法[5]。

Wu A 等用反转录PCR 方法分别测定了皮肤肿瘤中端粒酶三个组分的水平,并与TRAP 法测定的端粒酶活性水平作了比较,发现h TER T 的表达水平才是反映端粒酶活性最好的指标[6]。

但是建立在PCR 基础上的各种方法均需要用新鲜组织作为标本,而原位杂交方法可以用于存档石蜡标本的检测,并可以进行端粒酶细胞定位[7]。

本实验用原位杂交法检测皮肤肿瘤中h TER T mRNA 的表达水平,发现30例皮肤基底细胞癌中,22例呈阳性,阳性率为73.33%;15例皮肤鳞状细胞癌中,12例呈阳性,阳性率为80.00%;19例脂溢性角化中,7例呈阳性,阳性率为36.84%;14例正常皮肤中,4例呈阳性,阳性率为28.57%。

而在未加探针的皮肤基底细胞癌、鳞状细胞癌、脂溢性角化及正常皮肤中,均未显示阳性染色,也无背景染色,提供了可靠的空白对照,说明实验结果可信。

比较各肿瘤间的阳性表达率发现,皮肤基底细胞癌和鳞状细胞癌之间的阳性表达率差异无显著性(P=0.902),但是两者与脂溢性角化及正常皮肤的阳性表达率之间均有差异(P均< 0.05),证实了h TER T在恶性皮肤肿瘤细胞中有明显的表达,说明端粒酶在恶性肿瘤的发生发展中有重要的意义。

原位杂交法测定h TER T可用于测定存档标本,进行细胞定位,方法较简单。

h TER T表达水平的原位杂交方法有可能作为鉴别诊断皮肤良恶性肿瘤的辅助检查手段。

本实验中发现有小部分作为阴性对照的正常皮肤中也能检测到h TER T的表达,表达率与脂溢性角化比较差异无显著性。

虽然两者的阳性表达率较恶性肿瘤低得多,但是近几年的文献报道均说明在良性增生性皮肤肿瘤以及正常皮肤中存在着端粒酶的活性表达[3～5]。